CN108315296A - 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法 - Google Patents

间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108315296A
CN108315296A CN201810155579.7A CN201810155579A CN108315296A CN 108315296 A CN108315296 A CN 108315296A CN 201810155579 A CN201810155579 A CN 201810155579A CN 108315296 A CN108315296 A CN 108315296A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
cell
mescenchymal stem
culture
primary cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810155579.7A
Other languages
English (en)
Inventor
杨涛
隋昳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen To Bo Biology Technology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen To Bo Biology Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen To Bo Biology Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen To Bo Biology Technology Co Ltd
Priority to CN201810155579.7A priority Critical patent/CN108315296A/zh
Priority to PCT/CN2018/080589 priority patent/WO2019161591A1/zh
Publication of CN108315296A publication Critical patent/CN108315296A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法。一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：获取间充质干细胞原代细胞；间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞的分离。该间充质干细胞的分离培养方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞。并且针对上述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间质干细胞，本发明还提供一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，能很好的保存并复苏该间质干细胞。

Description

间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法。
背景技术
干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后(或植入)人体，用于疾病治疗的过程。这种体外操作包括干细胞的分离、纯化、扩增、冻存和冻存后的复苏等过程。目前国内外已经开展了多种干细胞类型的临床应用研究，涉及的主要疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GVHD)、脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。其中由于间充质干细胞(MSCs)具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力等，广泛应用于临床各种疾病的治疗。
开展临床试验治疗，需要制备大量的细胞，而用于干细胞治疗的细胞制备技术具有多样性、复杂性和特殊性。作为一种新型的生物治疗产品，干细胞制剂除了像其他细胞制品一样遵循一个共同的研发过程，即从细胞制剂的制备、体外实验、体内动物实验，到植入人体的临床研究即临床治疗的过程外，还具备其特殊性。这种特殊性就是干细胞是最原始的细胞，任何细微的微环境改变都会影响其功能的发挥。而在干细胞制备过程中，从体内干细胞分离出来后，干细胞的性质就开始发生变化，因此如何操作以确保干细胞具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应等，是一个亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞，并且能很好的保存并复苏该间质干细胞。
为解决上述技术问题，发明采用如下所述的技术方案。一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：
获取间充质干细胞原代细胞；
间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及
间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。
优选地，所述第一消化液为0.25％胰蛋白酶-EDTA。
优选地，所述的进行离心分离为在800～1200转/分下离心6～10min。
优选地，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。
优选地，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
抽取骨髓液并稀释：用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液，混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液；
细胞的分离与纯化：将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上，通过离心分离纯化单个核细胞群，然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀；及
细胞扩增培养：将离心分离后得到的沉淀利用无血清培养液混悬，按5×106/mL的密度进行接种并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到骨髓间充质干细胞原代细胞。
优选地，所述间充质干细胞原代细胞为自体脂肪间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
