CN103396990B - 一种制备间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种制备间充质干细胞的方法，该方法以新生儿的脐带为原料，通过脐带预处理、冻存组织、复苏组织、分离原代间充质干细胞、扩增间充质干细胞的方法，该方法具有工业化简单、易于操作等优点，利用本发明方法可以大量冻存脐带组织，在临床有需要时对组织复苏以制备间充质干细胞，与现行的直接分离出间充质干细胞并进行细胞冻存相比，本方法可以充分保存脐带组织内最原始的间充质干细胞，既可大步降低保存成本，又可避免间充质干细胞在体外经多次传代导致其分化而影响其临床应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及制备间充质干细胞的方法。
背景技术
随着干细胞研究的兴起，特别是对成体干细胞的深入研究，使得体外分离培养不同组织来源的干细胞并建立相应的细胞系成为可能。其中，有关间充质干细胞的体内分布、体外分离、培养、诱导分化、发育潜能等的研究已经取得了突破性进展。由于间充质干细胞在成体组织中分布广泛，易于获取，并且可以在体外模拟体内的条件下大量扩增培养，最重要的是其诸多的临床应用潜能已被证实，例如在组织工程创伤、烧伤、缺血坏死、骨髓损伤等修复过程中必不可少，而且在细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面有着广泛的应用前景。因此，间充质干细胞已成为一种生物医学工程领域的“明星细胞”，引起越来越多的科学家、新闻工作者、普通民众等人群的强烈关注。
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）主要来源于胚胎发育早期的中胚层，其具有自我更新、多向分化和调节免疫等特点。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育的多种组织中，用的最多的也是骨髓来源的间充质干细胞。但是骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的增加，干细胞数量及其增殖分化能力显著降低；取材时对患者有损伤；有骨髓疾病时无法采集；即使是健康供者，亦不能抽取过多的骨髓。这些缺点都限制了骨髓来源间充质干细胞的应用。
近年来，也有研究者提出从新生儿脐带血里分离提取间充质干细胞，并且证实脐带血来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞具有相似的生物学 特性、免役表型、分化潜能等。但脐带血来源的间充质干细胞分离效率较低，难以在细胞治疗及组织工程领域广泛应用。也有报道从胎儿的肝脏、肾脏、肺脏等部位分离提取间充质干细胞，但是来源于胎儿的间充质干细胞在临床应用时显然受到伦理道德及传统观念的限制。因此，寻找一种简单易行而且没有伦理道德限制的间充质干细胞来源已成为当务之急。
各项研究显示，新生儿脐带中含有大量的间充质干细胞，其生物学特性与骨髓来源的间充质干细胞相似，并且从脐带中分离得到的间充质干细胞免疫原性低、增殖能力更强。脐带是胎儿娩出后的附属产物，往往作为废弃物丢掉或烧毁。脐带采集过程简单，且采集时对胎儿及产妇没有任何损伤。这些优点足以令新生儿脐带成为间充质干细胞最理想的来源。
虽然新生儿脐带中含有大量的间充质干细胞已被证实，但是从脐带中分离得到的间充质干细胞在体外长期培养时也会发生不同程度的分化，其长期培养并维持未分化状态的操作技术并不成熟。因此保存新生儿脐带组织内最原始的间充质干细胞并在有需要时进行分离制备初代间充质干细胞更符合生物医药、科学研究、临床应用等领域的使用需求。
发明内容
基于上述原因，申请人为克服现有技术的不足，通过长期的研究，确定了一种新的间充质干细胞的制备方法：以新生儿的脐带为原料，通过脐带预处理、冻存组织、复苏组织、分离原代间充质干细胞、扩增间充质干细胞的方法，该方法具有工业化简单、易于操作等优点，利用本发明方法可以大量冻存脐带组织，在临床有需要时对组织复苏以制备间充质干细胞，与现行的直接分离出间充质干细胞并进行细胞冻存相比，本方法可以充分保存脐带组织内最原始的间充质干细胞，既可大步降低保存成本，又可避免间充质干细胞在体外经多次传 代导致其分化而影响其临床应用。
本发明通过下述技术方案实现的。
一种新的间充质干细胞的制备方法：
（1）脐带预处理
取新生儿新鲜脐带，结扎脐带两端，放入含有100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液100ml中，在4℃～12℃运输；在百级超净台取出脐带，用70%～75%医用酒精浸泡脐带，浸泡时间30s～60s，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血迹，剪碎至0.5～2mm3，得到脐带组织小块，冷藏于0～5℃中；
（2）脐带组织块冻存处理
取出冷藏于0～5℃中的脐带组织小块，放入冷藏于0～5℃中的组织冻存保护液内，脐带组织小块与组织冻存保护液的质量与体积的比为0.5～1.5:0.5～1.5，得到组织块悬液，分装组织块悬液至冻存管中，将冻存管放置在冻存盒内，在0～5℃冷藏20分钟～40分钟，在零下80℃冻存4小时～6小时，最后放入零下196℃保存；
