CN111603482A

CN111603482A - 一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物及制备方法

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Publication number: CN111603482A
Application number: CN202010470634.9A
Authority: CN
Inventors: 高连如; 张宁坤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2020-09-01

Abstract

本发明公开一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其含有脐带疏松结缔组织间充质干细胞LCMSCs，所述LCMSCs为从新生儿脐带内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织中提取未分化的原始间充质干细胞，所述LCMSCs是胚外中胚层来源的原始未分化的间充质干细胞。LCMSCs最大限度地保存了原始MSCs生物学特性，其归巢迁移、分化增殖潜力远较成体来源MSCs更强，集落形成单位是骨髓源MSCs的300倍，分泌的生长因子、营养因子最丰富，分泌的肝细胞生长因子是BMSCs的31.3倍，能突出表达多种抑癌基因，体外与多种肿瘤细胞共培养无肿瘤细胞分化，无体内成纤维瘤样分化，可高表达免疫调节因子HGF、TSG‑6、PGE2、MCP1、VEGFA、IL‑6、IL‑10、IDO、TGF‑β、sVCAM1等，纯度远优于成体及脐带、胎盘、羊膜等来源的MSCs，安全性高。

Description

一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物及制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物及制备方法。

背景技术

当前缺血性心脏病、脑卒中、糖尿病、多种免疫性疾病及退行病等发病率、致残率、死亡率仍居高不下。新冠肺炎(COVID-2019)所致的严重肺损伤导致呼吸衰竭(ARDS)已夺去了数以万计人的生命。这是因为目前医学领域还缺乏针对上述疾病的特异有效且副作用小的治疗手段。上述疾病对现代医学提出了巨大的挑战。

近年来，大量科学证据表明，具有多向分化及自我更新的间充质干细胞(MSCs)通过其旁/自分泌效应，发挥着免疫调节、抗炎症、再生血管、修复组织等作用，在冠心病、心肌梗死、心力衰竭、脑卒中、老年痴呆、多种自身免疫性疾病、骨关节疾病等的临床硏究中已显示了良好的效果与前景。尤其是，在近期COVID-2019疫情中，面对细胞因子风暴所致的大面积肺损伤坏死渗出，激素应用受到一定限制的情况下，具有独特免疫调节功能的MSCs发挥了重要的抗炎症、抑制过度免疫应激、修复肺组织、恢复肺表面活性物质等，起到了重要作用。

然而，大量科学研究证据表明，不同组织来源的MSCs(mesenchymal stem cells)其生物学特性与功能存在显著差异。如成体组织来源的MSCs增殖能力及分化潜能会随年龄增长和疾病内环境影响而下降。尤其值得注意的是，还有研究报道，在体内外研究中发现成体组织来源的MSCs在一定条件下可分化为成纤维瘤样细胞。

近来一些研究者从新生儿脐带、脐血、胎盘、羊膜等组织中分离出异体来源的MSCs，但发现脐血中MSCs含量少，而从脐带、胎盘、羊膜分离的MSCs中混入的其它杂质细胞高达50-70％左右，严重影响了MSCs的归巢、增殖、旁/自分泌功能、及治疗效果与安全性。因此，如何制备既具原始特性又具有较高纯度的MSCs，对适应临床硏究与应用需求显得十分重要。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其所含的间充质干细胞为从新生儿脐带内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织中提取的未分化的原始间充质干细胞LCMSCs(loose connective mesenchymal stemcells)。该原始间充质干细胞LCMSCs最大限度地保存了原始MSCs生物学特性，具有高表达多种抑癌基因、无向瘤细胞分化风险、安全可靠的优点。

本发明还包括间充质干细胞药物的制备方法，具体为先提取内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织，对该疏松结缔组织采用连贯阶梯式培养法，获得未分化的原始间充质干细胞LCMSCs，以该原始间充质干细胞LCMSCs制备成免疫调节药物，如注射液等。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一方面，本发明提供一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其含有脐带疏松结缔组织间充质干细胞(LCMSCs)，所述LCMSCs为从新生儿脐带内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织中提取的未分化的原始间充质干细胞，该间充质干细胞是胚外中胚层来源的原始未分化的间充质干细胞，也是胚胎早期遗存在疏松结缔组织中的原始未分化MSCs。

根据本发明较佳实施例，所述药物为注射液，该注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的浓度为0.9-1.1％。

根据本发明较佳实施例，所述注射液的规格为2mL/管，每管中细胞总数量为(1.9～2.1)×10⁷。通常在细胞使用时，按照人的体重计算，60公斤使用6×10⁷的细胞数量，每管含约2×10⁷细胞数量恰可取用三管，且根据体重的增减使用细胞的数量易于增减。为了使用细胞时注射器抽取顺畅，约2×10⁷左右的细胞数量在2mL体积里属于恰当浓度，细胞浓度过高或过低均给使用和操作带来不便。注射液以生理盐水配制。

