CN106834257A - 一种分离胎盘间充质干细胞混合酶及其分离方法 - Google Patents

Abstract

一种分离胎盘间充质干细胞混合酶及其分离方法，本发明涉及使用一种自配的混合型酶的方法和应用配置的该酶从胎盘底蜕膜中分离胎盘间充干细胞的方法。根据实验验证结果，对不同类型的胶原酶分别进行不同浓度的配置，0.22um滤器过滤除菌，37℃预热。胎盘经过清洗处理后，剥离底蜕膜，分别进行消毒和清洗，剪碎至约0.1cm3大小组织，将配置好的一定浓度的混合型酶按照与组织体积2.5‑3：1的比例添加，消化，清洗，过滤，离心，最终获取细胞进行培养。本发明的混合型酶的高效分离方法，适用于胎盘干细胞库构建中细胞的分离方法，操作步骤简单，收获细胞数量多，活率高，细胞培养周期较短，为未来胎盘干细胞储存等制备提供基础。

Description

一种分离胎盘间充质干细胞混合酶及其分离方法

技术领域

本发明涉及一种应用于胎盘干细胞分离的方法。

背景技术

人类胎盘是由胎儿组织与母体组织共同构成的器官，是宝宝赖以生存的各种营养物质输送的纽带，由滋养细胞及大量起源于外中胚胚层的间充质和血管共同组成，提示胎盘中存在MSC，并现已证实。胎盘组织学结构分为羊膜、绒毛膜和底蜕膜三部分构成。胎盘中有许多种类的干细胞，其中胎盘中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)数量最多。MSCs是一类能够自我更新，具有多向分化能力的多能干细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪、神经和肝细胞等组织细胞，并表达特异性标志，同时具有来源方便、含量丰富、无伦理学限制等优点，因此更易应用于临床。

胎盘MSCs能抑制免疫和促进造血重建的特性，使其在造血干细胞移植及移植后GVHD防治方面具有良好的应用前景。通过对绒毛层和底蜕膜MSCs的免疫标记检测，发现它们均阳性表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，阴性表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31。而底蜕膜作为母-胎界面的组成部分之一，为母体面，意味着来源于底蜕膜的MSCs可作为母亲来源的干细胞的一种。

MSCs本身的生物学特性和独特的免疫调控功能在组织工程、细胞治疗等方面具有广泛的临床应用前景。同时，胎盘MSCs的优势还在于来源广泛，胎儿娩出后，胎盘就失去作用，只要正常分娩的健康产妇知情同意，都能够提供胎盘。与骨髓捐献相比，供者无痛苦，污染机会少。

近年来MSCs已成为干细胞领域的研究热点，它不仅支持造血系统，而且还可向中胚层和外胚层来源的组织分化，在特定的培养条件下可分化为骨、脂肪、软骨、肌肉及内皮等组织细胞。MSCs具有体外抑制淋巴细胞增殖、体内延长皮肤移植物存活的独特免疫学特点，在长期存活于异基因环境中具有优势，同时MSCs具有自我更新的能力。胎盘来源的MSCs易分离培养，增殖迅速，可以分化为3个胚层来源的细胞系，并有向伤处迁移的能力。与捐献骨髓或采集动员外周血相比，胎盘供者无痛苦，感染机会少。已有临床给白血病患者输注人白细胞抗原单倍型相合的父母骨髓MSCs获得成功的病例。

胎盘干细胞的分离方法为组织块法和酶解法两种方法，组织块法在培养细胞过程中，由于每次换液的影响，贴壁较慢，细胞爬出慢，细胞生长周期较长，容易导致细胞老化现象，而酶硝化法则能够获取细胞的数量多，而且细胞生长周期较短，短时间能够获取足够的细胞。

胶原酶在生理条件下主要水解结蹄组织中胶原蛋白成分，胶原酶仅对细胞间质有消化作用，对上皮细胞影响不大,适用于消化分离纤维性组织，上皮组织和癌组织等，胶原酶根据不同功能分为I，II，III，IV，V共五种类型，只有根据所分离消化组织的种类来选择胶原酶类型，由于本研究是对胎盘组织进行消化，根据所选组织种类的不同，本研究选用I，II，IV，V四种类型酶进行相关实验研究。目前胎盘干细胞的获取大多使用某种单一胶原酶，但使用某种单一型号的胶原酶存在消化的不够彻底，过度消化，需要较多组织才能获取一定量的细胞等问题，本发明使用的自配混合型酶能够在保证细胞活率的同时，消化的比较彻底，细胞贴壁率较高。