（3）脐带组织块复苏处理
取出零下196℃冻存的脐带组织冻存管，投入37℃～40℃的温水中，解冻后，在百级超净台上将组织块悬液移至离心管中，加入3～6倍组织块悬液体积的生理盐水冲洗，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体；离心管中加入生理盐水，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，反复操作1～2次，去掉液体，保留组织块固体；
（4）分离原代间充质干细胞
方法一（组织块贴壁法）：将步骤（3）组织块固体接种至细胞培养瓶中，每1～1.5平方厘米放置1块组织块固体，培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中静置3～5小时，向培养瓶内加入培养液，放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中，继续培养8～12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；细胞培养瓶中再加入培养液，在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养3～5天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125%～0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3分钟，加入与消化液等体积的胎牛血清（FBS）终止细胞消化作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液，转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，去掉液体，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞；
方法二（酶消化法）：向步骤（3）组织块固体内加入其3～5倍体积的0.05%～0.2%Ⅱ型胶原酶消化液，放入37℃恒温摇床内震荡消化，100转/分钟～150转/分钟，1～3小时；将消化液用100μm细胞筛网过滤，再将过滤液离心，2000转/分钟～2500转/分钟，离心15分钟～20分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml重悬沉淀，1500转/分钟～2000转/分钟，离心10分钟～15分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml重悬沉淀，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，吸弃上清液，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞；
（5）扩增间充质干细胞
取原代间充质干细胞与培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80%以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）反复浸洗培养瓶 底壁贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125%～0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3min，加入与消化液等体积的胎牛血清（FBS）终止细胞消化作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液；转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟；吸弃上清液，沉淀加入15～30ml培养液重悬，分装细胞悬液至3个～5个细胞培养瓶，各瓶补加10～20ml培养液。待细胞铺满瓶底80%以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增间充质干细胞。
本发明所述的青霉素和链霉素购自Gibco公司；RPMI-1640培养液购自Hyclone公司；pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）为自行配制；胰蛋白酶-EDTA消化液购自Gibco公司；DMEM/F12购自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；二甲基亚砜（DMSO）购自Amresco公司；Ⅱ型胶原酶消化液购自Gibco公司。
上述其中组织冻存保护液为DMEM/F12、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）混合液，其中DMEM/F12:胎牛血清:二甲基亚砜的体积比为5:4:1。