根据本发明较佳实施例，所述LCMSCs的纯度为：所述LCMSCs中，代表LCMSCs纯度的CD24+～CD108+细胞的百分比达70％以上，代表LCMSCs中杂质细胞的CD40+细胞占百分比≤20％。

本发明的间充质干细胞注射液，于液氮中低温保存备用，或4-8℃运输即刻应用。

另一方面，本发明还提供一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物的制备方法，其包括间充质干细胞的制备和药物的制备，所述间充质干细胞的制备过程包括：剥离脐带内疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织采用连贯阶梯式培养法培养，该连贯阶梯式培养法包括结缔组织培养、细胞传代扩增培养、3D培养和低氧培养。

根据本发明的较佳实施例，所述间充质干细胞的制备过程包括如下步骤：

S1:剥离脐带内疏松结缔组织：

所述疏松结缔组织为体蒂分化的黏液性结缔组织，包括脐带动脉、静脉周围，脐带动静脉之间的黏液性结缔组织；

S2:连贯阶梯式培养法获得原始LCMSCs，具体包括：

S21:组织培养：将剥离下来的疏松结缔组织，剪成细块状，放入无菌培养瓶中贴壁培养，加入无血清细胞培养基，在35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养；

S22:传代扩增培养：待细胞铺满瓶底80％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶消化0.5-2分钟，待细胞收缩后加入无血清细胞培养基终止消化，形成细胞悬液，把细胞悬液移入离心管中，在(100-200)g下离心，弃上清，再加入无血清细胞培养基混匀，计数，按照每个底面积75cm²培养瓶接种0.75-0.85×10⁶细胞的浓度接种到新的无菌细胞培养瓶中，放置在35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养3-4天；

S23:3D培养：待细胞铺满瓶底90％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.120～130％胰蛋白酶消化0.5-2分钟，待细胞收缩后加入基无血清细胞培养基终止消化，形成细胞悬液，把细胞悬液移入离心管中，在(100-200)g下离心，离心后弃上清，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的细胞培养瓶中加入水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入无血清细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养；3D培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入35-37℃PBS并放置于35-37℃水浴中，40-60min后水凝胶分解形成细胞悬液，混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，(100-200)g离心力离心10-20min，弃上清；

S24:低氧培养：经3D培养后的细胞加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×10⁵，加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)×10⁶，先将细胞培养瓶放入35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为4-6％、35-37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养8-15h。

根据本发明的较佳实施例，在步骤S24中，还包括LCMSCs表面标志鉴定步骤，即：采用流式细胞仪检测LCMSCs共同标志表达CD73、CD90、CD44、CD105、HLA-ABC，且不表达CD34、CD45、CD80、CD86、HLA-DR的细胞为LCMSCs。

根据本发明的较佳实施例，在步骤S24中，还包括LCMSCs的纯度分析步骤，即：将洗涤的低氧培养后的LCMSCs加入到PBS中充分混匀，在(100-200)g离心力离心，弃上清，将细胞沉淀，加入PBS把细胞重悬，将细胞平均分成6管(分成两组，每组3管)，每管0.5ml并将细胞悬液放置于流式管中；

在其中3管细胞悬液中分别加入荧光标记CD24+、CD108+和CD40+抗体25ul孵育30分钟，此为检测组；在另外3管细胞悬液中加入PBS25ul孵育30分钟，此为空白组；将以上各管细胞悬液以(100-200)g离心力离心5min，弃上清，每管中加入0.5mL BPS重悬细胞，流式细胞仪分别检测CD24+-CD108+和CD40+细胞百分比，经流式细胞仪检测LCMSCs表面CD24+、CD108+均在70％以上，表明LCMSCs纯度较高，经流式细胞仪检测细胞表面CD40+不超过20％，表明杂细胞较少。

本发明用于制备药物的LCMSCs，其中代表LCMSCs纯度的CD24+～CD108+细胞的百分比达70％以上，代表LCMSCs中杂质细胞的CD40+细胞占百分比≤20％为合格。

根据本发明的较佳实施例，所述药物为注射液，该注射液的制备过程为：将通过安全性检测LCMSCs，加入到含质量浓度为0.9-1.1％的人血白蛋白的生理盐水溶液中，制成每2ml含有(1.9-2.1)×10⁷个LCMSCs细胞数量的注射液。制备完成后，灌装、密封，液氮保存备用；或4-8℃运输保存，12小时内应用，此为通用型LCMSCs注射液。加入人血白蛋白，作用之一是保证细胞间电荷平衡，防止细胞的聚集，其二是给生理盐水中的细胞提供适当的营养，维持细胞活性。

根据本发明的较佳实施例，所述间充质干细胞的制备过程还包括：

步骤S3：LCMSCs免疫调节分子(因子)分泌水平鉴定：通过ELISA方法检测LCMSCs培养上清中细胞分泌因子，来鉴定LCMSCs免疫调节分子(因子)分泌水平，方法如下：

(1)制备LCMSCs培养上清：取LCMSCs的培养第2代培养3天细胞融合达到90％后的细胞用10ng/mL IFN-γ和1ng/mL TNF-a及缺氧处理8-24h后的细胞培养上清；