发明内容

本发明的目的是为了提高胶原酶分离胎盘组织干细胞的消化效率以及细胞获取数量及细胞活率，而提供一种分离胎盘间充质干细胞混合酶及其分离方法。

本发明的一种分离胎盘间充质干细胞混合酶，它是按照体积比为1：0.5～1.5：0.5～1.5：1.5～2.5的比例将胶原酶I，II，IV，V混和而成；所述的胶原酶I，II，IV，V的质量百分比浓度分别为0.5～0.8％，0.5～1.5％，0.5～0.8％和0.5～1.5％。

本发明的一种用混合酶分离胎盘间充质干细胞的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、将权利要求1制得的混合酶37℃预热；

二、将待处理组织剪碎，按体积比为1:2.5～3的比例将混合酶与剪碎后的组织混合均匀；

三、置于37～38℃恒温摇床摇30～40min后，终止消化，过滤，离心；

四、获取组织干细胞，接种于CO₂培养箱内培养；

五、培养36h后，在无菌操作条件下将上清倒入离心管内，在转速为1300rpm的条件下离心6min，收集沉淀，即完成所述的用混合酶分离胎盘间充质干细胞。

本发明将胶原酶I，II，IV和V按照不同浓度进行配置后按照一定比例进行混合配置，用于分离胎盘组织干细胞，对组织消化彻底，组织内细胞不受影响，保证组织细胞的活性，对细胞表面抗原不受影响，细胞增殖能力较强，操作方法简单，比市面上单一出售的胶原酶消化效率高，能够获取更多的组织干细胞。获取胎盘干细胞免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。

本发明包含以下有益效果：

由于单一的胶原酶消化的蛋白酶种类比较局限，部分蛋白酶不能够完全分解，容易过度消化，将不同胶原酶按照不同比例混合后能够充分分解多种蛋白酶；

由多种不同胶原酶混合后的混合型胶原酶消化后的组织消化的比较彻底，获取的组织细胞数量较多，活率较高，高达99％以上，显著高于其它各组；

培养后的胎盘干细胞表型表达符合干细胞的特性，细胞增殖功能，分化功能及细胞形态均较好；

培养后的胎盘组织干细胞具有分化功能，能够完全分化为成骨、成脂等细胞，保护了干细胞的分化功能；

由于混合型酶消化的较彻底，因此，很少组织即可获取更多高活性的细胞；

通过计算细胞贴壁率发现，混合型酶消化分离胎盘干细胞后，原代细胞贴壁率达98％以上,显著高于每种单独酶消化的细胞贴壁率；

通过检测胎盘干细胞增值功能，通过生长曲线计数发现P5代细胞与P3代细胞的增值功能未见显著差异(p＞0.05)。

附图说明

图1为P0代细胞培养(4x)后的胎盘干细胞培养形态学观察；

图2为P1代细胞培养(4x)后的胎盘干细胞培养形态学观察；

图3为P3代细胞培养(4x)后的胎盘干细胞培养形态学观察；

图4为P5代细胞培养(4x)后的胎盘干细胞培养形态学观察；

图5为胎盘干细胞P3,P5代生长曲线测定图；其中，A为P3代生长曲线，B为P5代生长曲线；

图6为P3代胎盘干细胞成骨分化(10X)结果观察；

图7为P3代胎盘干细胞成骨分化(10X)结果观察；

图8为P3代胎盘干细胞成脂分化(10X)结果观察；

图9为P5代胎盘干细胞成脂分化(10X)结果观察。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种分离胎盘间充质干细胞混合酶，它是按照体积比为1：0.5～1.5：0.5～1.5：1.5～2.5的比例将胶原酶I，II，IV，V混和而成；所述的胶原酶I，II，IV，V的质量百分比浓度分别为0.5～0.8％，0.5～1.5％，0.5～0.8％和0.5～1.5％。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一相同的是：它是按照体积比为1：1：1：2的比例将胶原酶I，II，IV，V混和而成；所述的胶原酶I，II，IV，V的质量百分比浓度分别为0.5％，1％，0.5％和1％。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一相同的是：所述的高效分离胎盘间充质干细胞混合酶过0.22um滤器过滤除菌，-20℃下无菌保存。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式一种用混合酶分离胎盘间充质干细胞的方法，它是按照

