CN104630141A - 一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法 - Google Patents

Abstract

一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法，它涉及一种制备干细胞库的方法及细胞复苏方法。本发明步骤如下：将牙齿的髓腔打开，经胰酶替代物半消化法对牙髓组织进行原代培养，经过传代培养即获得牙髓间充质干细胞，将制备的牙髓间充质干细胞进行生物特性检测，扩大培养，冻存，建立牙髓干细胞库。本发明采用了胰酶替代物半消化法对牙髓组织进行消化，这与传统的消化法不同，胰酶替代物价格便宜容易购买，半消化法有效防止了细胞的丢失，提高了细胞的冻存数量。本发明采用了牙齿作为制备间充质干细胞的组织材料来源，为储存牙间充质干细胞提供了机会。

Description

一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法

技术领域

本发明涉及一种制备干细胞库的方法及细胞复苏方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，在一定条件下可分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是一种高度未分化的细胞，它具有发育的全能型，能分化出成体动物所有的组织和器官，包括生殖细胞。成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成该类型组织的细胞。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。这种干细胞在特定的诱导条件下，可分化为成骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冻存后仍具有多向分化潜能。无论是自体还是异体移植间充质干细胞，一般不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性，使其在自身免疫疾病以及各种替代治疗能方面具有广阔的临床前景，通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可以避免免疫排斥反应。

目前，已经从骨髓、脐带、脐血、胎盘、脂肪等组织中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但是骨髓来源的间充质干细胞存在着细胞采集困难、对人体伤害大、有年龄限制等问题。脐血、脐带、胎盘组织中分离出的间充质干细胞，不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且具有更强的增殖、分化能力，采集时对身体无伤害，但是其组织材料的收集只能一次完成，局限于生产是的一瞬间，错过时机将无法挽回。牙髓间充质干细胞具有间充质干细胞的所有生物学特点，而且牙齿的样本有着丰富的来源：小孩自然脱落的乳牙，成人需要拔除的智齿、阻生牙、多生牙等都可分离制备出牙髓间充质干细胞；并且不存在着对身体的伤害、无伦理争议。

现有牙髓间充质干细胞的制备方法主要有两种，一种是组织块法，另一种是胶原酶消化法。用组织块法培养细胞培养周期长、获得细胞数量少；用胶原酶消化法培养细胞数量少、组织块消化不完全、制备费用高。本发明专利则与以上两种方法不同，本发明专利采用胰酶替代物半消化法制备细胞，有效提高了细胞的制备量，防止了细胞的丢失，节约了制备成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足之处，提供一种牙髓在制备间充质干细胞过程中的制备培养方法，该制备培养方法采用胰酶替代物半消化法半消化组织块，使组织疏松细胞更容易爬出，而且避免了细胞过滤时组织块、细胞的丢失，并且胰酶替代物的价格比胶原酶要便宜，大大降低了成本。

本发明实现目的的技术方案是：将牙齿髓腔打开，胰酶替代物半消化法对牙髓组织进行原代培养，经过传代培养即获得牙髓间充质干细胞，将制备的牙髓间充质干细胞进行生物特性检测，扩大培养，冻存，建立牙髓间充质干细胞库。

本发明的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、胰酶替代物半消化处理：

1)将牙髓从髓腔中取出，经过无菌处理后，将牙髓切割成小块；

2)将上述切块后的牙髓放入无菌EP管中，再向EP管中加入胰酶替代物，然后将放入含有组织块和胰酶替代物的EP管放入37℃培养箱中消化15～20min，每隔5分钟振摇EP管；

二、牙髓组织原代培养：

3)将步骤二消化后的牙髓组织块加入到间充质干细胞完全培养基，充分吹打混匀，得牙髓组织块悬液；

4)将步骤3)的牙髓组织块悬液接种到6孔培养板中，置于37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养10～15d；

三、传代培养：

5)吸出步骤二中培养后的培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

6)采用间充质干细胞完全培养基将步骤5)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的细胞悬液重新接种在培养板中，放入37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养；