(2)包被孔板：用0.05M PH9牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗2-4次，每次2-4分钟；

(3)加样：在孔板中加所述的细胞培养上清0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔和阳性对照孔；

(4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；

(5)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟，酶联免疫仪检测吸光度值。

检测指标包括：肝细胞生长因子(HGF)，肿瘤坏死因子激活基因-6蛋白(TSG-6)，前列腺素E-2(PGE-2)，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，白介素-6(IL-6)，白介素-10(IL-10)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，转化生长因子-β(TGF-β，可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM1)等因子的分泌水平。

步骤S4:通过基因微阵列比较LCMSCs与胚胎干细胞(ESCs)的原始干性分析，即：从LCMSCs和ESCs中提取RNA，使用Trizol试剂从三种不同的LCMSCs和hESCs中提取总RNA，使用纯化试剂盒进一步纯化RNA，采用甲醛琼脂糖凝胶电泳定量分光光度法测定RNA质量。

该步骤的具体方法为：采用微阵列分析，从LCMSCs和ESCs中提取RNA，从三个不同的样品提取的总RNA大于2μg，用提取的总RNA合成双链cDNA，然后产生使用MessageAmpTM生物素标记的cRNA，产生的生物标记的cRNA被分割成35-200个长度的碱基，片段化的cRNA与包含47000个转录本的人类基因组U133+2.0阵列杂交，杂交在45℃条件下进行，旋转16小时，基因芯片阵列在液体工作站450上清洗并使用链霉亲和素染色，然后在基因芯片扫描仪3000上扫描。所有样品均经至少三次生物重复制备。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

①本发明采用精准组织解剖学定位，选择以脐带内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织为LCMSCs的获取材料，从该疏松结缔组织提取出未分化的原始间充质干细胞LCMSCs(即胚外中胚层来源的原始未分化的间充质干细胞)，来制备本发明的用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，该原始间充质干细胞LCMSCs最大限度地保存了原始MSCs生物学特性，具有高表达多种抑癌基因、无向瘤细胞分化风险、安全可靠的优点。

②本发明使用的原始间充质干细胞LCMSCs，其形态梭形，归巢迁移、分化增殖潜力远较成体来源MSCs更强；其集落形成单位是骨髓源MSCs(BMSCs)的300倍；分泌的生长因子、营养因子最丰富，分泌的肝细胞生长因子是BMSCs的31.3倍；LCMSCs的端粒酶长，细胞基因组稳定，尤其是突出表达多种抑癌基因，体外与多种肿瘤细胞共培养无肿瘤细胞分化，无体内成纤维瘤样分化。通过对LCMSCs基因微振列及qRT-PCR分析，LCMSCs可表达SOX2,NANOG,LIN28,SSEA1,SSEA3,SSEA4,KLF4,c-MYC,CRIPTO,REX1等等多种原始干性基因，且其表达水平均低于ESCs。

③LCMSCs与自体骨髓、脂肪、及新生儿脐带、脐血、胎盘、羊膜等来源MSCs相比较，在单细胞、细胞集落单位的基因、mRNA及蛋白水平方面，显示LCMSCs能高表达及分泌多种免疫调节因子，例如一氧化氮合酶(iNOS)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，肿瘤坏死因子激活基因-6(TSG-6)，转化生长因子-β，肝细胞生长因子(HGF)，前列腺素E-2(PGE-2)等多种因子。LCMSCs可通过旁/自分泌调控固有免疫及获得性免疫，抑制免疫炎症反应。

④本发明的LCMSCs的制备方法是连贯阶梯式培养法，即包括组织细胞培养法、3D培养法、低氧培养，使用于制备本发明药物的LCMSCs中，代表LCMSCs纯度的CD24+～CD108+细胞百分比达70％以上，使代表LCMSCs杂质细胞的CD40+细胞占有百分比≤20％。其MSCs纯度远优于脐带、胎盘、羊膜来源的MSCs(从脐带、胎盘、羊膜分离的MSCs中混入的其它杂质细胞高达50-70％左右)。

⑤本发明含LCMSCs的药物优选为注射液，是在国际、国家细胞生物制剂制备条件准则标准下，经过一系列安全性检测后，将LCMSCs加入含浓度约1％的人血白蛋白生理盐水中，制成浓度约2×10⁷细胞/2ml的注射液。进一步优选以2ml为一个包装单位，于液氮中低温保存备用，或4-8℃运输即刻应用。

附图说明

图1(a)-(b)为3D培养LCMSCs的不同倍数下显微镜照片。

图2为脐带内不同部位/组织来源MSCs表达CD24+、CD108+、CD40+水平；其中AM表示脐带内羊膜，SA表示脐带内羊膜下，PV表示脐带内血管周围，MC表示脐带混合，LC表示脐带内疏松结缔组织。

