CN103013911A - 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents
贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：UC-MSCs的分离，UC-MSCs的原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs的冻存和复苏，以及UC-MSCs细胞免疫表型的检测。本发明采用贴壁密度梯度法，加入4ng/ml表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)，所述的贴壁密度梯度法联合EGF具有操作简单，快速实用等优点，是一种较为有效的分离纯化UC-MSCs的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，特别涉及一种采用贴壁密度梯度法联合表皮生长因子(EGF)培养人脐带间充质干细胞的方法。
背景技术
脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，外被羊膜、内含分化的粘液性结缔组织，结缔组织内除闭锁的卵黄囊和尿囊外，还有脐动脉和脐静脉。脐血管周围被粘蛋白样组织所包裹，被称为脐带胶质或华尔通胶(Wharton’s jelly，WJ)，它富含透明质酸，形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构，含有造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞。华尔通胶间充质干细胞则是来源于脐带华尔通胶组织。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)无免疫排斥性，一定诱导条件下能分化成肝细胞，成骨细胞及神经元细胞等，安全无病毒感染风险以及不受伦理和法律限制等优势，使其有可能成为今后临床应用更为理想的种子细胞。由于脐带华尔通胶组织中UC-MSCs的含量较低，无法满足作为细胞治疗或组织工程种子细胞所需的细胞量，因此有必要建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化UC-MSCs的方法。
发明内容
为了建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化UC-MSCs的方法，本发明提供一种采用贴壁密度梯度法，加入表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得了纯度和活性较高人脐带华尔通胶间充质干细胞。
为达到本发明的目的，本发明的贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法包括如下步骤：UC-MSCs的分离，UC-MSCs的原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs的冻存和复苏，以及UC-MSCs细胞免疫表型的检测。
其中，所述UC-MSCs的分离步骤包括：无菌条件下，将胎儿脐带浸入PBS中，4℃保存；在超净台内从培养基中取出脐带，用含有双抗和两性霉素的D-Hanks液充分冲洗脐带冲去脐静脉及动脉内的残存积血；撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm3大小的组织块，将组织块移至内含一磁力搅拌子的玻璃瓶中，加入胶原酶，37℃下持续磁力搅拌下消化30分钟；向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的胎牛血清终止消化；消化产物先后经100目及200目的细胞筛过滤，去除未消化的组织，收集滤液；
所述UC-MSCs的原代培养步骤包括：将脐带细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500rpm旋转15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20％FBS，4ng/mlEGF的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×106细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞。
所述UC-MSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代培养细胞贴壁生长至80-90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1∶2-1∶3比例传代培养；置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代UC-MSC；待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增。
所述UC-MSCs细胞免疫表型的检测步骤包括：取培养第2或第3代细胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml；分别加入鼠抗人单克隆抗体，置4℃孵育半小时，PBS洗1次，进行流式细胞仪检测分析。
优选的，所述UC-MSCs的传代培养与扩增步骤中，培养体系为20％FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液。
再优选的，所述UC-MSCs的冻存和复苏步骤中的冻存步骤包括：取出所需试剂，配制冻存液，每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMSO150ul，置于冰上预冷；取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基，用PBS缓冲液清洗两次后，吸弃洗液；每瓶中加入胰酶-EDTA工作液，浸漫覆盖瓶底，放入37℃孵箱中2-3分钟；在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入胎牛血清中止胰蛋白酶消化；每瓶中加入完全培养液，反复吹打，用微量加样枪吸出少许用做细胞计数；将细胞悬液移入离心管中，1000rpm离心5分钟，离心结束，吸弃上清；向离心管中加入人AB血清，充分混匀，待用；将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4℃冰箱30分钟后迅速移入到-80℃，24小时后，移入液氮中，进行长期保存。
再优选的，所述UC-MSCs的冻存和复苏步骤中的复苏步骤包括：取出所需试剂，平衡至室温，准备37℃水浴备用；从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，立即于37℃水浴中迅速融化；用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖；在超净台内将冻存管内的细胞移入到无菌离心管内，缓慢逐滴加入DMEM/F12培养液，轻轻混匀；，1000rpm离心5分钟，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液；置5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱重新培养。
本发明采用贴壁密度梯度法联合EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，贴壁培养和消化时间控制相结合，具有操作简单，快速，实用等优点，不失为一种较为有效的分离纯化方法。
