CN109957542A - 一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法 - Google Patents

一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤；所述人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至Pe代人源脐带间充质干细胞，待Pe代人源脐带间充质干细胞悬液均匀后，补充5%葡萄糖注射液，调节Pe代人源脐带间充质干细胞浓度4×104‑6×104个/mL得到人源脐带间充质干细胞制剂；其中e=6、7、8、9、10。本发明完善人源脐带间充质干细胞的储备，保障了人源脐带间充质干细胞的存活率、增殖能力和特异性。

Description

一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制 备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说，它涉及一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法。
背景技术
衰老是生物体必然的发展趋势，是一种复杂多变的过程。在整个生命过程中，机体会受到外界环境中各种物质、能量、信息的影响和作用，且组织和器官也会不可避免的发生损伤和功能衰退。随着医疗技术和生活水平提高，老龄化人口数量增加，伴随衰老，人体器官生理功能发生病变，如高血压、冠状动脉粥样硬化等疾病增加。延缓衰老可能减少这些疾病的发生，从整体上提高机体功能状态，从而提高机体的生命质量。
目前，干细胞治疗已被应用于许多临床问题，包括衰老相关的黄斑病变，神经再生，肝脏修复，此外还应用于治疗运动功能障碍，以及衰老相关的肌肉萎缩和皮肤老化。因此干细胞对于衰老相关疾病和年轻化的应用也已为期不远。但仍有许多技术环节存在困难，有待攻克，特别是储备干细胞的技术有待完善。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其完善人源脐带间充质干细胞的储备，保障了人源脐带间充质干细胞的存活率、增殖能力和特异性。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存；所述人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至Pe代人源脐带间充质干细胞，反复吹洗，待Pe代人源脐带间充质干细胞悬液均匀后，补充5%葡萄糖注射液，调节Pe代人源脐带间充质干细胞浓度为4×104-6×104个/mL，得到人源脐带间充质干细胞制剂；其中，e=6、7、8、9、10。
进一步，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
进一步，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1 mm×1 mm的脐带组织块。
进一步，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
进一步，所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。
进一步，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得Pm+1代人源脐带间充质干细胞。
进一步，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
进一步，所述人源脐带间充质干细胞悬液的浓度为1×107个/mL。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、本发明完善人源脐带间充质干细胞的储备，保障了人源脐带间充质干细胞的存活率、增殖能力和特异性。
第二、采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
附图说明
图1是实施例1所得到的P5代人源脐带间充质干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线、对比例1所得到的P5代人源脐带间充质干细胞进行培养7天的生长曲线、实施例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线以及对比例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞进行培养7天的生长曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1mm×1 mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。其中，n=1、2、3、4。
干细胞的冻存步骤包括待P5代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P5代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整P5代人源脐带间充质干细胞浓度为1×107个/mL，将P5代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P5代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P5代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得P5代人源脐带间充质干细胞悬液，将P5代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得P6代人源脐带间充质干细胞。
人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至P6代人源脐带间充质干细胞，反复吹洗，待P6代人源脐带间充质干细胞悬液均匀后，补充5%葡萄糖注射液，调节P6代人源脐带间充质干细胞浓度为4×104-6×104个/mL，得到人源脐带间充质干细胞制剂。
对比例1
一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1mm×1 mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。其中，n=1、2、3、4、5。
人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至P6代人源脐带间充质干细胞，反复吹洗，待P6代人源脐带间充质干细胞悬液均匀后，补充5%葡萄糖注射液，调节P6代人源脐带间充质干细胞浓度为4×104-6×104个/mL，得到人源脐带间充质干细胞制剂。
实施例1进行复苏后得到的P5代人源脐带间充质干细胞与对比例1所得到的P5代干细的表面标记表达率的结果对比。人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分别对对比例1所得到的P5代人源脐带间充质干细胞以及对实施例1进行复苏后得到的P5代人源脐带间充质干细胞，在培养3天后消化收集后制成干细胞悬液，加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行人源脐带间充质干细胞表面标记物的流式检测，加入的特异性抗体分别为 CD34(呈阴性表达)、CD45(呈阴性表达)、CD44(呈阳性表达)、CD90(呈阳性表达)。对比例1所得到的P6代人源脐带间充质干细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为99.9%，CD45-CD90+表达率为99.9%；实施例1进行复苏后得到的P6代人源脐带间充质干细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为99.6%，CD45-CD90+表达率为98.9%。由此可知，经过采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤后，人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