四、扩大培养：

7)吸出步骤三中培养后的6孔培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物，放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

8)采用间充质干细胞完全培养基将步骤7)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的 细胞悬液重新接种在6孔培养板中；

9)重复步骤7)至8)操作；

五、保存： 

10)收集步骤四扩大培养后的牙髓间充质干细胞，然后采用生理盐水清洗牙髓间充质干细胞，吸出生理盐水，加入500μl的胰酶替代物，后放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；消化结束后，采用间充质干细胞完全培养基冲洗培养板，将细胞全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心；离心结束后，弃去上清液，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，将细胞浓度调整至2×10⁶/mL；

11)细胞冻存悬液的配制

向间充质干细胞完全培养基中加入DMSO，二者加入的体积比为间充质干细胞完全培养基：DMSO＝4:1，充分混匀，放入4℃冰箱预冷20min，得牙髓间充质干细胞悬液，将细胞冻存液等比例加入牙髓间充质干细胞悬液中，边加边晃动离心管，使冻存液充分混匀；

12)细胞冻存

将步骤11)的细胞冻存悬液分装到冻存管中，每管加1mL细胞冻存悬液，将冻存管放入程序降温盒中，以1℃/min的速度降至-80℃，24小时之后，将冻存的细胞放入-196℃的液氮中长期保存。

本发明的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓干细的复苏方法，它是按照以下步骤进行的：

取步骤六保存的细胞，放入37℃水浴锅中将细胞融化；按照体积比为1:10的比例向细胞融化液中加入间充质干细胞完全培养基，然互离心，去上清，将沉淀用间充质干细胞完全培养基重悬，接种在培养瓶中，置于37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养5～7天，即可获得所培养的牙髓间充质干细胞。

本发明的有益效果为：

1)本发明采用了牙髓作为制备间充质干细胞的组织材料，这与骨髓、脐带、脐血、胎盘不同，采集方式为自然脱落或手术拔除的乳牙、智齿、多生牙、阻生牙。牙髓间充质干细胞具有和脐带、脐血、胎盘组织中分离出的间充质干细胞相同的特点，同时又不必拘泥于时间的限制，及时错过也可有机会挽回。

2)本发明对牙髓组织块采用半消化法对组织块进行消化，这与以往的消化法和组织块法培养法不同不同。消化法需用胶原酶将组织块消化成单细胞，剩余组织块过滤丢弃； 组织块法需将组织块剪成小块，待细胞爬出。消化法使用的胶原酶价格昂贵、过滤时细胞损失量大；组织块法培养的细胞生长周期较长，组织块贴壁速度较慢，细胞爬出量少。本发明结合两种方法取长补短，用胰酶将组织块消化疏松，使细胞容易爬出，又不完全消化成单个细胞，避免了细胞的丢失。

3)本发明致力于建立牙髓间充质干细胞库，采集不同人、不同年龄、不同位置的牙齿制备牙髓间充质干细胞，使其能大规模培养生产，维持干细胞的扩增能力，为临床应用提供足够数量的干细胞和分化衍生细胞。

附图说明

图1为实施例的牙髓间充质干细胞半消化法消化后接种培养图，即牙髓组织块图；

图2为实施例的牙髓间充质干细胞原代培养细胞图；

图3为实施例的牙髓间充质干细胞传代培养细胞散在单个细胞图；

图4为实施例的牙髓间充质干细胞传代后生长密度80％以上的细胞图；

图5为实施例的牙髓间充质干细胞生长曲线检测图；

图6为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(LgG1-FITC)检测图；

图7为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(CD14-FITC)检测图；

图8为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(HLA-DR-FITC)检测图；

图9为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(CD45-FITC)检测图；

图10为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(LgG1-PE)检测图；

图11为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(CD79s-PE)检测图；

图12为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(CD34-PE)检测图；

图13为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(LgG1-FITC)检测图；

图14为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(CD90-FITC)检测图；

图15为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(LgG1-PE)检测图；

图16为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(CD73-PE)检测图；

图17为实施例的牙髓间充质干细胞表面抗原(CD105-PE)检测图；

图18为实施例的牙髓间充质干细胞细胞周期检测图；

图19为实施例的牙髓间充质干细胞细胞克隆检测图；

图20为实施例的牙髓间充质干细胞细胞软骨分化能力检测图；

图21为实施例的牙髓间充质干细胞细胞成骨分化能力检测图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞 库的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、胰酶替代物半消化处理：