上述组织冻存保护液的配制方法为：取DMEM/F12、胎牛血清（FBS），在室温下混合完全，放置于0℃-5℃条件下5分钟-10分钟，逐滴加入二甲基亚砜，滴加完成后，混合均匀，置于0℃-5℃放置。
上述间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清（FBS）混合液，其中DMEM/F12:FBS的体积比为9:1。
附图说明
图1为实施例1贴壁的脐带组织块，其周围已爬出间充质干细胞。
图2为实施例1传代培养消化中的脐带间充质干细胞（P0代），细胞质回缩， 细胞间隙逐渐增大，细胞逐渐从培养瓶底壁脱离。
图3为实施例1传代培养后刚接种的的原代间充质干细胞（P0代），细胞在3小时内逐渐贴附到细胞培养瓶底壁。
图4为实施例1传代培养后接种第2天的脐带间充质干细胞（P1代），已全部贴壁生长。
图5为实施例1传代培养后接种第5天的脐带间充质干细胞（P1代），已铺满瓶底90%以上。
图6为实施例2经酶消化法分离得到的原代间充质干细胞（P0代），细胞数量多，贴壁率高，接种3小时即可贴壁。
图7为实施例2传代培养消化中的脐带间充质干细胞（P0代），细胞质回缩，细胞间隙逐渐增大，细胞逐渐从培养瓶底壁脱离。
图8为实施例2传代培养后刚接种的的原代间充质干细胞（P0代），细胞在3小时内逐渐贴附到细胞培养瓶底壁。
图9为实施例2传代培养后接种第2天的脐带间充质干细胞（P1代），已全部贴壁生长。
图10为实施例2传代培养后接种第5天的脐带间充质干细胞（P1代），已铺满瓶底90%以上。
制备实施例
下述实施例中所述脐带经产妇知情同意，签署知情同意书后才可行脐带采集操作。
实施例1（组织块贴壁法）：
（1）脐带预处理
取新生儿新鲜脐带，结扎脐带两端，放入含有100U/ml青霉素、100mg/ml 链霉素的RPMI-1640培养液100ml中，在4℃运输；在百级超净台取出脐带，用70%医用酒精浸泡脐带，浸泡时间45s，去除脐带结扎两端2cm左右，中间段剪成1.5cm长的小段，共得到20小段。用生理盐水反复冲洗脐带小段以去除残留的血块，剖开脐带小段，去除脐带动静脉，用生理盐水反复冲洗至无残留血迹，剪碎至1mm3，得到脐带组织小块体积约30ml，4℃冷藏；
（2）脐带组织块冻存处理
配制脐带组织冻存保护液30ml，4℃冷藏。
取出冷藏的脐带组织小块30ml，与冷藏的脐带组织冻存保护液30ml混合，得到脐带组织块悬液，分装组织块悬液至30个2ml冻存管中，将冻存管做好标记后放置在冻存盒内，将冻存盒在4℃冷藏30分钟，再在零下80℃冻存5小时，最后放入零下196℃保存。
（3）脐带组织块复苏处理
取出零下196℃保存的脐带组织冻存管5管，投入37℃的温水中，轻轻摇晃冻存管使其受热均匀，约2分钟后解冻完全，在百级超净台上将组织块悬液移至50ml离心管中，向离心管内加入30ml生理盐水，轻轻摇动离心管使其混合均匀，1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，离心管中再加入30ml生理盐水，1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，保留组织块固体。
（4）分离原代间充质干细胞
将步骤（3）组织块固体接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种40块组织块，共接种5瓶。将5个细胞培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中静置4小时；4小时后分别向每个细胞培养瓶内加入15ml间充质干细胞培养液，将5个细胞培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养；第8天可见细胞培养瓶底壁围绕接 种组织块周围爬出少量间充质干细胞，第10天可见组织块周围爬出的间充质干细胞逐渐增多，此时去除细胞培养瓶内的所有组织块固体，再向细胞培养瓶中加入15ml间充质干细胞培养液；将5个细胞培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养，第13天可见细胞培养瓶底壁间充质干细胞局部生长致密，此时吸弃培养瓶中培养液，向5个细胞培养瓶内分别加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml浸洗细胞培养瓶底壁贴壁细胞，吸弃洗涤液，再分别加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1.5ml，轻轻摇动细胞培养瓶，使消化液流遍细胞培养瓶底面，静置消化2分钟，轻轻拍打细胞培养瓶两侧以促使贴壁的间充质干细胞快速脱离细胞培养瓶底壁；分别向5个细胞培养瓶内各加入1.5ml胎牛血清（FBS）终止细胞消化作用，再分别加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）10ml重悬间充质干细胞，合并间充质干细胞悬液至2支50ml离心管内，1500转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液，得到沉淀物即为原代间充质干细胞（P0代）；
（5）扩增间充质干细胞