图3为本发明的LCMSCs免疫调节因子分泌水平鉴定结果；其中，HGF表示肝细胞生长因子，TSG-6表示肿瘤坏死因子激活基因-6蛋白，PGE-2表示前列腺素E-2，MCP1表示单核细胞趋化蛋白1，VEGFA表示血管内皮生长因子A，IL-6表示白介素-6，IL-10表示白介素-10，IDO表示吲哚胺2,3-双加氧酶，TGF-β表示转化生长因子-β，sVCAM1表示可溶性血管细胞黏附分子-1。

图4为LCMSCs与ESCs基因微振列50基因对比图谱。

图5为LCMSCs与ESCs基因微振列的qRT-PCR对比分析结果。

具体实施方式

本发明根据胚胎发育学及组织学理论及与已有的组织来源MSCs的细胞生物学研究对比，采用精准组织解剖学定位，选择以脐带内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织中为LCMSCs的获取材料，从这种疏松结缔组织中提取未分化的原始间充质干细胞，该干细胞正是胚外中胚层来源的原始未分化的间充质干细胞，也是胚胎早期遗存在界面疏松结缔组织中的原始未分化MSCs。

结缔组织是广泛分布于人体，对机体具有支持、连接、防御、保护和营养、修复、维持机体内环境稳定等功能的全身性组织。但本发明取材的结缔组织是起源于人胚胎发育第2周内，由胚外中胚层间充质干细胞分化而来的疏松结缔组织，即胚外内胚层与胚外中胚层组成了卵黄囊，卵黄囊的壁即由胚外中胚层来源的原始间充质干细胞密集形成细胞团，这些细胞团进一步形成了原始造血细胞起源的血岛及血岛周边细胞分化围成的内皮管(即原始血管)，内皮管再不断向外出芽延伸，逐渐形成一个丛状分布的内皮管网，该内皮管网分布于胚体内外的间充质中。此后，随着胚胎发育，卵黄囊被羊膜包入脐带。在胚胎发育第6周，卵黄囊与卵黄蒂逐渐退化，形成了内含体蒂分化的疏松结缔组织包裹着两条脐动脉和一条静脉的结构，该结构为胎儿血与母血进行物质交換的通道与界面组织，这个界面组织正是富含细胞外基质的疏松结缔组织。而从胚胎发育早期就存留在疏松结缔组织中的干细胞，正是胚外中胚层来源的原始未分化的间充质干细胞。

以往人们多注意到整个脐带组织，甚至脐带动静脉周围及羊膜下组织，而没有从组织学上精准定位疏松结缔组织这一特殊结构，导致从整脐带及脐带内非组织定位所提取的间充质干细胞其杂质细胞多。主要是因为这些来源的MSCs并非是胚胎早期遗存在界面疏松结缔组织中的原始未分化MSCs。而本发明的主要创新点在于，精准选择组织来源，从脐带组织中剥离脐带内疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织采用连贯阶梯式培养法培养，最大限度保存了原始MSCs生物学特性，如迁移归巢、增殖、分化、旁/自分泌功能，免疫调节，组织修复特性。最为重要的是，其来源组织是胎儿血与母血进行物质交換的界面组织，是胎儿保护屏障，因而具有高表达多种抑癌基因的特点，此组织来源的MSCs体内外均无向瘤细胞分化，安全可靠。

本发明的基本方案包括：

本发明提供一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其含有脐带结缔组织间充质干细胞(LCMSCs)，所述LCMSCs为从新生儿脐带内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织中提取的未分化的原始间充质干细胞，该间充质干细胞是胚外中胚层来源的原始未分化的间充质干细胞，也是胚胎早期遗存在疏松结缔组织中的原始未分化LCMSCs。

优选地，所述药物为注射液，该注射液中还含有作为细胞营养物质的人血白蛋白，浓度为0.9-1.1％。

优选地，所述注射液的规格为2mL/管，每管中细胞总数量为(1.9～2.1)×10⁷。优选地，注射液采用生理盐水或注射用水配制。

优选地，所述用于制备药物的LCMSCs具有一定纯度要求，即代表LCMSCs纯度的CD24+～CD108+细胞的百分比达70％以上，代表LCMSCs中杂质细胞的CD40+细胞占百分比≤20％。

此外，本发明还提供一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物的制备方法，所述制备方法包括间充质干细胞的制备和药物的制备，其中所述间充质干细胞的制备过程包括：剥离脐带内疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织采用连贯阶梯式培养法培养，该连贯阶梯式培养法包括结缔组织培养、细胞传代扩增培养、3D培养和低氧培养。

优选地，所述间充质干细胞的制备过程包括如下步骤：

S1:剥离脐带内疏松结缔组织：

S2:连贯阶梯式培养法获得原始间充质干细胞LCMSCs，具体包括：

S22:传代扩增培养：传代扩增培养：待细胞铺满瓶底80％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液5ml清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶3ml消化0.5-2分钟，待细胞收缩后加入无血清细胞培养基终止消化，形成细胞悬液，把细胞悬液移入离心管中，在(100-200)g下离心，弃上清，再加入无血清细胞培养基混匀，计数，按照每个底面积75cm²培养瓶接种0.75-0.85×10⁶细胞的浓度接种到新的无菌细胞培养瓶中，放置在35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养3-4天；