以下步骤进行的：

一、将权利要求1制得的混合酶37℃预热；

二、将待处理组织剪碎，按体积比为1:2.5～3的比例将混合酶与剪碎后的组织混合均匀；

三、置于37～38℃恒温摇床摇30～40min后，终止消化，过滤，离心；

四、获取组织干细胞，接种于CO₂培养箱内培养；

五、培养36h后，在无菌操作条件下将上清倒入离心管内，在转速为1300rpm的条件下离心6min，收集沉淀，即完成所述的用混合酶分离胎盘间充质干细胞。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：混合酶与剪碎后的组织混合比例为1:2.7。其它与具体实施方式四相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

本实施例的一种分离胎盘间充质干细胞混合酶，它是按照体积比为1：1：1：2的比例将胶原酶I，II，IV和V混和而成；所述的胶原酶I，II，IV和V的质量百分比浓度分别为0.5％，1％，0.5％和1％。

本实施例的一种用混合酶分离胎盘间充质干细胞的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、将上述制得的混合酶37℃预热；

二、将待处理组织剪碎，按体积比为1:2的比例将混合酶与剪碎后的组织混合均匀；

三、置于37℃恒温摇床摇30min后，终止消化，过滤，离心；

四、获取组织干细胞，接种于CO₂培养箱内培养；

五、培养36h后，在无菌操作条件下将上清倒入离心管内，在转速为1300rpm的条件下离心6min，收集沉淀，即完成所述的用混合酶分离胎盘间充质干细胞；

六、向倾倒上清后的培养瓶内补充11ml含(bFGF和EGF因子)DMEM╱F12继续培养；

七、对收集的沉淀，计算沉淀细胞数(未贴壁，漂浮的细胞)，根据接种的细胞数和离心沉淀的细胞数计算细胞贴壁率。

结果如表1所示。

表1不同酶使用对比研究结果

注：贴壁率＝(贴壁细胞╱接种细胞总数)*100％

由上表可知，单一的某种酶消化后的细胞活率，贴壁率显著低于混合型酶消化后的细胞活率和贴壁率，推断由于单一酶消化的蛋白种类较为单一，消化不彻底，若想获取更多的细胞数量，则容易导致过度消化，细胞活率和贴壁率均降低。但多种不同胶原酶混合后消化组织则比较彻底，能够分解多种蛋白，获取的组织细胞数量较多，活率高达99％以上，显著高于其它组。通过计算细胞贴壁率发现，混合型酶消化分离胎盘干细胞后，原代细胞贴壁率达98％以上。

通过细胞形态学观察，使用混合型酶消化后细胞形态均较好，涡旋状，长梭形；通过生长曲线检测发现细胞增殖能力较强，在2.5d-6.5d为对数生长期；通过流式细胞仪检测混合型酶消化后获取细胞的表面标记，发现表达率均符合间充质干细胞的特性；通过检测细胞的成骨和成脂分化能力，发现使用混合型酶消化后的细胞均能够分化为成骨细胞和成脂细胞。

Claims (5)

1.一种分离胎盘间充质干细胞混合酶，其特征在于它是按照体积比为1：0.5～1.5：0.5～1.5：1.5～2.5的比例将胶原酶I，II，IV，V混和而成；所述的胶原酶I，II，IV，V的质量百分比浓度分别为0.5～0.8％、0.5～1.5％、0.5～0.8％和0.5～1.5％。

2.根据权利要求1所述的一种分离胎盘间充质干细胞混合酶，其特征在于它是按照体积比为1：1：1：2的比例将胶原酶I，II，IV，V混和而成；所述的胶原酶I，II，IV，V的质量百分比浓度分别为0.5％、1％、0.5％和1％。

3.根据权利要求1所述的一种分离胎盘间充质干细胞混合酶，其特征在于所述的高效分离胎盘间充质干细胞混合酶过0.22um滤器过滤除菌，-20℃下无菌保存。

4.一种用混合酶分离胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、将权利要求1制得的混合酶37℃预热；

二、将待处理组织剪碎，按体积比为1:2.5～3的比例将混合酶与剪碎后的组织混合均匀；

三、置于37～38℃恒温摇床摇30～40min后，终止消化，过滤，离心；

四、获取组织干细胞，接种于CO₂培养箱内培养；

五、培养36h后，在无菌操作条件下将上清倒入离心管内，在转速为1300rpm的条件下离心6min，收集沉淀，即完成所述的用混合酶分离胎盘间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的一种用混合酶分离胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于混合酶与剪碎后的组织混合比例为1:2.7。