抽取自体脂肪颗粒并剪碎：抽取自体脂肪颗粒，剔除可见微血管及肌肉组织，用PBS进行洗涤，然后将脂肪组织剪碎至糊状使其小于1mm3；
细胞的分离与纯化：往糊状的脂肪组织中添加第二消化液进行消化，消化后过滤收集滤液，然后使用含有10％FBS的低糖DMEM培养基进行中和，再离心得到沉淀；及
细胞扩增培养：往经过细胞的分离与纯化后得到的沉淀中加入无血清培养基，以1×106/mL的密度进行接种，并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到自体脂肪间充质干细胞原代细胞。
优选地，所述第二消化液为含有0.1％胶原酶I型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM。
优选地，所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
处理脐带：取脐带并剪断，剪断后的脐带总长度大于15cm，用生理盐水清洗后，再用含2倍双抗生理盐水去除血渍，接着去除血管与外膜，剥离华尔通胶并剪成0.5～1mm3；及
细胞扩增培养：将剪碎的华尔通胶涂布于培养皿上，加入无血清完全培养基，于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，培养7～10天即可得到脐带间充质干细胞原代细胞。
一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，将上述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间充质干细胞进行冻存及复苏，包括：
间充质干细胞的冻存：用细胞冻存液重悬所述间充质干细胞，然后置于装有异丙醇的容器中，于-90～-70℃下过夜后移入液氮罐；及
间充质干细胞的复苏：取冻存的间充质干细胞立即投入40～45℃水浴中融化，然后加入完全培养基并混匀，离心处理后弃去上清液，以完全培养基重悬后于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，待65～75％的细胞贴壁即可。
优选地，所述间充质干细胞的冻存中的细胞冻存液由90％胎牛血清及10％DMSO组成。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种间充质干细胞的分离培养方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞。并且针对上述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间质干细胞，还提供一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，能很好的保存并复苏该间质干细胞。
附图说明
图1是本发明实施例一中间充质干细胞的分离培养方法的流程示意图。
图2是本发明实施例一的第一种实施方式中获取间充质干细胞原代细胞的流程示意图。
图3是本发明实施例一的第二种实施方式中获取间充质干细胞原代细胞的流程示意图。
图4是本发明实施例一的第三种实施方式中获取间充质干细胞原代细胞的流程示意图。
图5是本发明实施例二中间充质干细胞的冻存、复苏方法的流程示意图。
具体实施方式
为使本领域的普通技术人员更加清楚地理解发明的目的、技术方案和优点，以下结合附图和实施例对发明做进一步的阐述。
实施例一
如图1所示，一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：
步骤S1：获取间充质干细胞原代细胞；
步骤S2：间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及
步骤S3：间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。
本发明所提供的一种间充质干细胞的分离培养方法，通过确定间充质干细胞原代细胞的培养扩增以及间充质干细胞的分离中的具体操作，从而得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞。
在步骤S1中，所述间充质干细胞原代细胞可以是骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。因此获取间充质干细胞原代细胞有三种实施方式。该三种实施方式均需要对供者的健康情况进行评估和筛查，严格排除HBV、梅毒阳性者、易感染HIV的高危人群(如吸毒史者、同性恋者、多个性伴侣者)、各种结核病(如肺结核、肾结核、淋巴结核及骨结核等)患者。
第一种实施方式
请一并参阅图2，当所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞时，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
步骤S11：抽取骨髓液并稀释：用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液，混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液；
步骤S12：细胞的分离与纯化：将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上，通过离心分离纯化单个核细胞群，然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀；及
步骤S13：细胞扩增培养：将离心分离后得到的沉淀利用无血清培养液混悬，按5×106/mL的密度进行接种并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到骨髓间充质干细胞原代细胞。
其中，步骤S11中，抽取骨髓液具体为：取俯卧位，取髂后上棘为穿刺点，碘伏常规消毒，2％利多卡因局部麻醉。用骨穿针在髂后上棘穿刺，有突破感后拔出针芯。用装有2ml含500U/ml肝素的PBS液的20ml无菌注射器抽取骨髓液，摇匀后注入50ml的无菌离心管中，共抽取50ml左右。在抽取骨髓液之后可以立即送至实验室进行稀释，而如需短暂保存，可以是短暂存放于4℃冰箱内。骨髓液的稀释优选为：用等量含20U/ml肝素的PBS液稀释骨髓液得到骨髓缓冲液。
步骤S12中，优选的是，将骨髓缓冲液沿管壁徐徐滴流叠加入淋巴细胞分离液上，更好的是，所述骨髓缓冲液与淋巴细胞分离液等体积。通过离心分离纯化单个核细胞群优选为，以2000转/分的转速离心30分钟，纯化单个核细胞群。用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀优选为，用DMEM(L)培养液离心洗涤2次，每次1000转/分，离心5分钟，弃去上清液，取沉淀。
步骤S13中，优选的是接种后于37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养。