取步骤（4）原代间充质干细胞（P0代）与15ml间充质干细胞培养液混合，反复吸吹数次使其混合均匀，然后接种至3个细胞培养瓶，各瓶再补加10ml间充质干细胞培养液；接种第2天吸弃旧培养液，加入15ml新鲜培养液；接种第5天可见间充质干细胞已贴满细胞培养瓶底壁90%以上（P1代），此时吸弃细胞培养瓶内旧培养液，向3个细胞培养瓶内分别加入pH7.0～7.4磷酸盐缓冲液（PBS）20ml浸洗细胞培养瓶底壁贴壁细胞，吸弃洗涤液；再分别加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1.5ml，轻轻摇动细胞培养瓶，使消化液流遍细胞培养瓶底面，静置消化2分钟，轻轻拍打细胞培养瓶两侧以促使贴壁的间充质干细胞快速脱离细胞培养瓶底壁；向3个细胞培养瓶内分别加入1.5ml胎牛血清（FBS） 终止细胞消化作用，再分别加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）10ml重悬间充质干细胞；合并间充质干细胞悬液至1支50ml离心管内，1500转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液；向沉淀中加入18ml间充质干细胞培养液，反复吸吹数次使其混合均匀，接种至9个细胞培养瓶，各瓶补加13ml间充质干细胞培养液，将9个细胞培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱继续培养；接种第2天吸弃旧培养液，加入15ml新鲜培养液，将9个细胞培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱继续培养；接种第5天后可见间充质干细胞已贴满细胞培养瓶底壁90%以上（P2代），此时可收获经扩增得到的第二代间充质干细胞（P2代）。
（6）冻存间充质干细胞
取步骤（5）第二代间充质干细胞（P2代）与40.5ml细胞冻存保护液混合，反复吸吹数次使其混合均匀，分装冻存保护液（含细胞）至27支2ml冻存管内，将冻存管做好标记后放置在冻存盒内，将冻存盒在4℃冷藏30分钟，再在零下80℃冻存5小时，最后放入零下196℃保存。
上述其中组织冻存保护液为DMEM/F12、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）混合液，其中DMEM/F12:胎牛血清:二甲基亚砜的体积比为5:4:1。
上述组织冻存保护液的配制方法为：取DMEM/F12、胎牛血清（FBS），在室温下混合完全，放置于0℃-5℃条件下5分钟-10分钟，逐滴加入二甲基亚砜，滴加完成后，混合均匀，置于0℃-5℃放置。
上述间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清（FBS）混合液，其中DMEM/F12:FBS的体积比为9:1。
实施例2（酶消化法）：
（1）脐带预处理
取新生儿新鲜脐带，结扎脐带两端，放入含有100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液100ml中，在4℃运输；在百级超净台取出脐带，用70%医用酒精浸泡脐带，浸泡时间45s，去除脐带结扎两端2cm左右，中间段剪成1.5cm长的小段，共得到20小段。用生理盐水反复冲洗脐带小段以去除残留的血块，剖开脐带小段，去除脐带动静脉，用生理盐水反复冲洗至无残留血迹，剪碎至1mm3，得到脐带组织小块体积约30ml，4℃冷藏；
（2）脐带组织块冻存处理
取出冷藏的脐带组织小块30ml，与冷藏的脐带组织冻存保护液30ml混合，得到脐带组织块悬液，分装组织块悬液至30个2ml冻存管中，将冻存管做好标记后放置在冻存盒内，将冻存盒在4℃冷藏30分钟，再在零下80℃冻存5小时，最后放入零下196℃保存。
（3）脐带组织块复苏处理
取出零下196℃保存的脐带组织冻存管2管，投入37℃的温水中，轻轻摇晃冻存管使其受热均匀，约2分钟后解冻完全，在百级超净台上将组织块悬液移至50ml离心管中，向离心管内加入30ml生理盐水，轻轻摇动离心管使其混合均匀，1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，离心管中再加入30ml生理盐水，1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，保留组织块固体。
（4）制备原代间充质干细胞
向50ml离心管内加入0.2%Ⅱ型胶原酶消化液10ml，将离心管放入37℃恒温摇床内震荡消化，120转/分钟，2小时；消化结束后取出离心管，向离心管内加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）30ml以稀释消化液，将稀释后的消化液用100μm细胞筛网过滤，收集滤液至另一支50ml离心管，再将过滤液离心，2000转/分钟，离心15分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸 盐缓冲液（PBS）40ml重悬沉淀，1500转/分钟，离心10分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）40ml重悬沉淀，1000转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞（P0代）；
