CN101629164A - 从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，包括脐带结缔组织间充质基质细胞的分离方法及脂肪基质细胞的分离提取方法。本发明采用氧化型谷胱甘肽、丙二醛等温和氧化剂，这些温和氧化剂本身存在人体内，通过氧化性，使多糖降解断裂，将糖分子羟基氧化生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而破坏多糖结构；这些物质也可作用于胶原，与最邻近的氨基酸反应发生胶原蛋白过氧化，使胶原蛋白的多肽链断裂从而降低溶液粘度；并能有效促进弹性纤维的降解。应用本方法可以获得1×106至8×106的细胞数。且经流式细胞术验证所得细胞的均质性提高，所得细胞具有多向分化能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法。
背景技术
间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells，MSC)是一种起源于中胚层，主要存在于骨髓中，具有多向分化潜能的一类干细胞，也有人从肌肉、骨、脂肪组织中获得。MSC具有干细胞的共性，体积小，核浆大，不表达分化相关的标志，也不表达造血干细胞的标志。采用体外细胞培养方法，MSC可以定向诱导分化为成骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉及其它中胚层组织，这为MSC的应用打下良好的基础。
利用MSC进行组织工程学研究和应用具有很多优势；由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题。正因为MSC无论从来源、分离及可分化的组织类型上都有其独特的优势，MSC的作用会越来越大。
目前，应用较多较广的主要是骨髓间充质干细胞，主要取自体骨髓。但是提取自体骨髓间充质干细胞需做骨髓穿刺，且随供者年龄增长，MSC的数量和增殖能力显著下降的缺点，这就不得不让我们开始考虑寻找间充质干细胞新的来源，以满足未来科研工作和临床应用研究的需要。
当前的研究表明：在人体内，除骨髓外，脐带华通氏胶、脂肪等结缔组织中也含有间充质基质细胞，尤其是华通氏胶、脂肪等结缔组织来源与骨髓来源相比具有取材方便，且多属医疗废弃物，不易给患者造成二次伤害等优点。
专利号为200580012239.X公开了采用单纯胶原酶消化和机械分离的方法获取间充质基质细胞。从实验看，单纯使用胶原酶消化(以华通氏胶为例)，细胞得率最高的一次也只能勉强能达到106数量级(这个数量与脐带组织所含有的有核细胞数有较大差距，往往间充质基质细胞在有核细胞中又只占一小部分)，这与文献报道每根脐带约含有4000000个间充质基质细胞的数量相差巨大，这也充分说明此法分离效率低下。
同时，如果采用延长消化时间的方法，虽然可以部分提高细胞的产量，但也致使细胞活性降低，贴壁率大幅下降，不得不转而采取高密度接种的方法补救，而消化过短，则又面临细胞数较少的两难困境，这就使我们后续实验不得不采取大量扩增细胞的方法，以弥补原代细胞数量上的不足。但这也会造成间充质基质细胞的原始特性随着多次扩增传代而逐渐消失的不良后果。
造成消化后细胞得率低的主要原因在于，胶原酶消化后消化液出现胶状物，这些胶状物大量粘附细胞，在一些专利和文献中使用15min1000xg的离心条件，也难以有效分离，而长时间高速离心也极大的伤害了细胞的活性。对于胶状物，分析认为由于低浓度的胶原酶打开了胶原的三维空间结构却没有足够的数量完全摧毁掉胶原蛋白的化学结构，致使胶原蛋白继续缠绕细胞，但如果增大胶原酶的量不仅对于消化效率没有显著提高，还由于胶原酶的使用量过大而对细胞产生不良作用，致使贴比率下降；另一方面结缔组织中大量含有弹性纤维和多糖等大分子长链结构，这些物质并不能为胶原酶所破坏，且极易溶于水，能通过细胞表面受体与细胞结合，缠绕细胞，悬浮于消化液中。同时上述物质的存在也加大了溶液的粘度，降低了离心效率。
专利200510015492.2公开的技术则是在胶原消化后，再引入了胰酶进一步消化，以期用胰酶消化打开结缔组织中的弹性纤维结构，将细胞从组织中释放出来，但实际应用中短时间使用胰酶，对提高提取效率并未显著提高，且由于胰酶对细胞伤害作用明显，超过10分钟即会产生不可逆的伤害作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法。
为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：
从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，包括结缔组织间充质基质细胞的分离方法，脐带结缔组织间充质基质细胞的分离方法及脂肪基质细胞的分离提取方法。
上述技术方案中，所述的结缔组织间充质基质细胞的分离方法，包括如下的技术步骤：
(1)取无菌获得的结缔组织，保存在分离液中，1-24h内处理；
(2)清洗液反复冲洗组织，重悬洗去红细胞，剪碎组织；
(3)转移剪碎组织50ml离心管，加入清洗液，250g室温离心5min，去除上清液；
(4)用清洗液再次重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h；
(5)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
(6)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
(7)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液；
(8)按2×105/瓶接种培养瓶。
上述技术方案中，脐带结缔组织间充质基质细胞的分离方法包括如下的技术步骤：
(1)用蘸有75％酒精的酒精棉球，搽拭脐带采集瓶表面，用酒精灯快速灼烧瓶口后，打开采集瓶；
(2)用无菌止血钳将脐带轻轻钳出，避免触碰到别的物品，将它置于装有80ml消毒液的无菌烧杯中浸泡3-5min，然后使用清洗液清洗脐带2-5min，重复两次；
(3)用止血钳从清洗液中取出脐带，放入肾型盘中，用止血钳固定住一头，使用手术剪截取15cm无凝血脐带，并将之分割成多节5cm长脐带，将多节脐带放入装有80ml清洗液的无菌烧杯中冲洗掉血管中血污；
(4)用止血钳取出一节置于肾型盘中，撕开脐带外皮，若脐带韧性太强可用剪刀剪开，表皮剥离尽量薄；
(5)尽量完整剥离静脉；
(6)观察动脉位置后，依先难后易的原则，依次剥开两根动脉外结缔组织，完整剥离动脉；
(7)按以上步骤，依次剥离5节脐带，将剥除血管及表皮的脐带组织粉碎至5×5×5mm3；
(8)将组织碎块，移入50ml离心管中，用清洗液重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h；
(9)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
(10)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
(11)弃去上清液，加入40ml间充质干细胞培养基，用5ml移液管吹打混匀，300xg×5min离心；
(12)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液；
(13).按2×105/瓶接种培养瓶。
上述技术方案中，脂肪干细胞的分离提取方法，包括如下技术步骤：
(1)取抽脂术中无菌获得的脂肪，保存在分离液中，1-24h内处理；
(2)清洗液反复冲洗脂肪，重悬洗去红细胞，剪碎脂肪；
(3)转移剪碎组织50ml离心管，加入清洗液，250g室温离心5min，去除上清液；
(4)用清洗液再次重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h；
(5)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
(6)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
(7)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液；
(8)按2×105/瓶接种培养瓶。
上述技术方案中，消化液的配制方案如下：
用1000ml三蒸水溶解5-7g Nacl；0.44g Kcl；0.187gNaH2PO4；0.244gMgcl2；1-2g葡萄糖；1-2.4g NaHCO3；0.1-0.277g Cacl2；7gHEPES；添加1-10g BSA，0-1ml 200μmol/L腺苷；0.5-2g胶原酶；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
上述技术方案中，分离液的配制方案如下：
DMEM/F12添加25mmol/L HEPES；100μg/ml庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺；0-50mmol/L葡萄糖；1-10g BSA，调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
上述技术方案中，消毒液为70-77％重量浓度的乙醇溶液。
上述技术方案中，清洗液配制方案如下：
用1000ml三蒸水溶解8g Nacl；0.40g KCl；0.06g Na2HPO4·H2O；0.35g NaHCO3；0.06g KH2PO4；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
上述技术方案中，间充质干细胞培养基配制方案如下：
DMEM/F12添加25mmol/L HEPES；100μg/ml庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺；25mmol/L葡萄糖；10％胎牛血清，0-0.02mmol/L亚硒酸钠；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。。
上述技术方案中，催化剂的配制方案如下：
用1000ml三蒸水溶解7g Nacl；0.44g Kcl；0.187g NaH2PO4；0.244g Mgcl2；1-2.4g NaHCO3；0.1-0.277g Cacl2；7g HEPES；添加0g-20g氧化型谷胱甘肽；添加0g-4.7g丙二醛；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
分离时间：脐带采集36小时内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的技术结果主要可归因于采用了氧化型谷胱甘肽和丙二醛等温和氧化剂，这些温和氧化剂本身存在人体内，通过氧化性，使多糖降解断裂，将糖分子羟基氧化生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而破坏多糖结构；这些物质也可作用于胶原，与最邻近的氨基酸反应发生胶原蛋白过氧化，使胶原蛋白的多肽链断裂从而降低溶液粘度；并能有效促进弹性纤维的降解。同时本发明通过多种物质的搭配，维持细胞在消化反应过程中的生理平衡。通过已知的方法，一般每克结缔组织可以获得105的细胞。应用本方法可以获得1×106至8×106的细胞数。且经流式细胞术验证所得细胞的均质性提高，所得细胞具有多向分化能力。
附图说明
图1为细胞表面分子标志CD29的检测结果图；
图2为细胞表面分子标志CD31的检测结果图；
图3为细胞表面分子标志CD44的检测结果图；
图4为细胞表面分子标志CD34的检测结果图；
图5为细胞表面分子标志CD90的检测结果图；
图6为细胞表面分子标志CD73的检测结果图；
图7为细胞表面分子标志CD45的检测结果图；
图8为细胞表面分子标志CD105的检测结果图；
图9为间充质干细胞形态示意图；
图10为间充质干细胞形态示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明所要求保护的范围并不局限于实施方式所描述之范围。
实施例1
脐带结缔组织间充质干细胞分离
1.脐带间充质干细胞分离的环境：干细胞的分离应严格控制环境污染和剧烈变化，要求在百级GMP车间内进行。
2.脐带分离所需用品：
a)仪器
i.净化工作台
ii.数显恒温气浴振荡器
b)器械
i.14cm止血钳(无镀层)
ii.16cm剪刀(无镀层)
iii.16cm镊子
iv.肾形盘
v.电动移液枪
c)玻璃器皿及耗材
i.200ml烧杯
ii.离心管
iii.注射器
d)试剂
i.消化液
配制方案：用1000ml三蒸水溶解5-7g Nacl；0.44g Kcl；0.187g NaH2PO4；0.244g Mgcl2；1-2g葡萄糖；1-2.4gNaHCO3；0.1-0.277g Cacl2；7g HEPES；添加1-10g BSA，0-1ml200μmol/L腺苷；0.5-2g胶原酶；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
ii.催化剂
配制方案：用1000ml三蒸水溶解7g Nacl；0.44g Kcl；0.187g NaH2PO4；0.244g Mgcl2；1-2.4g NaHCO3；0.1-0.277gCacl2；7g HEPES；添加1g-20g氧化型谷胱甘肽；添加2.3g-4.7g丙二醛；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
iii.分离液
配制方案：DMEM/F12添加25mmol/L HEPES；100μg/ml庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺；25mmol/L葡萄糖；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。。
iv.消毒液
70-77％乙醇溶液
v.清洗液
配制方案：用1000ml三蒸水溶解8g Nacl；0.40g Kcl；0.06g Na2HPO4·H2O；0.35g NaHCO3；0.06g KH2PO4；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。。
间充质干细胞培养基
配制方案：
DMEM/F12添加25mmol/L HEPES；100μg/ml庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺；25mmol/L葡萄糖；10％胎牛血清；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
3.分离时间：脐带采集36小时内
4.分离步骤：
a)用蘸有75％酒精的酒精棉球，搽拭脐带采集瓶表面，用酒精灯快速灼烧瓶口后，打开采集瓶。
b)用无菌止血钳将脐带轻轻钳出，避免触碰到别的物品，将它置于装有80ml消毒液的无菌烧杯中浸泡3-5min，然后使用清洗液清洗脐带2-5min，重复两次。
c)用止血钳从清洗液中取出脐带，放入肾型盘中，用止血钳固定住一头，使用手术剪截取15cm无凝血脐带，并将之分割成多节5cm长脐带，将多节脐带放入装有80ml清洗液的无菌烧杯中冲洗掉血管中血污
d)用止血钳取出一节置于肾型盘中，撕开脐带外皮，若脐带韧性太强可用剪刀剪开，表皮剥离尽量薄；
e)尽量完整剥离静脉；
f)观察动脉位置后，依先难后易的原则，依次剥开两根动脉外结缔组织，完整剥离动脉。
g)按以上步骤，依次剥离5节脐带，将剥除血管及表皮的脐带组织粉碎至5×5×5mm3。
h)将组织碎块，移入50ml离心管中，用清洗液重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h。
i)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
j)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
k)弃去上清液，加入40ml间充质干细胞培养基，用5ml移液管吹打混匀，300xg×5min离心；
l)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液
m)按2×105/瓶接种培养瓶(至少接种4个75T培养瓶)。
实施例2
脂肪干细胞的分离提取
一、设备、耗材和试剂
(一)仪器
1.净化工作台
2.PH计
(二)玻璃器皿
1.250ml烧杯
2.废液缸
(三)塑料器皿
1.50ml注射器
2.20ml注射器
7.T25/75培养瓶
8.移液管
(四)其他物品
1.移液器
(五)试剂
1.PBS
二、实验步骤
取抽脂术中无菌获得的脂肪，保存在分离液中，1-24h内处理
清洗液反复冲洗脂肪，重悬洗去红细胞，剪碎脂肪
转移剪碎组织50ml离心管，加入清洗液，250g室温离心5min，去除上清液
用清洗液再次重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h。
用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心
弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液
按2×105/瓶接种培养瓶(至少接种4个75T培养瓶)。
实施例3
所述的结缔组织间充质基质细胞的分离方法，包括如下的技术步骤：
(1)取无菌获得的结缔组织，保存在分离液中，1-24h内处理；
(2)清洗液反复冲洗组织，重悬洗去红细胞，剪碎组织；
(3)转移剪碎组织50ml离心管，加入清洗液，250g室温离心5min，去除上清液；
(4)用清洗液再次重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h；
(5)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
(6)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
(7)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液；
(8)按2×105/瓶接种培养瓶。
表1：细胞表面分子标志CD29、CD31、CD44、CD34、CD90、CD73、CD45、CD105检测结果表
| 表面分子标记 | 阳性率 |
| CD29 | 99.49 |
| CD31 | 0.72 |
| CD44 | 98.15 |
| CD34 | 0.44 |
| CD45 | 0.01 |
| CD105 | 98.62 |
| CD90 | 99.71 |
| CD73 | 99.20 |
Claims (10)
1.从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于包括结缔组织间充质基质细胞的分离方法，脐带结缔组织间充质基质细胞的分离方法及脂肪基质细胞的分离提取方法。
2.根据权利要求1所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：所述的结缔组织间充质基质细胞的分离方法，包括如下的技术步骤：
(1)取无菌获得的结缔组织，保存在分离液中，1-24h内处理；
(2)清洗液反复冲洗组织，重悬洗去红细胞，剪碎组织；
(3)转移剪碎组织50ml离心管，加入清洗液，250g室温离心5min，去除上清液；
(4)用清洗液再次重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h；
(5)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
(6)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
(7)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液；
(8)按2×105/瓶接种培养瓶。
3.根据权利要求1所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：脐带结缔组织间充质基质细胞的分离方法包括如下的技术步骤：
(1)用蘸有75％酒精的酒精棉球，搽拭脐带采集瓶表面，用酒精灯快速灼烧瓶口后，打开采集瓶；
(2)用无菌止血钳将脐带轻轻钳出，避免触碰到别的物品，将它置于装有80ml消毒液的无菌烧杯中浸泡3-5min，然后使用清洗液清洗脐带2-5min，重复两次；
(3)用止血钳从清洗液中取出脐带，放入肾型盘中，用止血钳固定住一头，使用手术剪截取15cm无凝血脐带，并将之分割成多节5cm长脐带，将多节脐带放入装有80ml清洗液的无菌烧杯中冲洗掉血管中血污；
(4)用止血钳取出一节置于肾型盘中，撕开脐带外皮，若脐带韧性太强可用剪刀剪开，表皮剥离尽量薄；
(5)尽量完整剥离静脉；
(6)观察动脉位置后，依先难后易的原则，依次剥开两根动脉外结缔组织，完整剥离动脉；
(7)按以上步骤，依次剥离5节脐带，将剥除血管及表皮的脐带组织粉碎至5×5×5mm3；
(8)将组织碎块，移入50ml离心管中，用清洗液重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h；
(9)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
(10)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
(11)弃去上清液，加入40ml间充质干细胞培养基，用5ml移液管吹打混匀，300xg×5min离心；
(12)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液；
(13).按2×105/瓶接种培养瓶。
4.根据权利要求1所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：脂肪干细胞的分离提取方法，包括如下技术步骤：
(1)取抽脂术中无菌获得的脂肪，保存在分离液中，1-24h内处理；
(2)清洗液反复冲洗脂肪，重悬洗去红细胞，剪碎脂肪；
(3)转移剪碎组织50ml离心管，加入清洗液，250g室温离心5min，去除上清液；
(4)用清洗液再次重悬清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于气浴振荡器37℃，200r/min消化1h；
(5)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭离心管表面，酒精灯火焰短暂灼烧离心管口后，将消化液移出，用300目无菌滤网和10cm直径无菌漏斗过滤，收集滤液；
(6)收集滤液，加入20ml分离液混匀，300xg×5min离心；
(7)弃去上清，加入间充质干细胞培养基，吹打混匀，制成2×104个细胞/ml混悬液；
(8)按2×105/瓶接种培养瓶。
5.根据权利要求2、3或4所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：消化液的配制方案如下：
用1000ml三蒸水溶解5-7g Nacl；0.44g Kcl；0.187 gNaH2PO4；0.244gMgcl2；1-2g葡萄糖；1-2.4g NaHCO3；0.1-0.277g Cacl2；7gHEPES；添加1-10g BSA，0-1ml 200μmol/L腺苷；0.5-2g胶原酶；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
6.根据权利要求2或3，4所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：分离液的配制方案如下：
DMEM/F12添加25mmol/L HEPES；100μg/ml庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺；0-50mmol/L葡萄糖；1-10g BSA，调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
7.根据权利要求2、3或4所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：消毒液为70-77％重量浓度的乙醇溶液。
8.根据权利要求2、3或4所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：清洗液配制方案如下：
用1000ml三蒸水溶解8g Nacl；0.40g KCl；0.06g Na2HPO4·H2O；0.35g NaHCO3；0.06g KH2PO4；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
9.根据权利要求2、3或4所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：间充质干细胞培养基配制方案如下：
DMEM/F12添加25mmol/L HEPES；100μg/ml庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺；25mmol/L葡萄糖；10％胎牛血清，0-0.02mmol/L亚硒酸钠；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。。
10.根据权利要求2、3或4所述的从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法，其特征在于：催化剂的配制方案如下：
用1000ml三蒸水溶解7g Nacl；0.44g Kcl；0.187g NaH2PO4；0.244g Mgcl2；1-2.4g NaHCO3；0.1-0.277g Cacl2；7g HEPES；添加0g-20g氧化型谷胱甘肽；添加0g-4.7g丙二醛；调节PH值至6-8，渗透压为280-330mOsm/kg。
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