1)将牙髓从髓腔中取出，经过无菌处理后，将牙髓切割成小块；

2)将上述切块后的牙髓放入无菌EP管中，再向EP管中加入胰酶替代物，然后将放入含有组织块和胰酶替代物的EP管放入37℃培养箱中消化15～20min，每隔5分钟振摇EP管；

二、牙髓组织原代培养：

3)将步骤二消化后的牙髓组织块加入到间充质干细胞完全培养基，充分吹打混匀，得牙髓组织块悬液；

4)将步骤3)的牙髓组织块悬液接种到6孔培养板中，置于37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养10～15d；

三、传代培养：

5)吸出步骤二中培养后的培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

6)采用间充质干细胞完全培养基将步骤5)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的细胞悬液重新接种在培养板中，放入37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养；

四、扩大培养：

7)吸出步骤三中培养后的6孔培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物，放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

8)采用间充质干细胞完全培养基将步骤7)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的细胞悬液重新接种在6孔培养板中；

9)重复步骤7)至8)操作；

五、保存： 

10)收集步骤四扩大培养后的牙髓间充质干细胞，然后采用生理盐水清洗牙髓间充质干细胞，吸出生理盐水，加入500μl的胰酶替代物，后放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；消化结束后，采用间充质干细胞完全培养基冲洗培养板，将细胞全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心；离心结束后，弃去上清液，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，将细胞浓度调整至2×10⁶/mL；

11)细胞冻存悬液的配制

向间充质干细胞完全培养基中加入DMSO，二者加入的体积比为间充质干细胞完全培养基：DMSO＝4:1，充分混匀，放入4℃冰箱预冷20min，得牙髓间充质干细胞悬液，将细胞冻存液等比例加入牙髓间充质干细胞悬液中，边加边晃动离心管，使冻存液充分混匀；

12)细胞冻存

将步骤11)的细胞冻存悬液分装到冻存管中，每管加1mL细胞冻存悬液，将冻存管放入程序降温盒中，以1℃/min的速度降至-80℃，24小时之后，将冻存的细胞放入-196℃的液氮中长期保存。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：胰酶替代物为重组酶，不含动物源成分，4℃保存即可，成分稳定。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：间充质干细胞完全培养基的组份为：DMEM/F12基础培养基+10％FBS+1％谷氨酰胺。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：胰酶替代物的加入量为浸过细胞即可。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：在步骤三传代培养后，进行生物特性检测，然后再进行扩大培养，所述的生物特性检测具体操作如下：

一、将步骤三传代培养后的细胞配制成细胞密度1×10⁴/mL的细胞悬液，将细胞接种在24孔培养板中，每孔接种0.5mL细胞悬液，每天用胰酶替代物消化3个孔，计数，绘制细胞生长曲线及计算细胞倍增时间；

二、将步骤三传代培养后的细胞用生理盐水重悬，计数，将细胞密度调整至1×10⁵/mL，将细胞分为7管，每管为1mL细胞悬液，对细胞分别进行7种抗体标记，对细胞进行流式检测细胞表面抗原；其中，7种抗体为CD14、CD45、CD79、CD34、CD90、CD73和CD105；