（5）扩增间充质干细胞
取步骤（4）原代间充质干细胞（P0代）与15ml间充质干细胞培养液混合，反复吸吹数次使其混合均匀，然后接种至1个细胞培养瓶；接种第2天吸弃旧培养液，加入15ml新鲜培养液；接种第7天可见间充质干细胞已贴满细胞培养瓶底壁90%以上（P1代），此时吸弃细胞培养瓶内旧培养液，向细胞培养瓶内加入pH7.0～7.4磷酸盐缓冲液（PBS）20ml浸洗细胞培养瓶底壁贴壁细胞，吸弃洗涤液；再加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1.5ml，轻轻摇动细胞培养瓶，使消化液流遍细胞培养瓶底面，静置消化2分钟，轻轻拍打细胞培养瓶两侧以促使贴壁的间充质干细胞快速脱离细胞培养瓶底壁；向细胞培养瓶内加入1.5ml胎牛血清（FBS）终止细胞消化作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）30ml重悬间充质干细胞；转移间充质干细胞悬液至1支50ml离心管内，1500转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液；向沉淀中加入15ml间充质干细胞培养液，反复吸吹数次使其混合均匀，接种至3个细胞培养瓶，各瓶补加10ml间充质干细胞培养液，将3个细胞培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱继续培养；接种第2天吸弃旧培养液，加入15ml新鲜培养液，将3个细胞培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱继续培养；接种第5天后可见间充质干细胞已贴满细胞培养瓶底壁90%以上（P2代），此时可收获经扩增得到的第二代间充质干细胞（P2代）。
上述其中组织冻存保护液为DMEM/F12、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）混合液，其中DMEM/F12:胎牛血清:二甲基亚砜的体积比为5:4:1。
上述组织冻存保护液的配制方法为：取DMEM/F12、胎牛血清（FBS），在室温下混合完全，放置于0℃-5℃条件下5分钟-10分钟，逐滴加入二甲基亚砜，滴加完成后，混合均匀，置于0℃-5℃放置。
上述间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清（FBS）混合液，其中DMEM/F12:FBS的体积比为9:1。
按照上述实施例1或实施例2的制备方法，可以制备大量合格的脐带间充质干细胞，并将其冻存建立脐带间充质干细胞库。脐带间充质干细胞库应还有细胞来源登记、信息追溯、随机访问等机制。建立脐带间充质干细胞数据库，包括但不局限于适宜的脐带采集、运输、冻存、复苏、规模化制备技术以及相应的质量管理体系等。
脐带间充质干细胞生物学特性研究
1、脐带间充质干细胞形态观察
（1）取实施例1制备的第2、3、4代细胞，显微镜下观察细胞形态。
结果：观察发现脐带间充质干细胞为成纤维细胞样细胞，单层贴壁生长，排列紧密，成漩涡状。接种30min开始贴壁，3h内活细胞可全部贴壁。贴壁的细胞逐渐由圆形向不规则形状变化。随着细胞分裂，细胞数目逐渐增多，细胞排列越来越紧密，形态逐渐均一。消化传代后，脐带间充质干细胞可以保持其细胞形态与生长特征不发生改变。
（2）取实施例2制备的第2、3、4代细胞，显微镜下观察细胞形态。
结果：观察发现脐带间充质干细胞为成纤维细胞样细胞，单层贴壁生长，排列紧密，成漩涡状。接种30min开始贴壁，3h内活细胞可全部贴壁。贴壁的细胞逐渐由圆形向不规则形状变化。随着细胞分裂，细胞数目逐渐增多，细胞排列越来越紧密，形态逐渐均一。消化传代后，脐带间充质干细胞可以保持其 细胞形态与生长特征不发生改变。
2、脐带间充质干细胞计数
（1）取实施例1方法制备的第2、3、4代细胞，制备单细胞悬液。吸取单细胞悬液按照计数间充质干细胞数。
结果：每个底面积75cm2的细胞培养瓶收获的间充质干细胞数分别为6.2×106、6.5×106、6.3×106。
（2）取实施例2方法制备的第2、3、4代细胞，制备单细胞悬液。吸取单细胞悬液计数间充质干细胞数。
结果：每个底面积75cm2的细胞培养瓶收获的间充质干细胞数分别为6.7×106、6.4×106、6.6×106。
3、脐带间充质干细胞活率检测
（1）取实施例1方法制备的第2、3、4代细胞，制备单细胞悬液。吸取单细胞悬液按照台盼兰拒染法计算间充质干细胞活率。
结果：每个底面积75cm2的细胞培养瓶收获的间充质干细胞活率98.6%、99.2%、98.5%。
（2）取实施例2方法制备的第2、3、4代细胞，制备单细胞悬液。吸取单细胞悬液按照台盼兰拒染法计算间充质干细胞活率。
结果：每个底面积75cm2的细胞培养瓶收获的间充质干细胞活率均为95%以上99.3%、99.1%、99.7%。
3、脐带间充质干细胞表面标志分析
（1）取实例1方法制备的第2、3、4代细胞，按照步骤制备单细胞悬液。