附图说明
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：
图1所示为本发明的贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法步骤流程图。
具体实施方式
具体的，如图1所示的本发明的一实施例的贴壁密度梯度法联合表皮生长因子(EGF)培养人脐带间充质干细胞的方法步骤流程图，所述方法具体包括以下步骤：
Sl、人脐带华尔通胶间充质干细胞(UC-MSCs)的分离：
1)无菌条件下，将剖宫产足月妊娠健康胎儿的脐带10cm，浸入0.01mol/L PBS中，4℃保存；超净台内从培养基中取出脐带，含有1％双抗和250ug/mL两性霉素的D-Hank’s液充分冲洗脐带外表面，并用20mL注射器分别插入两根脐静脉及一根脐动脉内反复冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存积血；
2)撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm3大小的组织块，将组织块(约30-40ml)移至内含一磁力搅拌子的100mL玻璃瓶中，加入0.2％胶原酶II30-40mL(终浓度约为0.1％)，37℃，持续磁力搅拌下消化30分钟；
3)向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)终止消化；
4)消化产物先后经100目及200目的细胞筛过滤，去除未消化的组织，收集滤液；
S2、UC-MSCs的原代培养：
1)将脐带细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm×15分钟离心，弃上清，收集细胞；
2)将收集的细胞用0.01M PBS30mL吹打成均匀悬液，1500rpm×15分钟洗涤2次，收集细胞；
3)接种细胞前吸取FBS3mL加入T75cm2型细胞培养瓶，置37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；
4)弃包被液，用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；
5)调整细胞浓度为1.0×106细胞/ml，接种于包被后的T75cm2型细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；
6)培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞。
本步骤中，首先应用高密度贴壁细胞培养1×107/ml，原代细胞聚集成团块状，团块中可形成少量克隆球，但克隆球生长缓慢。原代培养24-48小时后，可见细胞从组织块中爬出，围绕在组织块周围，呈放射状向外生长。UC-MSC呈贴壁生长，悬浮细胞可经过多次换液去除，细胞逐渐得以纯化。培养5d后后吸出部分细胞改为1×106/ml培养，克隆球形成和生长明显增快。首次换液发现，每高倍镜视野(倒置显微镜×100倍)下大约有200个细胞贴壁，其中处于有丝分裂期的极强折光性大细胞平均大约有5个，少数散在的贴壁细胞出现分化现象；培养1周时倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，增长速度较快。2周时极强折光性大细胞数量增多，至每高倍视野下大约有20个，成为形态相对均一的梭形细胞，呈放射状排列生长或旋涡状生长，多数贴壁未分裂的原代细胞和分化细胞开始脱落死亡，此时经多次换液去除悬浮细胞，细胞密度由1×107/ml降至1×104/ml左右，无细胞聚集现象；第2-3周可形成80％融合的的单层贴壁细胞层，3周时已经有极强折光性大细胞开始形成紧密小克隆球(大约5～20个细胞组成，直径约40～60μm)；4周时已有大量大小不等的克隆球形成，许多大克隆球(直径大于200μm)已脱壁悬浮生长。
S3、UC-MSCs的传代培养与扩增：
1)观察原代培养细胞贴壁生长至80-90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml 0.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；
2)加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起；
3)加入1.0ml FBS中止胰酶消化；
4)加入10ml 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm×10分钟离心；
5)弃去上清液，加入10ml DMEM/F12重悬细胞，按1∶2-1∶3比例传代培养；
6)培养体系为20％FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶。置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代(passage l，P1)UC-MSC：
7)待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增。
当细胞贴壁生长至80-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，按1∶2-1∶3的比例传代。传代细胞于接种后3-6小时迅速贴壁，最初为短粗的梭形或卵圆形。在接种的第2天，细胞伸展为长梭形或多角状，体积较大，细胞均匀分布。传代后细胞增殖速度明显加快，在接种后第2-3天增长趋势最为显著，数量明显增多，生长较均匀一致。传代后3-4天时，细胞长满培养瓶底，融合成片状，低倍镜下细胞排列紧密，整齐有序，出现漩涡样结构，杂质细胞已明显少见。
S4、UC-MSCs的冻存和复苏：
1、UC-MSCs的冻存，具体操作步骤为：
1)取出所需试剂，配制冻存液。每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMSO150ul，置于冰上预冷。在冻存管上详细标记细胞情况，如种类、代数以及冻存时间等；
2)取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基。用20mlPBS缓冲液轻轻清洗两次后，吸弃洗液：
3)每瓶中加入0.25％胰酶-0.04％EDTA工作液1ml，浸漫覆盖瓶底，放入37℃孵箱中2-3分钟；
4)在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入1.0ml胎牛血清中止胰蛋白酶消化。如果细胞不易飘起，可用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞完全消化下来；
5)每瓶中加入完全培养液20ml，反复吹打。用微量加样枪吸出少许用做细胞计数。
6)将细胞悬液移入50ml离心管中，离心1000rpm×5分钟，离心结束，吸弃上清。
7)向离心管中加入1.0ml人AB血清，充分混匀，待用。
8)将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4℃冰箱30分钟后迅速移入到-80℃。
9)24小时后，移入液氮中，进行长期保存。
2、UC-MSCs的复苏，具体操作为：
1)取出所需试剂，平衡至室温。准备370C水浴备用；
2)从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，确认后立即于37℃水浴中迅速融化；
3)用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖；