实施例1进行复苏后得到的P5代人源脐带间充质干细胞与比例1所得到的P5代人源脐带间充质干细胞的增殖情况进行对比。绘制对比例1所得到的P5代人源脐带间充质干细胞进行培养7天的生长曲线图以及对实施例1所得到的P5代人源脐带间充质干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线图，结果如图1所示。本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果，复苏后的干细胞的增殖能力略差于未经冻存的干细胞的增殖能力。由此可知，相较于现有技术，复苏后的干细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。
实施例2
一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1mm×1 mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。其中，n=1、2、3、4。
干细胞的冻存步骤包括待P5代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P5代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整P5代人源脐带间充质干细胞浓度为1×107个/mL，将P5代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P5代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P5代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得P5代人源脐带间充质干细胞悬液，将P5代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得P6代人源脐带间充质干细胞。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。其中，n=6、7、8、9。
人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至P10代人源脐带间充质干细胞，反复吹洗，待P10代人源脐带间充质干细胞悬液均匀后，补充5%葡萄糖注射液，调节P10代人源脐带间充质干细胞浓度为4×104-6×104个/mL，得到人源脐带间充质干细胞制剂。
对比例2
一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1mm×1 mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。其中，n=1、2、3、4、5、6、7、8、9。
人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至P10代人源脐带间充质干细胞，反复吹洗，待P10代人源脐带间充质干细胞悬液均匀后，补充5%葡萄糖注射液，调节P10代人源脐带间充质干细胞浓度为4×104-6×104个/mL，得到人源脐带间充质干细胞制剂。
实施例2进行复苏后得到的P10代人源脐带间充质干细胞与对比例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞的表面标记表达率的结果对比。人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分别对对比例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞以及对实施例2进行复苏后得到的P10代人源脐带间充质干细胞，在培养3天后消化收集后制成干细胞悬液，加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行人源脐带间充质干细胞表面标记物的流式检测，加入的特异性抗体分别为 CD34(呈阴性表达)、CD45(呈阴性表达)、CD44(呈阳性表达)、CD90(呈阳性表达)。对比例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为99.9%，CD45-CD90+表达率为99.8%；实施例2进行复苏后得到的P10代人源脐带间充质干细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为99.5%，CD45-CD90+表达率为98.6%。由此可知，经过采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤后，再经过传代培养的人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
对实施例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞与对比例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞的增殖情况进行对比。绘制对比例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞进行培养7天的生长曲线图以及对实施例2所得到的P10代人源脐带间充质干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线图，结果如图1所示。
经过采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤后再经过传代培养的人源脐带间充质干细胞的增殖能力略差于未经冻存的干细胞的增殖能力。由此可知，相较于现有技术，复苏后的干细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。
应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存；所述人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至Pe代人源脐带间充质干细胞，反复吹洗，待Pe代人源脐带间充质干细胞悬液均匀后，补充5%葡萄糖注射液，调节Pe代人源脐带间充质干细胞浓度为4×104-6×104个/mL，得到人源脐带间充质干细胞制剂；其中，e=6、7、8、9、10。
2.根据权利要求1所述的一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
3.根据权利要求1所述的一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1 mm×1 mm的脐带组织块。
4.根据权利要求1所述的一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述的一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得Pm+1代人源脐带间充质干细胞。
7.根据权利要求2或5或6所述的一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
8.根据权利要求1或2或5或6所述的一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述人源脐带间充质干细胞悬液的浓度为1×107个/mL。
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