三、将步骤三传代培养后的细胞用生理盐水重悬，计数，将细胞密度调整至1×10⁶/mL，用PI标记细胞，对细胞进行流式检测细胞周期；

四、将步骤三传代培养后的细胞配制成细胞密度1×10⁴/mL的细胞悬液，将600个细胞悬在8mL间充质完全培养基中，接种在10cm培养皿中，培养14天，龙胆紫染色，计细胞克隆形成率；

五、将步骤三传代培养后的细胞配制成细胞密度1×10⁴/mL的细胞悬液，将细胞接种 在24孔培养板中，待细胞张至80～90％密度，分别更换成成骨、成软骨分化培养基，培养14天，分别用茜红素S、阿利新蓝染液对细胞进行染色，若细胞分化成功，则骨细胞将被茜红素S染成红色，软骨细胞将被阿利新蓝染成蓝色，即完成检测。

其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓干细的复苏方法，它是按照以下步骤进行的：

从牙髓间充质干细胞库中取保存的细胞，放入37℃水浴锅中将细胞融化；按照体积比为1:10的比例向细胞融化液中加入间充质干细胞完全培养基，然互离心，去上清，将沉淀用间充质干细胞完全培养基重悬，接种在培养瓶中，置于37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养5～7天，即可获得所培养的牙髓间充质干细胞。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，步骤如下：将牙齿髓腔打开，胰酶替代物半消化法对牙髓组织进行原代培养，经过传代培养即获得牙髓间充质干细胞，将制备的牙髓间充质干细胞进行生物特性检测，扩大培养，冻存，建立牙髓间充质干细胞库。

所述的牙齿髓腔打开方法为：

1)将打开髓腔的手术器械经过高压灭菌处理，将牙齿表面经过无菌处理。

2)将牙齿放在培养皿中，用牙骨凿用力敲击牙齿，使牙齿纵切面切开两半。

所述的胰酶替代物半消化法方法为：

3)将牙髓从髓腔中取出，经过无菌处理，将牙髓物理切割成小块。

4)用镊子将组织块加入EP管中，加入胰酶替代物对牙髓组织进行消化。

5)将步骤4)中的含有组织块和胰酶替代物的EP管放入37℃培养箱中消化15-20min，每个几分钟要摇晃EP管，使消化充分。

所述的牙髓组织原代培养方法为：

6)将消化后的组织块加入间充质干细胞完全培养基，充分吹打混匀。

7)将步骤6)的组织块悬液接种到培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

8)培养10-15天即可观察到有牙髓间充质干细胞长出。

所述的传代培养方法为：

9)吸出培养板中的培养基，加入生理盐水清洗一下，吸出生理盐水，加入胰酶替代物消化细胞。

10)将步骤1)的培养板放入37℃培养箱中进行细胞消化3min。

11)消化结束后，加入间充质干细胞完全培养基冲洗培养板，将细胞全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心。

12)离心结束后，弃去上清液，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞，将细胞悬液重新接种在培养板中，放入培养箱中培养。

所述的生物特性检测方法为：

13)收集细胞，调整细胞悬液浓度，将细胞接种在培养板中，每天消化计数，绘制细胞生长曲线及计算细胞倍增时间。

14)收集细胞，用生理盐水重悬细胞，对细胞进行CD14、CD45、CD79、CD34、CD90、CD73、CD105标记，对细胞进行流式检测细胞表面抗原。

15)收集细胞，用PI标记细胞，对细胞进行流式检测细胞周期。

16)收集细胞，调整细胞悬液密度，将细胞接种在培养板中，培养14天，龙胆紫染色，计细胞克隆形成率。

17)收集细胞，调整细胞悬液密度，将细胞接种在培养板中，更换分化培养基，培养14天，染色，确定细胞分化能力。

所述的扩大培养方法为：

18)吸出培养板中的培养基，加入生理盐水清洗一下，吸出生理盐水，加入胰酶替代物消化细胞。

19)将步骤18)的培养板放入37℃培养箱中进行细胞消化3min。

20)消化结束后，加入间充质干细胞完全培养基冲洗培养板，将细胞全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心。