4)在超净台内将冻存管内的细胞移入到50ml无菌离心管内。缓慢逐滴加入20mlDMEM/F12培养液，轻轻混匀，尽量不要产生气泡；
5)离心，1000rpm×5分钟，弃上清；
6)加入10ml DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液至15ml。置5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱重新培养；
7)在培养瓶上标记细胞相关信息，如种类、代数以及复苏时间等。
S5、UC-MSCs细胞免疫表型的检测：
取培养第2或第3代细胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置4℃孵育半小时，PBS洗1次，进行流式细胞仪检测分析。流式细胞仪检测显示，BMSCs表达CD29、CD44和CD105，不表达CD34、CD45、CD19、HLA-DR和CD106。
本发明采用贴壁密度梯度法，加入4ng/ml表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人脐带华尔通胶间充质干细胞。根据UC-MSCs贴壁生长的特点，培养2-3天后可见UC-MSCs基本贴壁，因此在原代培养末期即可以获得均一性较好的UC-MSCs。实验同时发现，尽管使用了贴壁密度梯度法，在原代培养体系中仍然存在一些造血系细胞，这些细胞在加入4ng/ml EGF后大部分不能贴壁，随换液而被去除，UC-MSCs具有成纤维细胞生长的特点，体积小，呈梭形，核浆比大，体外增殖迅速，生长状态稳定，而且随着换液次数和传代次数的不断增加，细胞纯度不断增加，均质性不断提高，细胞呈均匀有序的成纤维细胞样，随着传代次数的增加，细胞的增殖速度未见明显下降，细胞的均一性经过传代培养明显提高。我们采用贴壁密度梯度法联合EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，贴壁培养和消化时间控制相结合，具有操作简单，快速，实用等优点，不失为一种较为有效的分离纯化方法。
本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
Claims (4)
1.一种贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：UC-MSCs的分离，UC-MSCs的原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs的冻存和复苏，以及UC-MSCs细胞免疫表型的检测；其中，
所述UC-MSCs的分离步骤包括：无菌条件下，将胎儿脐带浸入PBS中，4℃保存；在超净台内从培养基中取出脐带，用含有双抗和两性霉素的D-Hanks液充分冲洗脐带冲去残存积血；撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm3大小的组织块，将组织块移至内含一磁力搅拌子的玻璃瓶中，加入胶原酶，37℃下持续磁力搅拌下消化30分钟；向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的胎牛血清终止消化；消化产物先后经100目及200目的细胞筛过滤，去除未消化的组织，收集滤液；
所述UC-MSCs的原代培养步骤包括：将脐带细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500rpm旋转15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20％FBS，4ng/mlEGF的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×106细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次；观察细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞；
所述UC-MSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代培养细胞贴壁生长至80-90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1∶2-1∶3比例传代培养；置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代UC-MSC；待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增；以及
所述UC-MSCs细胞免疫表型的检测步骤包括：取培养第2或第3代细胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml；分别加入鼠抗人单克隆抗体，置4℃孵育半小时，PBS洗1次，进行流式细胞仪检测分析。
2.如权利要求1所述的贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的UC-MSCs的传代培养与扩增步骤中，培养体系为20％FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液。
3.如权利要求1所述的贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述UC-MSCs的冻存和复苏步骤中的冻存步骤包括：取出所需试剂，配制冻存液，每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMSO150ul，置于冰上预冷；取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基，用PBS缓冲液清洗两次后，吸弃洗液；每瓶中加入胰酶-EDTA工作液，浸漫覆盖瓶底，放入37℃孵箱中2-3分钟；在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入胎牛血清中止胰蛋白酶消化；每瓶中加入完全培养液，反复吹打，用微量加样枪吸出少许用做细胞计数；将细胞悬液移入离心管中，1000rpm离心5分钟，离心结束，吸弃上清；向离心管中加入人AB血清，充分混匀，待用；将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4℃冰箱30分钟后迅速移入到-80℃，24小时后，移入液氮中，进行长期保存。
4.如权利要求1所述的贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述UC-MSCs的冻存和复苏步骤中的复苏步骤包括：取出所需试剂，平衡至室温，准备37℃水浴备用；从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，立即于37℃水浴中迅速融化；用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖；在超净台内将冻存管内的细胞移入到无菌离心管内，缓慢逐滴加入DMEM/F12培养液，轻轻混匀；，1000rpm离心5分钟，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液；置5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱重新培养。
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