CN105505865A - 一种脐带间充质干细胞的分离方法 - Google Patents

一种脐带间充质干细胞的分离方法 Download PDF

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楼敏铭
王宏伟
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Abstract

本发明涉及脐带间充质干细胞分离方法，简单操作易行，与传统爬片法相比较，细胞贴壁时间短，4-5天即可贴壁，8-10天可传代，得到大量富有活性的间充质干细胞，缩短了原代细胞的培养时间，与传统消化法相比较，接种细胞数量更多，1根脐带可接种10瓶以上T75培养瓶，原代即可收集大量细胞，传代一次可获得20倍细胞数量，生产效率高，适合大量收集低代数干细胞及规模化生产。

Description

一种脐带间充质干细胞的分离方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要应用于贴壁细胞的分离培养，特别是脐带间充质干细胞的分离方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是一类特殊的干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，在分类上属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，MSC可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，因其具有多向分化潜能的特性，在临床中可广泛用于多种疾病治疗比如肝纤维化、神经损伤、脑瘫、心肌梗死等诸多疑难病症，MSC不表达主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原，且不表达或低表达多种移植免疫排斥相关的共刺激因子，如CD80、CD40、CD46、CD40L，是一类免疫缺陷细胞，所以在免疫疾病方面有非常大的治疗优势，可用于移植物抗宿主病(GVHD)，类风湿、红斑狼疮、多发性硬化病等免疫缺陷病，单纯hUC-MSC条件培养基具有造血支持功能,并促进CD34+细胞向髓系分化，所以在血液疾病方面MSC具有很好的治疗前景，MSC是目前干细胞研究的热点之一。
MSC最初在骨髓中发现，后来经过大量深入的研究，发现MSC广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞纯度高、数量多，且脐带的取材方便，不存在伦理问题。
脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，外覆羊膜，内含静脉、脐动脉和来自中胚层的胶样粘液性结缔组织即沃顿氏胶。大量研究证实脐带沃顿氏胶中富含丰富的间充质干细胞。
当前对脐带间充质干细胞的分离方法很多，目前主要的分离方法是利用胶原酶消化法和组织块爬片法分离脐带间充质干细胞，两种方法都存在一定的弊端。1.消化法因为脐带的个体差异以及不可能充分进行消化，原代得到的细胞数量太少，一根脐带消化后只能得到3-5×105个细胞。消化法分离脐带间充质干细胞，存在分离时间长，成本高的问题。2.爬片法虽然不使用胶原酶可以降低成本，但是细胞爬出时间过长，一般14-15天才可有少量细胞爬出，影响实验的研究进度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞的分离方法，本方法操作步骤简单易行，提高工作效率。本方法生产间充质干细胞克服爬片法细胞贴壁时间过长的缺点，克服消化法收集细胞量少的缺点，得到细胞纯度高，生长周期短，可以很快进行传代。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种脐带间充质干细胞分离方法，方法由下列步骤组成
⑴取足月产健康胎儿脐带，用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；
⑵将脐带的1条静脉和2条动脉血管用器械钝性分离出来，保留沃顿氏胶；
⑶将沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；
⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm3以下的组织块；
⑸向烧杯中加入等体积的PBS，浸没组织块；
⑹将获得的脐带组织块连同PBS通过孔径为10目孔的网筛，用无菌烧杯收集网筛下的脐带组织块，离心弃上清；
⑺将离心后的组织块移入血浆瓶中，加入5倍体积的胶原酶与胰蛋白酶的混合物，37℃水浴10-15min，转子搅拌；
⑻向血浆瓶中加入1ml血清终止胰蛋白酶消化作用，将组织块与消化液收集到离心管中离心，离心后收集组织块及细胞混合物；
⑼将组织块及细胞混合物转移至无菌培养瓶中，按照0.5-1.5块/cm2的密度接种，根据收集组织块数量接种数个培养瓶；
⑽向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO2静置培养；
⑾4-5天后换液，以后每2天全量换液一次，8-10天后细胞成簇生长，融合度可达到80％；
⑿用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化；
⒀收集终止后的消化液，1000rpm,5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞。
而且，所述的步骤(4)中将脐带机械剪碎的工具为剪刀。
而且，所述的步骤(7)中胶原酶与胰蛋白酶的混合比例为1.5:1，胶原酶为Ⅱ型胶原酶，浓度为0.2％，胰蛋白酶的浓度为0.25％。
而且，所述的步骤(9)中无菌培养瓶为75cm2培养瓶。
而且，所述的步骤(10)中加入血清与DMEM/F12培养基的比例是1:10。
本发明的有益效果是：
1、本发明的脐带间充质干细胞制备方法，简单操作易行，与传统爬片法相比较，细胞贴壁时间短，4-5天即可贴壁，8-10天可传代，得到大量富有活性的间充质干细胞,缩短了原代细胞的培养时间。与传统消化法相比较，接种细胞数量更多，1根脐带可接种10瓶以上T75培养瓶，原代即可收集大量细胞，传代一次可获得20倍细胞数量，生产效率高，适合大量收集低代数干细胞及规模化生产。
2、本方法生产间充质干细胞克服消化法收集细胞量少的缺点，原代可接种大量细胞，适合规模化生产。
3、本发明使用少量胶原酶，降低购买胶原酶的成本，且最大限度的保持了干细胞原有的生物特性和活性，细胞生长速度快，连续传代仍能维持细胞活性，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。
附图说明
图1为原代细胞培养3天后细胞形态图；
图2为原代细胞培养5天后细胞形态图；
图3为原代细胞培养8天后细胞形态图；
图4为细胞经检测；图4-1为CD73，图4-2为CD90，图4-3位CD105，经过检测，三种均为阳性；
图5为细胞经检测；图5-1为CD14,图5-2为CD34,图5-3为CD45,图5-4为HLA-DR均为阴性，该方法得到的细胞经检测为间充质干细胞。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明提供一种脐带间充质干细胞分离方法，该方法由下列步骤组成：
1.取足月产健康胎儿脐带，用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；
2.将脐带的1条静脉和2条动脉血管用器械钝性分离出来，保留沃顿氏胶；
3.将沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；
4.将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm3以下的组织块；将脐带机械剪碎的工具为剪刀；
5.向烧杯中加入等体积的PBS，浸没组织块；
6.将获得的脐带组织块连同PBS通过孔径为10目孔的网筛，用无菌烧杯收集网筛下的脐带组织块，离心弃上清；
7.将离心后的组织块移入血浆瓶中，加入5倍体积的胶原酶与胰蛋白酶的混合物，37℃水浴10-15min，转子搅拌；胶原酶与胰蛋白酶的混合比例为1.5:1，胶原酶为Ⅱ型胶原酶，浓度为0.2％，胰蛋白酶的浓度为0.25％；
8.向血浆瓶中加入1ml血清终止胰蛋白酶消化作用，将组织块与消化液收集到离心管中离心，离心后收集组织块及细胞混合物；
9.将组织块及细胞混合物转移至无菌培养瓶中，按照0.5-1.5块/cm2的密度接种，根据收集组织块数量接种数个培养瓶；无菌培养瓶为75cm2培养瓶；
10.向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO2静置培养；加入血清与DMEM/F12培养基的比例是1:10；
11.4-5天后换液，以后每2天全量换液一次，8-10天后细胞融合度可达到80％；
12.用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化；
13.收集终止后的消化液，1000rpm,5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞。