在该实施方式中，具体的实施例可以是：取俯卧位，取髂后上棘为穿刺点，碘伏常规消毒，2％利多卡因局部麻醉。用骨穿针在髂后上棘穿刺，有突破感后拔出针芯。用装有2ml含500U/ml肝素的PBS液的20ml无菌注射器抽取骨髓液，摇匀后注入50ml的无菌离心管中，共抽取50ml左右。采集的骨髓液，短暂存放于4℃冰箱内(不超过24小时)或立即送至实验室。用等量含20U/ml肝素的PBS液稀释骨髓后，沿管壁徐徐滴流叠加入等体积比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上。2000转/分，离心30分钟，纯化单个核细胞群。用DMEM(L)培养液离心洗涤2次，每次1000转/分，离心5分钟，弃去上清液，取沉淀。无血清培养液混悬，按5×106/mL接种于培养瓶中，置37℃5％CO2饱和湿度培养。3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次。共6d，以备移植、传代或冻存。
第二种实施方式
请一并参阅图3，当所述间充质干细胞原代细胞为自体脂肪间充质干细胞原代细胞时，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
步骤S11′：抽取自体脂肪颗粒并剪碎：抽取自体脂肪颗粒，剔除可见微血管及肌肉组织，用PBS进行洗涤，然后将脂肪组织剪碎至糊状使其小于1mm3；
步骤S12′：细胞的分离与纯化：往糊状的脂肪组织中添加第二消化液进行消化，消化后过滤收集滤液，然后使用含有10％FBS的低糖DMEM培养基进行中和，再离心得到沉淀；及
步骤S13′：细胞扩增培养：往经过细胞的分离与纯化后得到的沉淀中加入无血清培养基，以1×106/mL的密度进行接种，并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到自体脂肪间充质干细胞原代细胞。
其中，步骤S11′中，优选为用PBS洗涤3遍。
在步骤S12′中，所述第二消化液优选为含有0.1％胶原酶I型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM。进一步优选的是，在37℃的水浴中进行消化，且进行搅拌，消化时长为40～45分钟。消化后过滤优选为选用200目过滤网进行过滤。优选地，所述低糖DMEM培养基的用量与滤液等体积；利用低糖DMEM培养基中和后所进行的离心优选为，以1500转/分的转速离心10分钟。
在步骤S13′中，优选的是接种后于37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养。
在该实施方式中，具体的实施例可以是：患者下腹部抽取15～20mL自体脂肪颗粒，剔除可见微血管及肌肉组织，PBS洗涤3遍，然后用剪刀将脂肪组织剪碎至糊状，要求<1mm3。将糊状脂肪组织转移至锥形瓶中，添加消化液(含有0.1％胶原酶I型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM)，37℃水浴中匀速搅拌40～45分钟，至组织块消化干净。200目筛网过滤收集滤液，然后使用含有10％FBS的低糖DMEM培养基等量中和，1500转/分离心10min，弃上清。向沉淀中加入新鲜的无血清培养基，以1×106/mL的细胞密度，置37℃5％CO2饱和湿度培养。3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3天更换培养液1次。共6d，以备移植、传代或冻存。
第三种实施方式
请一并参阅图4，当所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞时，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
步骤S11〞：处理脐带：取脐带并剪断，剪断后的脐带总长度大于15cm，用生理盐水清洗后，再用含2倍双抗生理盐水去除血渍，接着去除血管与外膜，剥离华尔通胶并剪成0.5～1mm3；及
步骤S12〞：细胞扩增培养：将剪碎的华尔通胶涂布于培养皿上，加入无血清完全培养基，于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，培养7～10天即可得到脐带间充质干细胞原代细胞。
其中，在步骤S11〞中，用生理盐水清洗后可以立即送至实验室进行稀释，而如需短暂保存，可以是短暂存放于4℃冰箱内。在步骤S12〞中，加入无血清完全培养基后，优选为于37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养。
在该实施方式中，具体的实施例可以是：待胎盘娩出1分钟内，在靠近胎盘处结扎后剪断脐带，保证采集的脐带总长度不少于15cm。用生理盐水简单清洗后置一次性无菌采集容器内，拧紧瓶盖，短暂存放于4℃冰箱内(不超过24小时)或立即送至实验室。无菌镊子转移脐带至无菌培养皿中，用含2倍双抗生理盐水基本去除血渍。去除血管与外膜，剥离华尔通胶，剪成0.5～1mm3。按照2～3cm长的脐带一皿的量，将上述剪碎的华尔通胶均匀涂布于10cm的培养皿上，室温5～10分钟贴附，后加入5ml完全培养基(无血清)，37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱7～10天培养。
在步骤S2中，所述第一消化液优选为0.25％胰蛋白酶-EDTA。优选地，所述的进行离心分离为在800～1200转/分下离心6～10min。在一些具体实施例中为，原代细胞培养7天后换液(无血清DMEM(L))，至细胞70％融合，移去培养上清液至50ml离心管，培养瓶中加0.25％胰蛋白酶-EDTA3ml，消化1min，细胞收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液稀释，使用移液管轻轻吹打，将脐带间充质干细胞悬液移入50ml离心管。1000转/分离心8分钟，弃上清。重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种10cm培养皿。培养4～5天后，细胞融合70％左右时传代培养，以1：(6～8)传代至15cm培养皿中。
实施例二
一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，将实施例一中所述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间充质干细胞进行冻存及复苏，包括：
步骤T1：间充质干细胞的冻存：用细胞冻存液重悬所述间充质干细胞，然后置于装有异丙醇的容器中，于-90～-70℃下过夜后移入液氮罐；及
步骤T2：间充质干细胞的复苏：取冻存的间充质干细胞立即投入40～45℃水浴中融化，然后加入完全培养基并混匀，离心处理后弃去上清液，以完全培养基重悬后于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，待65～75％的细胞贴壁即可。
在步骤T1中，优选地，所述细胞冻存液由90％胎牛血清及10％DMSO组成。在一些具体实施例中，步骤T1为，用细胞冻存液(90％胎牛血清、10％DMSO)重悬间充质干细胞(MSCs)，充分混匀，每管1ml(1个15cm培养皿)分装于冻存管密封。在冻存管上做好标记，将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐。