按照流式细胞术检测细胞表面标志：收集3.5×106个细胞，分装至7个微量离心管，加入PBS至1ml，离心1500rpm、10min、RT，弃上清，加入PE标记的 CD73、CD90、CD105抗体以及FITC标记的CD45、CD34、HLA～DR抗体各10μl，剩余一管作为对照，4℃下避光孵育30min，PBS重复洗涤一次，再加入200μl的PBS重悬细胞，直接用流式细胞仪检测。
结果：CD73、CD90、CD105均为阳性，CD73阳性率97.3%、CD90阳性率97.6%、CD105阳性率99.2%。CD45、CD34、HLA～DR均为阴性，CD45阳性率0.2%，CD34阳性率1.1%、HLA～DR阳性率0.9%。
（2）取实例2方法制备的第2、3、4代细胞，按照步骤制备单细胞悬液。
按照流式细胞术检测细胞表面标志：收集3.5×106个细胞，分装至7个微量离心管，加入PBS至1ml，离心1500rpm、10min、RT，弃上清，加入PE标记的CD73、CD90、CD105抗体以及FITC标记的CD45、CD34、HLA～DR抗体各10μl，剩余一管作为对照，4℃下避光孵育30min，PBS重复洗涤一次，再加入200μl的PBS重悬细胞，直接用流式细胞仪检测。
结果：CD73、CD90、CD105均为阳性，CD73阳性率96.7%、CD90阳性率97.8%、CD105阳性率99.5%。CD45、CD34、HLA～DR均为阴性，CD45阳性率0.3%，CD34阳性率0.9%、HLA～DR阳性率0.8%。
4、间充质干细胞诱导分化实验
（1）实施例1制备的间充质干细胞
成脂诱导：P5代细胞，用完全培养液混合1×105个细胞接种至六孔板，放置在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱24h后全量换液，并加入0.5μM地塞米松、0.5mM IBMX、10μM胰岛素，放置在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中诱导分化，以后每3天全量换液1次，两周后，采用油红O染色法鉴定脂滴形成。
结果：诱导2周后，可见细胞内充满脂滴，油红O染色后可见脂滴成红色。
成骨诱导：P5代细胞，用完全培养液混合1×105个细胞接种至六孔板，放置在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱，24h后全量换液，并加入10mMβ-甘油磷酸钠、1μM地塞米松、50mg维生素C继续培养，以后每3天换液。诱导2周后进行碱性磷酸酶染色、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。
结果：诱导2周后，碱性磷酸酶染色呈强阳性反应。
成软骨诱导：P5代细胞，用完全培养液混合2×105个细胞接种至24孔板，每孔加入10mM地塞米松，10μg/L TGF-β、10mM维生素C，放置在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养，连续培养2周。2周后进行Ⅱ型胶原检测。
结果：诱导2周后，阿辛蓝染色可见II型胶原形成。
（2）实施例2制备的间充质干细胞
成脂诱导：P5代细胞，用完全培养液混合1×105个细胞接种至六孔板，放置在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱24h后全量换液，并加入0.5μM地塞米松、0.5mM IBMX、10μM胰岛素，放置在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中诱导分化，以后每3天全量换液1次，两周后，采用油红染色法鉴定脂滴形成。
结果：诱导2周后，可见细胞内充满脂滴，油红O染色后可见脂滴成红色。
成骨诱导：P5代细胞，用完全培养液混合1×105个细胞接种至六孔板，放置在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱，24h后全量换液，并加入10mMβ-甘油磷酸钠、1μM地塞米松、50mg维生素C继续培养，以后每3天换液。诱导2周后进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。
结果：诱导2周后，碱性磷酸酶染色呈强阳性反应。
成软骨诱导：P5代细胞，用完全培养液混合2×105个细胞接种至24孔板，每孔加入10mM地塞米松，10μg/L TGF-β、10mM维生素C，放置在37℃、5%CO2、 饱和湿度的细胞培养箱培养，连续培养2周。2周后进行Ⅱ型胶原检测。
结果：诱导2周后，阿辛蓝染色可见II型胶原形成。
制备实施例包括但不限于上述。
Claims (1)
1.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于：
(1)脐带预处理
取新生儿新鲜脐带，结扎脐带两端，放入含有100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液100ml中，在4℃～12℃运输；在百级超净台取出脐带，用70％～75％医用酒精浸泡脐带，浸泡时间30s～60s，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉及静脉，用生理盐水反复冲洗去除血迹，剪碎至0.5～2mm3，得到脐带组织小块，冷藏于0～5℃中；