Claims (5)

1.一种脐带间充质干细胞分离方法，其特征在于：方法由下列步骤组成：
⑴取足月产健康胎儿脐带，用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；
⑵将脐带的1条静脉和2条动脉血管用器械钝性分离出来，保留沃顿氏胶；
⑶将沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；
⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm3以下的组织块；
⑸向烧杯中加入等体积的PBS，浸没组织块；
⑹将获得的脐带组织块连同PBS通过孔径为10目孔的网筛，用无菌烧杯收集网筛下的脐带组织块，离心弃上清；
⑺将离心后的组织块移入血浆瓶中，加入5倍体积的胶原酶与胰蛋白酶的混合物，37℃水浴10-15min，转子搅拌；
⑻向血浆瓶中加入1ml血清终止胰蛋白酶消化作用，将组织块与消化液收集到离心管中离心，离心后得到组织块及细胞混合物；
⑼将组织块及细胞混合物转移至无菌培养瓶中，按照0.5-1.5块/cm2的密度接种，根据收集组织块数量接种数个培养瓶；
⑽向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO2静置培养；
⑾4-5天后换液，以后每2天全量换液一次，8-10天后细胞成簇生长，融合度可达到80％；
⑿用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化；
⒀收集终止后的消化液，1000rpm,5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离方法，其特征在于：所述的步骤(4)中将脐带机械剪碎的工具为剪刀。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离方法，其特征在于：所述的步骤(7)中胶原酶与胰蛋白酶的混合比例为1.5:1，胶原酶为Ⅱ型胶原酶，浓度为0.2％，胰蛋白酶的浓度为0.25％。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离方法，其特征在于：所述的步骤(9)中无菌培养瓶为75cm2培养瓶。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离方法，其特征在于：所述的步骤(10)中加入血清与DMEM/F12培养基的比例是1:10。
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