在步骤T2中，离心处理优选为在1000转/分下离心8分钟。以完全培养基重悬后优选为于37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养。在一些具体实施例中，步骤T2为，从液氮中取出MSCs，立即投入42℃水浴中融化。加入等体积完全培养基并混匀，1000转离心8分钟后，弃去上清液，以完全培养基重悬后于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，待70％细胞贴壁即可。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：包括：
获取间充质干细胞原代细胞；
间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及
间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述第一消化液为0.25％胰蛋白酶-EDTA。
3.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述的进行离心分离为在800～1200转/分下离心6～10min。
4.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。
5.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
抽取骨髓液并稀释：用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液，混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液；
细胞的分离与纯化：将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上，通过离心分离纯化单个核细胞群，然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀；及
细胞扩增培养：将离心分离后得到的沉淀利用无血清培养液混悬，按5×106/mL的密度进行接种并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到骨髓间充质干细胞原代细胞。
6.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为自体脂肪间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
抽取自体脂肪颗粒并剪碎：抽取自体脂肪颗粒，剔除可见微血管及肌肉组织，用PBS进行洗涤，然后将脂肪组织剪碎至糊状使其小于1mm3；
细胞的分离与纯化：往糊状的脂肪组织中添加第二消化液进行消化，消化后过滤收集滤液，然后使用含有10％FBS的低糖DMEM培养基进行中和，再离心得到沉淀；及
细胞扩增培养：往经过细胞的分离与纯化后得到的沉淀中加入无血清培养基，以1×106/mL的密度进行接种，并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到自体脂肪间充质干细胞原代细胞。
7.如权利要求6所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述第二消化液为含有0.1％胶原酶I型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM。
8.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：
处理脐带：取脐带并剪断，剪断后的脐带总长度大于15cm，用生理盐水清洗后，再用含2倍双抗生理盐水去除血渍，接着去除血管与外膜，剥离华尔通胶并剪成0.5～1mm3；及
细胞扩增培养：将剪碎的华尔通胶涂布于培养皿上，加入无血清完全培养基，于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，培养7～10天即可得到脐带间充质干细胞原代细胞。
9.一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，其特征在于：将权利要求1所述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间充质干细胞进行冻存及复苏，包括：
间充质干细胞的冻存：用细胞冻存液重悬所述间充质干细胞，然后置于装有异丙醇的容器中，于-90～-70℃下过夜后移入液氮罐；及
间充质干细胞的复苏：取冻存的间充质干细胞立即投入40～45℃水浴中融化，然后加入完全培养基并混匀，离心处理后弃去上清液，以完全培养基重悬后于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，待65～75％的细胞贴壁即可。
10.如权利要求9所述的间充质干细胞的冻存、复苏方法，其特征在于：所述间充质干细胞的冻存中的细胞冻存液由90％胎牛血清及10％DMSO组成。
CN201810155579.7A 2018-02-23 2018-02-23 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法 Pending CN108315296A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810155579.7A CN108315296A (zh) 2018-02-23 2018-02-23 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法
PCT/CN2018/080589 WO2019161591A1 (zh) 2018-02-23 2018-03-27 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810155579.7A CN108315296A (zh) 2018-02-23 2018-02-23 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108315296A true CN108315296A (zh) 2018-07-24

Family

ID=62899834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810155579.7A Pending CN108315296A (zh) 2018-02-23 2018-02-23 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN108315296A (zh)