21)离心结束后，弃去上清液，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞，将细胞悬液重新接种在培养皿中，放入培养箱中培养。

22)待细胞长满后，在重复18)至21)步骤，将细胞接种在更大的培养瓶中，继续传代培养，使细胞数量扩增。

所述的保存方法为：

23)收集需要冻存的细胞

吸出培养瓶中的培养基，加入生理盐水清洗一下，吸出生理盐水，加入胰酶替代物消 化细胞，37℃培养箱中进行细胞消化3min。消化结束后，加入间充质干细胞完全培养基冲洗培养板，将细胞全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心。离心结束后，弃去上清液，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，将细胞浓度调整至2×10⁶/ml。

24)细胞冻存悬液的配制

向完全培养基中加入20％的DMSO，充分混匀，放入4℃冰箱预冷20min，将细胞冻存液等比例缓慢的加入所需冻存的细胞悬液中，边加边晃动离心管，使冻存液充分混匀。

25)细胞冻存

将步骤24)的细胞冻存悬液分装到冻存管中，每管加1ml细胞冻存悬液。将冻存管放入程序降温盒中，以1℃/min的速度降至-80℃，24小时之后，将冻存的细胞放入-196℃的液氮中，即可长期保存。

所述的细胞复苏方法为：

26)取出上述保存的细胞，立即放入37℃水浴锅中将细胞融化。

27)按照1:10的比例向细胞融化液中加入9ml间充质干细胞完全培养基，离心。

28)去上清，将细胞用间充质干细胞完全培养基重悬，接种在培养瓶中，置于培养箱中培养5-7天，即可获得所培养的细胞。

所述的建立牙髓间充质干细胞库的方法为：

29)培养出牙髓间充质干细胞后，将每代次的牙髓间充质干细胞都冻存，直至冻存到P5代。

30)采集不同人、不同年龄、不同位置的牙齿制备牙髓间充质干细胞。

本实施例的胰酶替代物是购买得到的，胰酶替代物品牌：gibco、货号：12605-010。

本实施例的牙髓间充质干细胞半消化法消化后接种培养图如图1所示，牙髓间充质干细胞原代培养细胞图如图2所示，牙髓间充质干细胞传代培养细胞散在单个细胞图如图3所示，牙髓间充质干细胞传代后生长密度80％以上的细胞图如图4所示，牙髓间充质干细胞生长曲线检测图如图5所示，牙髓间充质干细胞表面抗原检测图如图6所示，牙髓间充质干细胞细胞周期检测图如图7所示，牙髓间充质干细胞细胞克隆检测图如图8所示，牙髓间充质干细胞细胞软骨分化能力检测图如图9所示，牙髓间充质干细胞细胞成骨分化能力检测图如图10所示。

由上述附图可以得出用此方法培养的牙髓间充质干细胞的细胞均一性良好、细胞生物学特性完全，用此方法构建牙髓间充质干细胞库可行的结论。

Claims (6)

1.一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、胰酶替代物半消化处理：

1)将牙髓从髓腔中取出，经过无菌处理后，将牙髓切割成小块；

2)将上述切块后的牙髓放入无菌EP管中，再向EP管中加入胰酶替代物，然后将放入含有组织块和胰酶替代物的EP管放入37℃培养箱中消化15～20min，每隔5分钟振摇EP管；

二、牙髓组织原代培养：

3)将步骤二消化后的牙髓组织块加入到间充质干细胞完全培养基，充分吹打混匀，得牙髓组织块悬液；

4)将步骤3)的牙髓组织块悬液接种到6孔培养板中，置于37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养10～15d；

三、传代培养：

5)吸出步骤二中培养后的培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

6)采用间充质干细胞完全培养基将步骤5)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的细胞悬液重新接种在培养板中，放入37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养；

四、扩大培养：

7)吸出步骤三中培养后的6孔培养板中的培养基，然后采用生理盐水清洗牙髓组织，吸出生理盐水，加入胰酶替代物，放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；