(2)脐带组织块冻存处理
取出冷藏于0～5℃中的脐带组织小块，放入冷藏于0～5℃中的组织冻存保护液内，脐带组织小块与组织冻存保护液的质量与体积的比为0.5～1.5:0.5～1.5，得到组织块悬液，分装组织块悬液至冻存管中，将冻存管放置在冻存盒内，在0～5℃冷藏20分钟～40分钟，在零下80℃冻存4小时～6小时，最后放入零下196℃保存；
(3)脐带组织块复苏处理
取出零下196℃冻存的脐带组织冻存管，投入37℃～40℃的温水中，解冻后，在百级超净台上将组织块悬液移至离心管中，加入3～6倍组织块悬液体积的生理盐水冲洗，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体；离心管中加入生理盐水，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，反复操作1～2次，去掉液体，保留组织块固体；
(4)分离原代间充质干细胞
方法①：将步骤(3)组织块固体接种至细胞培养瓶中，每1～1.5平方厘米放置1块组织块固体，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中静置3～5小时，向培养瓶内加入培养液，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中，继续培养8～12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；细胞培养瓶中再加入培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养3～5天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％～0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3分钟，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液，转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，去掉液体，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞；
方法②：向步骤(3)组织块固体内加入其3～5倍体积的0.05％～0.2％Ⅱ型胶原酶消化液，放入37℃恒温摇床内振荡消化，100转/分钟～150转/分钟，1～3小时；将消化液用100μm细胞筛网过滤，再将过滤液离心，2000转/分钟～2500转/分钟，离心15分钟～20分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液20ml～40ml重悬沉淀，1500转/分钟～2000转/分钟，离心10分钟～15分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液20ml～40ml重悬沉淀，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，吸弃上清液，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞；
(5)扩增间充质干细胞
取原代间充质干细胞与间充质干细胞培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80％以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液反复浸洗培养瓶底壁贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125％～0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液；转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟；吸弃上清液，沉淀加入15～30ml培养液重悬，分装细胞悬液至3个～5个细胞培养瓶，各瓶补加10～20ml培养液，待细胞铺满瓶底80％以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增间充质干细胞；
其中组织冻存保护液为DMEM/F12、胎牛血清和二甲基亚砜混合液，其中DMEM/F12:胎牛血清:二甲基亚砜的体积比为5:4:1；其中组织冻存保护液的配制方法为：取DMEM/F12、以及胎牛血清，在室温下混合完全，放置于0℃-5℃条件下5分钟-10分钟，逐滴加入二甲基亚砜，滴加完成后，混合均匀，置于0℃-5℃放置；
其中间充质干细胞培养液为DMEM/F12、以及胎牛血清混合液，DMEM/F12与胎牛血清的体积比为9:1。
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