S23:3D培养：待细胞铺满瓶底90％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液5ml清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶3ml消化1分钟，待细胞收缩后加入无血清细胞培养基3ml终止消化，形成细胞悬液并混匀，把细胞悬液移入50ml离心管中，100g离心力离心10min，弃上清，此步骤为洗涤细胞，再加入PBS 20mL，混匀细胞，重复上述洗涤步骤再洗涤一遍，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的细胞培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1mL，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况；3D培养6-7天后细胞融合(70-80)％时加入36-37℃PBS 10mL并放置于36-37℃水浴中，40-60min后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，(100-200)g离心力离心10-20min，弃上清；

S24:低氧培养：加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×10⁵，取10mL加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)×10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养8-15h。

优选地，所述药物为注射液，制备过程为：将通过安全性检测LCMSCs，加入到含质量浓度为0.9-1.1％的人血白蛋白的生理盐水溶液中，制成每2ml含有(1.9-2.1)×10⁷个LCMSCs细胞数量的注射液。

优选地，在步骤S23中还包括LCMSCs表面标志鉴定、LCMSCs的纯度分析。

此外，本发明还进一步对制备得到的LCMSCs,鉴定其免疫调节分子分泌水平，检测指标包括：肝细胞生长因子(HGF)，肿瘤坏死因子激活基因-6蛋白(TSG-6)，前列腺素E-2(PGE-2)，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，白介素-6(IL-6)，白介素-10(IL-10)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，转化生长因子-β(TGF-β，可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM1)等因子分泌水平。

最后，本发明进一步采用基因微阵列，比较LCMSCs与胚胎干细胞(ESCs)的原始干性，实时定量PCT(qRT-PCR)分析LCMSCs与胚胎干细胞(ESCs)的原始干性。

上述分析结果显示：

(1)本发明制备的LCMSCs，其形态梭形，归巢迁移、分化增殖潜力远较成体来源MSCs更强；其集落形成单位是骨髓源MSCs(BMSCs)的300倍；分泌的生长因子、营养因子最丰富，分泌的肝细胞生长因子是BMSCs的31.3倍；LCMSCs的端粒酶长，细胞基因组稳定，尤其是突出表达多种抑癌基因，体外与多种肿瘤细胞共培养无肿瘤细胞分化，无体内成纤维瘤样分化。通过对LCMSCs基因微振列及qRT-PCR分析，LCMSCs可表达SOX2,NANOG,LIN28,SSEA1,SSEA3,SSEA4,KLF4,c-MYC,CRIPTO,REX1等等多种原始干性基因，且其表达水平均低于ESCs。

(2)本发明制备的LCMSCs，与自体骨髓、脂肪、及新生儿脐带、脐血、胎盘、羊膜等来源MSCs相比较，在单细胞、细胞集落单位的基因、mRNA及蛋白水平方面，显示LCMSCs能高表达及分泌多种免疫调节因子，例如一氧化氮合酶(iNOS)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，肿瘤坏死因子激活基因-6(TSG-6)，转化生长因子-β，肝细胞生长因子(HGF)，前列腺素E-2(PGE-2)等多种因子。LCMSCs可通过旁/自分泌调控固有免疫及获得性免疫，抑制免疫炎症反应。

(3)本发明制备的LCMSCs，其纯度远优于脐带、胎盘、羊膜来源的MSCs。

为了更好的解释本发明，下面结合附图并通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

脐带组织来源：在三级医院选取孕检合格的产妇，检查合格项目包括：HIV(艾滋病病毒)，HBV(乙肝病毒)，HCV(丙肝病毒)，HTLV(人类嗜T细胞病毒)，EBV(EB病毒)，CMV(巨细胞病毒)等的感染，无梅毒螺旋体感染，肝、肾功能正常，CEA癌胚抗原阴性。

产妇的生产方式为剖腹产，无菌提取该剖腹产产妇脐带，置于磷酸盐缓冲液中，运送到细胞处理室，所有操作均在无菌环境下操作，洗去脐带表面的血迹，手术剪将脐带剪成4cm小段，加入生理盐水洗涤血凝块。应用组织剝离技术，用眼科剪剪开脐带被覆羊膜，用眼科镊撕取体蒂分化的黏液性结缔组织，包括脐带动脉、静脉周围，脐带动静脉之间的黏液性结缔组织。

LCMSCs的制备方法，具体包括如下步骤：

1、组织贴壁培养：将剥离下来的疏松结缔组织，放入无菌平皿中，使用眼科剪将疏松结缔组织剪成1立方毫米以下块状，放入底面积是75平方厘米无菌培养瓶中贴壁培养，加入15ml无血清细胞培养基，37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。

2、传代扩增培养LCMSCs：待细胞铺满瓶底80％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液5ml清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶3ml消化1分钟，待细胞收缩后加入无血清细胞培养基3ml终止消化，形成细胞悬液，并用移液管抽吸混匀，把细胞悬液移入50ml离心管中，100g离心力离心10min，弃上清，再加入无血清细胞培养基用移液管抽吸混匀，计数，按照每个底面积75cm²培养瓶接种0.8×10⁶细胞的浓度接种到新的无菌细胞培养瓶中，将培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天。