8)采用间充质干细胞完全培养基将步骤7)消化后的牙髓组织块从培养板中全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心，收集沉淀，用间充质干细胞完全培养基重悬，将重悬后的细胞悬液重新接种在6孔培养板中；

9)重复步骤7)至8)操作；

五、保存：

10)收集步骤四扩大培养后的牙髓间充质干细胞，然后采用生理盐水清洗牙髓间充质干细胞，吸出生理盐水，加入500μl的胰酶替代物，后放入37℃培养箱中进行细胞消化3min；消化结束后，采用间充质干细胞完全培养基冲洗培养板，将细胞全部冲洗下来，收集细胞悬液，离心；离心结束后，弃去上清液，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，将细胞浓度调整至2×10⁶/mL；

11)细胞冻存悬液的配制

向间充质干细胞完全培养基中加入DMSO，二者加入的体积比为间充质干细胞完全培养基：DMSO＝4:1，充分混匀，放入4℃冰箱预冷20min，得牙髓间充质干细胞悬液，将细胞冻存液等比例加入牙髓间充质干细胞悬液中，边加边晃动离心管，使冻存液充分混匀；

12)细胞冻存

将步骤11)的细胞冻存悬液分装到冻存管中，每管加1mL细胞冻存悬液，将冻存管放入程序降温盒中，以1℃/min的速度降至-80℃，24小时之后，将冻存的细胞放入-196℃的液氮中长期保存。

2.根据权利要求1所述的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于胰酶替代物为重组酶，不含动物源成分。

3.根据权利要求1所述的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于间充质干细胞完全培养基的组份为：DMEM/F12基础培养基+10％FBS+1％谷氨酰胺。

4.根据权利要求1所述的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于胰酶替代物的加入量为浸过细胞即可。

5.根据权利要求1所述的一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法，其特征在于在步骤三传代培养后，进行生物特性检测，然后再进行扩大培养，所述的生物特性检测具体操作如下：

一、将步骤三传代培养后的细胞配制成细胞密度1×10⁴/mL的细胞悬液，将细胞接种在24孔培养板中，每孔接种0.5mL细胞悬液，每天用胰酶替代物消化3个孔，计数，绘制细胞生长曲线及计算细胞倍增时间；

二、将步骤三传代培养后的细胞用生理盐水重悬，计数，将细胞密度调整至1×10⁵/mL，将细胞分为7管，每管为1mL细胞悬液，对细胞分别进行7种抗体标记，对细胞进行流式检测细胞表面抗原；其中，7种抗体为CD14、CD45、CD79、CD34、CD90、CD73和CD105；

三、将步骤三传代培养后的细胞用生理盐水重悬，计数，将细胞密度调整至1×10⁶/mL，用PI标记细胞，对细胞进行流式检测细胞周期；

四、将步骤三传代培养后的细胞配制成细胞密度1×10⁴/mL的细胞悬液，将600个细胞悬在8mL间充质完全培养基中，接种在10cm培养皿中，培养14天，龙胆紫染色，计细胞克隆形成率；

五、将步骤三传代培养后的细胞配制成细胞密度1×10⁴/mL的细胞悬液，将细胞接种在24孔培养板中，待细胞张至80～90％密度，分别更换成成骨、成软骨分化培养基，培养14天，分别用茜红素S、阿利新蓝染液对细胞进行染色，若细胞分化成功，则骨细胞将被茜红素S染成红色，软骨细胞将被阿利新蓝染成蓝色，即完成检测。

6.一种牙髓间充质干细胞的复苏方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

从牙髓间充质干细胞库中取保存的细胞，放入37℃水浴锅中将细胞融化；按照体积比为1:10的比例向细胞融化液中加入间充质干细胞完全培养基，然互离心，去上清，将沉淀用间充质干细胞完全培养基重悬，接种在培养瓶中，置于37℃、CO₂的体积百分含量为5％的培养箱中培养5～7天，即可获得所培养的牙髓间充质干细胞。