WO (1) WO2019161591A1 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109042625A (zh) * 2018-08-01 2018-12-21 广州润虹医药科技股份有限公司 一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用
CN109112102A (zh) * 2018-09-03 2019-01-01 丰泽康生物医药（深圳）有限公司 一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法
CN109321521A (zh) * 2018-10-25 2019-02-12 西北农林科技大学 永生化的犬脂肪间充质干细胞的体外培养方法及其用途
CN109566600A (zh) * 2018-12-29 2019-04-05 中国医学科学院整形外科医院 一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法
CN109929800A (zh) * 2019-03-09 2019-06-25 和携科技(北京)有限公司 一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法
CN109938010A (zh) * 2019-03-20 2019-06-28 江苏瑞思坦生物科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞运输液及其制备方法
CN109957542A (zh) * 2019-03-09 2019-07-02 和携科技(北京)有限公司 一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法
CN111849880A (zh) * 2020-06-23 2020-10-30 和携科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法
CN113416694A (zh) * 2021-07-21 2021-09-21 江苏瑞思坦生物科技有限公司 一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法
CN114591902A (zh) * 2022-03-30 2022-06-07 深圳市茵冠生物科技有限公司 间充质干细胞的培养方法及应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113068684A (zh) * 2021-03-06 2021-07-06 河北北科生物科技有限公司 人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法
NO347619B1 (en) * 2022-03-04 2024-01-29 Cryogenetics As Method of cryopreserving biological material and related apparatus

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270349A (zh) * 2008-03-20 2008-09-24 浙江大学 胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法
CN101412985A (zh) * 2007-10-15 2009-04-22 华东理工大学 用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
CN101629165A (zh) * 2009-07-24 2010-01-20 中国人民解放军海军总医院 脐带华通胶间充质干细胞的制备方法及其产品
CN102550542A (zh) * 2011-08-09 2012-07-11 臻景生物技术（上海）有限公司 用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立
CN102634482A (zh) * 2012-01-13 2012-08-15 成都美进生物科技有限公司 一种间充质干细胞的无血清完全培养基
CN103013911A (zh) * 2012-11-30 2013-04-03 陆华 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法
CN103396990A (zh) * 2013-08-22 2013-11-20 顺昊细胞生物技术（天津）有限公司 一种制备间充质干细胞的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101760445B (zh) * 2010-02-11 2013-07-10 中国人民解放军总医院 自体骨髓间充质干细胞的扩增方法
CN103013913A (zh) * 2012-11-30 2013-04-03 陆华 酶消化法联合egf培养人羊膜间充质干细胞的方法
CN103784474B (zh) * 2014-01-26 2015-05-06 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用
CN105062967A (zh) * 2015-09-01 2015-11-18 沈慧勇 一种人骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用
CN105238746A (zh) * 2015-09-21 2016-01-13 深圳华毓造血干细胞研究有限公司 骨髓间充质干细胞的诱导方法及其诱导液
CN105154395B (zh) * 2015-09-28 2018-09-28 丛秀丽 一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法
CN105505865A (zh) * 2015-12-15 2016-04-20 天津市康婷生物工程有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101412985A (zh) * 2007-10-15 2009-04-22 华东理工大学 用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
CN101270349A (zh) * 2008-03-20 2008-09-24 浙江大学 胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法
CN101629165A (zh) * 2009-07-24 2010-01-20 中国人民解放军海军总医院 脐带华通胶间充质干细胞的制备方法及其产品
CN102550542A (zh) * 2011-08-09 2012-07-11 臻景生物技术（上海）有限公司 用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立