3、3D培养：待细胞铺满瓶底90％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液5ml清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶3ml消化1分钟，待细胞收缩后加入无血清细胞培养基3ml终止消化，形成细胞悬液，并用移液管抽吸混匀，把细胞悬液移入50ml离心管中，100g离心力离心10min，弃上清，此步骤为洗涤细胞，再加入PBS20mL，混匀细胞，重复上述洗涤步骤再洗涤一遍，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的细胞培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1mL，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。3D培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入36-37℃PBS 10mL并放置于36-37℃水浴中，40-60min后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，(100-200)g离心力离心10-20min，弃上清，进入下一工序。

4、LCMSCs低氧培养：经3D培养后的细胞加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×10⁵，取10mL加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)×10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后进入下一工序。通过低氧培养，提高细胞耐性、活性和生存能力。

经上述组织贴壁培养、传代扩增培养LCMSCs、3D培养、LCMSCs低氧培养后，得到的LCMSCs在不同倍数下放大观察，如图1所示，形态为梭形。

5、流式细胞仪检测LCMSCs共同标志表达CD73、CD90、CD44、CD105、HLA-ABC，不表达CD34、CD45、CD80、CD86、HLA-DR。

将洗涤的低氧培养后的LCMSCs加入PBS充分混匀，(100-200)g离心力离心5min，弃上清，将细胞沉淀，加入PBS把细胞重悬，将细胞平均分成20管，每管0.5ml并将细胞悬液放置于流式管中。

在其中10管细胞悬液中分别加入荧光标记抗体(CD73、CD90、CD44、CD105、HLA-ABC、CD34、CD45、CD80、CD86、HLA-DR)25ul孵育30分钟，此为检测组。在另外10管细胞悬液中加入PBS25ul孵育30分钟，此为空白组。再将以上各管以(100-200)g离心力离心5min，弃上清，每管中加入0.5mL BPS重悬细胞，流式细胞仪分别检测CD73、CD90、CD44、CD105、HLA-ABC、CD34、CD45、CD80、CD86、HLA-DR细胞百分比，经流式细胞仪检测，LCMSCs表达CD73、CD90、CD44、CD105、HLA-ABC，不表达CD34、CD45、CD80、CD86、HLA-DR，表明LCMSCs符合间充质干细胞的特性。

6、LCMSCs纯度检测：将洗涤的低氧培养后的LCMSCs加入PBS充分混匀，(100-200)g离心力离心5min，弃上清，将细胞沉淀，加入PBS把细胞重悬，将细胞平均分成6管，每管0.5ml并将细胞悬液放置于流式管中。在其中3管细胞悬液中分别加入荧光标记CD24+、CD108+和CD40+抗体25ul孵育30分钟，此为检测组；在另外3管细胞悬液中加入PBS25ul孵育30分钟，此为空白组。再将以上各管以(100-200)g离心力离心5min，弃上清，每管中加入0.5mL PBS重悬细胞，流式细胞仪分别检测CD24+-CD108+和CD40+细胞百分比，经流式细胞仪检测LCMSCs表面CD24+、CD108+均大于70％，表明LCMSCs纯度较高，经流式细胞仪检测细胞表面CD40+低于20％，表明杂细胞较少(纯度检测结果如图2)。

7、LCMSCs免疫调控分子分泌水平鉴定，具体包括如下步骤：

(1)ELISA方法检测LCMSCs培养上清中细胞分泌因子：取LCMSCs的培养第2代培养3天细胞融合90％后的细胞用10ng/mL IFN-γ和1ng/mL TNF-a及缺氧处理24h后的细胞培养上清，用ELISA方法分别检测：肝细胞生长因子(HGF)，肿瘤坏死因子激活基因-6蛋白(TSG-6)，前列腺素E-2(PGE-2)，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，白介素-6(IL-6)，白介素-10(IL-10)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，转化生长因子-β(TGF-β)，可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM1)等因子分泌水平。

(2)具体方法如下：

包被孔板：用0.05M PH9牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

加样：在孔板中加细胞上清液0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔和阳性对照孔。

加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟，终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

结果判定：在ELISA检测仪上检测OD值，于450nm处，以空白对照孔调零后检测各孔OD值，减空白对照后计算LCMSCs培养上清中细胞分泌的肝细胞生长因子(HGF)，肿瘤坏死因子激活基因-6蛋白(TSG-6)，前列腺素E-2(PGE-2)，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，白介素-6(IL-6)，白介素-10(IL-10)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，转化生长因子-β(TGF-β)，可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM1)等因子分泌水平。(如图3)

如图3所示，检测的上清液中HGF中浓度最高，其次是TSG-6、PGE-2、MCP1、VEGFA、IL-6、IL-10、IDO、TGF-β、最后是sVCAM1。

8、基因微阵列检测LCMSCs与胚胎干细胞(ESCs)的原始干性比较分析：

从LCMSCs和ESCs中提取RNA，使用Trizol试剂分别从三例LCMSCs和hESCs中提取总RNA，使用纯化试剂盒进一步纯化RNA，采用甲醛琼脂糖凝胶电泳定量分光光度法测定RNA质量。

微阵列分析，从LCMSCs和ESCs中提取的总RNA大于2μg，用提取的总RNA合成双链cDNA，然后使用MessageAmpTM生物素标记cRNA，把生物标记的cRNA被分割成35-200个长度的碱基，片段化的cRNA与包含47000个转录本的人类基因组U133+2.0阵列杂交，杂交在45℃条件下进行，旋转16小时，清洗基因芯片阵列，并使用链霉亲和素染色，然后在基因芯片扫描仪3000上扫描。所有样品均经三次生物重复制备。

标准化和数据分析，使用基因芯片操作软件GCOS 1.4分析杂交数据。首先通过目视检查对扫描图像进行评估，然后利用GCOS1.4的默认设置分析生成保存为CEL文件的原始数据文件。使用DNA芯片分析仪DSPCH进行不变集归化处理以对不同的阵列进行归化，在比较分析中，13392个基因在输出结果中的比值大于2或比值小于0.5的选择阈值被确定为显著差异表达。

经分析比较LCMSCs和ESCs的全部基因表达，发现7417个基因在表达上存在两倍差异，其中，2951个基因在LCMSCs中的含量是hESCs的两倍或更高。与ESCs相比，其他4,466个基因在LCMSCs中是下调的。

为了生成相似和差异表达的基因列表，使用倍数变化排序方法对微阵列进行了显著性分析，经p＜0.05筛选后，按照无差异变化对基因进行排序，选取LCMSCs与ESCs表达相似的前50个基因(如图4)。分子功能包括核糖体结构成分(34个基因)、蛋白结合(31个基因)、RNA结合(19个基因)、氧化还原酶活性(7个基因)等主要相似基因。该检测中与基因相关的最重要的生物学过程包括：翻译延伸、核糖体RNA(rRNA)加工、核糖体小亚基合成、线粒体电子传递、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)泛素相互作用、核糖体生物发生、组装和翻译起始。

经p＜0.05筛选后，将基因按2倍变化进行排序，并选出LCMSCs和ESCs中上调或下调的前25个基因。参见表1和表2所示：表1为LCMSCs比ESCs上调2倍以上的前25位基因，表2为LCMSCs比ESCs下调2.5倍以上的前25位基因。

表1

注：LCMSCs，来源于间充质干细胞的疏松结缔组织；ESCs，人类胚胎干细胞。记录了微阵列芯片上的信号强度。结果中比率>2.0或比率<0.5为显著差异。

表2

上调基因参与分子功能，包括蛋白结合、序列特异性DNA结合、转录因子活性、胶原结合、细胞外基质结构成分形成、血小板衍生生长因子结合、配体调控转录因子活性等。与基因相关的生物学过程包括整合素介导的信号通路、细胞基质黏附、前/后模式形成、肽交联、胶原纤维组织、细胞黏附、发育、T细胞分泌颗粒组织等，均为原始间充质干细胞的特性。

下调基因参与了锌离子结合、转录因子活性、金属离子结合、L-赖氨酸转运蛋白活性、阳离子氨基酸转运蛋白活性等分子功能。该检测中与基因相关的生物学过程包括转录调控、B细胞前分化、B细胞凋亡的正向调控、T细胞稳态增殖的正向调控、T细胞稳态增殖的负向调控、B细胞受体向膜筏的转运等。

9、实时定量PCT(qRT-PCR)分析LCMSCs原始干性

从芯片实验中筛选出在微阵列分析中涉及的胚胎干细胞标记基因和早期心血管特异性转录因子基因，进行实时定量RT-PCR检测，经qRT-PCR进一步证实。使用定量逆转录试剂盒逆转录总RNA。采用铂SYBR绿色qPCR superMix UDG进行qRT-PCR反应，PCR条件为50℃2min，95℃10min,40个循环(95℃15s，60℃1min)，每个板上检测3个目的基因。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为正常化的管家基因，然后在LCMSCs量化相对于ESCs的表达水平，进行计算。

本次检测选择的基因是八聚体结合转录因子-4(OCT4)、性别决定区域Y 2(SOX2)、NANOG、足细胞标志蛋白(PODXL)、母系抗十肽同系物3(SMAD3)、Brachyury，激酶插入结构域受体(KDR)、NK2同位序列5(NKX2.5)、胰岛素基因增强结合蛋白1抗体(ISL1)、v-kit-HardyZuckerman 4猫肉瘤病毒癌基因同源物(KIT)、组织apelin受体(APJ)、apelin(APLN)、胸腺细胞细胞表面抗原(THY1)。与定量PCR表达量相比，各基因的相对平均值(±SEM)表达量(每个样本数量为4个，各基因表达结果如图5所示)，证实了芯片基因表达结果与实时定量PCR结果间具有良好的相关性。

10、注射液的制备

LCMSCs制备完成后，对细胞悬液进行细菌检测、内毒素检测、支原体检测，并把细胞悬液经过40um孔径筛网，筛除大于单个细胞的细胞团，将检测合格的LCMSCs加入含人血白蛋白生理盐水溶液中，配制成2ml一管，注射液中人血白蛋白浓度为1％、每管含约2×10⁷细胞数量为一个包装单位的注射液，密封，在液氮中保存备用；或4-8运输保存，在12小时内应用，此为通用型LCMSCs注射液。

Claims

1.一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其特征在于，其含有脐带疏松结缔组织间充质干细胞LCMSCs，所述LCMSCs为从新生儿脐带内胎儿与母体连接界面的疏松结缔组织中提取的未分化的原始间充质干细胞，该间充质干细胞是胚外中胚层来源的原始未分化的间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其特征在于，所述药物为注射液，该注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的浓度为0.9-1.1％。

3.根据权利要求2所述的用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其特征在于，所述注射液的规格为2mL/管，每管中细胞总数量为1.9～2.1×10⁷；注射液以生理盐水配制。

4.根据权利要求1或2所述的用于免疫功能调节的间充质干细胞药物，其特征在于，所述间充质干细胞MSCs纯度为：所述间充质干细胞MSCs中，代表MSCs纯度的CD24+～CD108+细胞的百分比达70％以上，代表MSCs中杂质细胞的CD40+细胞占百分比≤20％。

5.一种用于免疫功能调节的间充质干细胞药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括间充质干细胞的制备和药物的制备，所述间充质干细胞的制备过程包括：剥离脐带内疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织采用连贯阶梯式培养法培养，该连贯阶梯式培养法包括结缔组织培养、细胞传代扩增培养、3D培养和低氧培养。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞的制备过程包括如下步骤：

S1:剥离脐带内疏松结缔组织：

S22:传代扩增培养：待细胞铺满瓶底80％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶消化0.5-2分钟，待细胞收缩后加入无血清细胞培养基终止消化，形成细胞悬液，把细胞悬液移入离心管中，在100-200g离心力下离心，弃上清，再加入无血清细胞培养基混匀，计数，按照每75cm²底面积的培养瓶接种0.75-0.85×10⁶细胞的浓度接种到新的无菌细胞培养瓶中，放置在35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养3-4天；

S23:3D培养：待细胞铺满瓶底90％后，弃培养基，加入磷酸盐缓冲液清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在培养瓶中加入0.12～0.13％胰蛋白酶消化0.5-2分钟，待细胞收缩后加入基无血清细胞培养基终止消化，形成细胞悬液，把细胞悬液移入离心管中，在100-200g离心力下离心，离心后弃上清，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升0.8-1×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的细胞培养瓶中加入水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为0.8-1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入无血清细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养；3D培养6-7天后，细胞融合70-80％时加入36-37℃PBS并放置于36-37℃水浴中，40-60min后水凝胶分解形成细胞悬液，混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，100-200g离心力离心10-20min，弃上清；

S24:低氧培养：经3D培养后的细胞加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为0.8-1×10⁵，加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为0.8-1×10⁶，先将细胞培养瓶放入35-37℃、体积分数为4-6％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为4-6％、35-37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养8-15h。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S24中，还包括LCMSCs表面标志鉴定步骤，即：采用流式细胞仪检测LCMSCs共同标志表达CD73、CD90、CD44、CD105、HLA-ABC，且不表达CD34、CD45、CD80、CD86、HLA-DR的细胞为LCMSCs。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S24中，还包括LCMSCs的纯度分析步骤，即：

将洗涤的低氧培养后的LCMSCs加入到PBS中充分混匀，在100-200g离心力离心，弃上清，将细胞沉淀，加入PBS把细胞重悬，将细胞平均分成6管，每管0.5ml并将细胞悬液放置于流式管中；

在其中3管细胞悬液中分别加入荧光标记CD24+、CD108+和CD40+抗体25ul孵育30分钟，此为检测组；在另外3管细胞悬液中加入PBS25ul孵育30分钟，此为空白组；将以上各管细胞悬液以100-200g离心力离心5min，弃上清，每管中加入0.5mL PBS重悬细胞，流式细胞仪分别检测CD24+-CD108+和CD40+细胞百分比，经流式细胞仪检测LCMSCs表面CD24+、CD108+均在70％以上，经流式细胞仪检测细胞表面CD40+不超过20％。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述药物为注射液，其制备过程为：将通过安全性检测LCMSCs，加入到含质量浓度为0.9-1.1％的人血白蛋白的生理盐水溶液中，制成每2ml含有1.9-2.1×10⁷个LCMSCs细胞数量的注射液。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞的制备过程还包括：

步骤S3：LCMSCs免疫调节分子分泌水平鉴定：通过ELISA方法检测LCMSCs培养上清中细胞分泌因子，来鉴定LCMSCs免疫调节分子分泌水平，方法如下：