CN102634482A (zh) * 2012-01-13 2012-08-15 成都美进生物科技有限公司 一种间充质干细胞的无血清完全培养基
CN103013911A (zh) * 2012-11-30 2013-04-03 陆华 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法
CN103396990A (zh) * 2013-08-22 2013-11-20 顺昊细胞生物技术（天津）有限公司 一种制备间充质干细胞的方法

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109042625A (zh) * 2018-08-01 2018-12-21 广州润虹医药科技股份有限公司 一种冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用
CN109112102A (zh) * 2018-09-03 2019-01-01 丰泽康生物医药（深圳）有限公司 一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法
CN109321521A (zh) * 2018-10-25 2019-02-12 西北农林科技大学 永生化的犬脂肪间充质干细胞的体外培养方法及其用途
CN109566600A (zh) * 2018-12-29 2019-04-05 中国医学科学院整形外科医院 一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法
CN109929800A (zh) * 2019-03-09 2019-06-25 和携科技(北京)有限公司 一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法
CN109957542A (zh) * 2019-03-09 2019-07-02 和携科技(北京)有限公司 一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法
CN109938010A (zh) * 2019-03-20 2019-06-28 江苏瑞思坦生物科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞运输液及其制备方法
CN111849880A (zh) * 2020-06-23 2020-10-30 和携科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法
CN111849880B (zh) * 2020-06-23 2022-04-29 和携科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法
CN113416694A (zh) * 2021-07-21 2021-09-21 江苏瑞思坦生物科技有限公司 一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法
CN114591902A (zh) * 2022-03-30 2022-06-07 深圳市茵冠生物科技有限公司 间充质干细胞的培养方法及应用
CN114591902B (zh) * 2022-03-30 2024-03-22 深圳市茵冠生物科技有限公司 间充质干细胞的培养方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019161591A1 (zh) 2019-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108315296A (zh) 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法
CN106754674B (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
CN108456655A (zh) 间充质干细胞悬浮液及其制备方法与应用
CN111542350B (zh) 用于制备脂肪来源干细胞的系统和方法
CN107236701B (zh) 干细胞外泌体的分离方法
CN107746829B (zh) 一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法
CN100384987C (zh) 一种三维条件下扩增造血干细胞的方法
US9173903B2 (en) Fluid associated with adult stem cells for medical, cosmetic, and veterinary use
US20180155691A1 (en) Mechanical apparatus and method for isolating stromal vascular fraction
CN108192862A (zh) 一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用
CN112342190A (zh) 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用
CN103184188A (zh) 中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法
CN107022648A (zh) 一种细胞资源储存服务方法
CN104031881A (zh) 一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法
CN105147722A (zh) 硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂
CN107937334A (zh) 一种细胞因子提取物及其应用
CN107881144A (zh) 一种真皮成纤维细胞规模化生产系统
CN111172106B (zh) 一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法
US20220112467A1 (en) Closed-system method and kit of disposable assemblies for isolating mesenchymal stromal cells from lipoaspirate
RU2695364C1 (ru) Способ лечения нерубцовой алопеции
CN106967683A (zh) 培养多能造血干细胞的方法
CN115717122A (zh) 一种提取小鼠主动脉成纤维细胞的方法
CN114457009A (zh) 一种干细胞提取物的制备方法及其应用
CN106591221B (zh) 人静脉内皮细胞的分离和体外扩增方法
CN113604428A (zh) 一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination