CN106367389A - 一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养和冻干粉的制备及活性检测两个步骤，在冻干粉中加入水剂进行溶解即可得到可使用的产品，可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。本发明采用此种工艺制备的冻干粉含有多种干细胞所分泌的细胞因子；采用超滤浓缩及冷冻干燥工艺，能是细胞因子的活性得到最大化的保存，且这种剂型方便产品的储存和使用；在美容及皮肤修护领域使用，可修复表皮及基底层受损的皮肤细胞，达到皮肤美容的效果。

Description

一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞因子技术领域，具体为一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用。

背景技术

干细胞是一种具有多向分化潜能及无限自我更新复制能力的细胞，在一定条件下，可分化为特定的组织。干细胞在生长、增殖、分化过程中会向胞外分泌促进细胞生长及调控周围环境的细胞因子等活性物质。哺乳动物的干细胞在培养过程中，细胞会向外分泌大量的皮肤修复因子和伤口愈合因子等活性物质，进入培养后的细胞培养液中。

间充质干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，并有造血支持和促进干细胞植入、免疫调节能力；其多向分化潜能表现为，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、肌肉、肝脏、内皮等多种组织和细胞，特别是具有分化为成纤维细胞(皮肤真皮层的主要构成细胞)和表皮细胞的能力。

将间充质干细胞用于美容及皮肤修复领域，已经成为近些年利用再生医学技术进行美容的研究热点，常见的使用形式主要有：干细胞皮肤注射美容、干细胞培养液直接使用、干细胞条件培养液制备成冻干粉，再应用到皮肤美容中。直接注射干细胞，对细胞的质量要求较高，且需要供体的细胞，注射的细胞不一定能完全成活；直接使用干细胞条件培养液，可以减少在反复操作过程中，条件培养液有效成分的流失，但是干细胞分泌的细胞因子在常温下或温度变化的条件下，会发生部分活性丧失，不能达到预期的效果；干细胞条件培养液冻干粉的使用，可以在体外进行干细胞的扩大培养，并进行细胞的条件诱导处理，以使细胞可以分泌更多有效的细胞因子，而且冻干工艺的使用，能稳定的保存细胞因子的活性，便于储存和运输，且在使用时，只需要用相应水剂溶解，便于操作。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用，以解决上述背景技术中的缺点。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用，选用人体免疫源性最低、干细胞性能最强、易于获取的脐带组织，经体外干细胞分离与扩大培养，得到纯度较高的干细胞。再将干细胞进行工厂化放大培养，富集细胞培养液，经培养液的浓缩、蛋白含量测定、冻干、质检，得到成品——富含多种细胞因子的冻干粉。该冻干粉可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。

一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，其步骤如下：

步骤一：人脐带间充质干细胞的原代分离与培养

1)将接收的临床检测合格的脐带组织放置在含50-100ml生理盐水的无菌采集瓶中，密封保存。使用保温箱(含冰袋运输)，送回无菌实验室。

2)在净化工作台内，从采集瓶中取出脐带，放入培养皿中，测量脐带长度并做记录。测量完毕，将脐带转入另一培养皿中，用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm小段，用生理盐水重复清洗3-5次，去除血渍，达到清澈。

3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用有齿直镊撕下两条实心动脉和外膜，其余为华通氏胶即位于羊膜与血管之间的白色结缔组织。用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次。

所述静脉和动脉血管的去除，是为了避免所分离到的细胞含有血管细胞的成分，影响细胞的纯度。

4)将获得的胶体转移至另一平皿中，用眼科弯剪将胶体剪成约1mm³×1mm³组织块，收集至50ml离心管中。用10ml组织消化液，37℃恒温震荡消化30-60min。

消化完成后，再使用10ml细胞消化液，继续37℃恒温震荡消化15-30min。直至华通氏胶全部被消化(肉眼看不见大的组织块时即可)。用10ml细胞培养液中止消化。并轻轻吹打消化的组织块50-100下，随后加入20ml生理盐水稀释，吹匀，旋紧离心管盖，放入离心机1000rpm/min，离心10-20min。

5)离心完毕，弃上清，将4-10ml细胞培养液加入离心管中，轻轻吹打细胞液体10-20下，使细胞成单细胞悬液，用10ul微量移液器在离心管中吸取10ul含单细胞悬液的液体，加入一次性计数板上，用电子计数仪计数。按照计数结果，以3-5*10⁵/瓶的密度，将离心管内单细胞悬液接种至一次性25cm²培养瓶中。

6)将培养瓶口、瓶盖过火后盖上盖子，将细胞轻轻摇匀，做好标记放入二氧化碳培养箱，水平放置。72h后换液，以后每隔48h换液一次。培养至第7-10天，细胞克隆团的面积达到80％，消化收获细胞。进行传代培养。

步骤二：人脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定

1)取P20代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×10⁵-1×10⁶/管的密度接种至9个1.5ml EP管中，每管加入1ml PBS，混匀细胞悬液，800-1000rpm/min，离心5-10分钟。离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl含2％FBS的PBS重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体2-5μl：PE anti-human CD19、FITC anti-human CD73、PE Anti-Human CD90、PEanti-human CD105、FITC Anti-Human CD14、PE anti-human CD34、PE anti-human CD45、FITCAnti-Human HLA-DR。

2)抗体加入后用200μl微量移液器轻轻混匀，注意不要产生气泡，室温避光孵育30-60min。

3)孵育结束后，用2％FBS的PBS洗涤细胞两次，每次用1ml。800rpm/min，离心5-10分钟。离心后用300μl 2％FBS的PBS重悬细胞后上流式仪检测。

步骤三：细胞因子生产与蛋白浓度的检测

细胞因子的生产，收集培养的细胞上清液,先采用0.22μm滤膜进行过滤，然后通过30KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过3KD超滤膜，收集截留液，即为生物活性因子冻干粉原液。

蛋白浓度检测，即采用BCA蛋白浓度测定法对生物活性因子冻干粉原液总蛋白浓度进行测定。标准为：蛋白浓度≥0.8mg/ml。

步骤四：冻干粉的制备及活性检测

1)称取0.1％-1％的右旋糖酐，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐40溶解，需加热煮沸，至完全澄清。

2)另取一烧杯，称取5％-15％的甘露醇，溶解，需加热到60-70℃，至澄清，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入0.1％-1％的海藻糖，搅拌均匀至澄清。

3)待液体放至室温，加入因子浓缩液，最终用纯化水定容至10L，搅拌均匀至澄清即可。

4)液体过滤：溶解均匀的液体用0.22-0.45μm的滤器进行过滤，滤液收集在灭过菌的容器中。

5)液体分装：过滤后的液体按照每支西林瓶(7mL)装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞(分装所用的器皿都要经过121℃，30min，0.1MPa的高温高压进行灭菌，并且烘干。

6)冻干：分装后冷冻干燥，得到冻干粉常温贮存备用。

7)活性检测：活性检测主要以冻干粉的抗氧化活性检测为主。以人成纤维细胞作为检测细胞，以正常培养液作为阴性对照，维生素C作为阳性对照，冻干粉的培养液溶液作为样品，用qRT-PCR方法检测Mn-SOD基因在成纤维细胞上的表达量变化情况。

本发明中，所述组织消化液，可将组织间的纤维连接直接破坏，使组织块得到最大程度的分散，便于细胞的分离。

本发明中，所述细胞因子表达的检测，应该满足细胞经流式仪检测检测≥95％，则为表达CD105、CD73和CD90；经流式仪检测检测≤2％则为不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19、HLA-DR。

本发明中，所述CD105是I型膜糖蛋白，TGF-β受体复合物的一部分，在细胞迁移方面发挥重要的作用，但CD105本身不结合TGF-β。CD105在血管新生方面也发挥了非常重要的作用。

本发明中，所述CD90是一种N-糖基化的糖磷脂酰肌醇，属于免疫球蛋白超家族的一员，最早发现具有胸腺细胞抗原的作用。CD90在细胞与细胞之间、细胞与基质之间发挥很重要的作用，并涉及细胞间的粘附、迁移。CD90广泛表达在多种干细胞的膜表面，包括间充质干细胞、肝脏干细胞、角质干细胞。

本发明中，所述CD73是5-外切核苷酸酶,可以将一磷酸腺苷分解为单个腺苷。CD73可能参与了骨髓中的细胞信号传导，调节细胞之间的相互作用，尤其是参与了骨髓中淋巴细胞的正常发育。

本发明中，所述阴性表达的标记物，主要是用来区别血液细胞。CD45是白细胞的标记物。CD34是造血干细胞和内皮细胞的标记物。CD14和CD11b表达于单核细胞和巨噬细胞。CD79α和CD19是B细胞的标记物。HLA-DR是MHC-II类分子，表达于B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化T淋巴细胞、活化NK淋巴细胞，具有很强的免疫原性。

本发明中，所述消化步骤条件控制，主要是在组织分离过程中，控制组织块的体积在1mm³×1mm³，另外保证组织块充分消化，以最大限度的分离到足够多的细胞。

本发明中，所述人成纤维细胞，是从人体皮肤的真皮层中分离得到的一种细胞，由于冻干粉的使用均在美容及皮肤修复领域，因此成纤维细胞上的检测结果也可以直接反应其后续用于人体的直接效果。

本发明中，所述SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。SOD是催化超氧阴离子自由基(O₂)转变为H₂O₂和O₂的歧化反应(的生物催化剂，对细胞和生物起保护作用。Mn-SOD存在于哺乳动物的线粒体中，因此可以通过qRT-PCR的方法检测。

本发明的有益效果：

1.成分：采用此种工艺制备的冻干粉含有多种干细胞所分泌的细胞因子；

2.工艺：采用超滤浓缩及冷冻干燥工艺，能使细胞因子的活性得到最大化的保存，且这种剂型方便产品的储存和使用；

3.作用：在美容及皮肤修护领域使用，可修复表皮及基底层受损的皮肤细胞，达到皮肤美容的效果。

附图说明

图1为一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法的流程示意图；

图2为UCMSCs细胞表面标记检测结果图；

图3为给药孵育24h后mRNA水平的变化图；

图4为临床应用实例图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例：如图1、图2、图3和图4所示，一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用，其步骤如下：

步骤一：细胞的原代分离、培养与间充质干细胞表面标志物的鉴定

1)将接收的临床检测合格的脐带组织放置在含50ml生理盐水的无菌采集瓶中，密封保存。使用保温箱，送回无菌实验室。

2)在净化工作台内，从采集瓶中取出脐带，放入培养皿中，测量脐带长度为15cm，并做记录。测量完毕，将脐带转入另一培养皿中，用长柄手术剪将脐带剪成长3cm小段，用生理盐水重复清洗3次，去除血渍，达到清澈。

3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，去除干净静脉血管，再使用有齿直镊撕下两条实心动脉和外膜，即为华通氏胶。用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2次。

4)将获得的胶体转移至另一平皿中，用眼科弯剪将胶体剪成约1mm³×1mm³组织块，收集至50ml离心管中。用10ml组织消化液，37℃恒温震荡消化50min。

5)50min后，再使用10ml细胞消化液，继续37℃恒温震消化15～30min。直至华通氏胶全部被消化。用10ml细胞培养液中止消化。并轻轻吹打消化的组织块50下，随后加20ml生理盐水稀释，吹匀，旋紧离心管盖，放入离心机1000rpm/min，离心10min。

6)离心完毕，弃上清，将4ml细胞培养液加入离心管中，轻轻吹打细胞液体10下，使细胞成单细胞悬液，用10ul微量移液器在离心管中吸取10ul含单细胞悬液的液体，加入一次性计数板上，用电子计数仪计数。以3×10⁵/瓶的密度将单细胞悬液接种至10一次性25cm²培养瓶中。

7)将培养瓶口、瓶盖过火后盖上盖子，将细胞轻轻摇匀，做好标记放入二氧化碳培养箱，水平放置。72h后换液。以后每隔48h换液一次。

培养至第7天，细胞克隆团的面积达到80％，消化收获细胞。进行传代培养。

8)分别取P5、P10、P15代的培养细胞，胰酶消化计数后，按1×10⁶接种至9个1.5mlEP管中，每管加入1ml PBS并用1ml微量移液器混匀细胞悬液，将离心管配平后，放入离心机内，800rpm/min，离心5分钟。离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl含2％FBS的PBS重悬细胞，每管中按照以下剂量避光条件下加入流式抗体。

9)抗体加入后用200μl微量移液器轻轻混匀，注意不要产生气泡，室温避光孵育30min。

10)孵育结束后，用2％FBS的PBS洗涤细胞两次，每次用1ml。800rpm/min，离心5分钟。离心后用300μl 2％FBS的PBS重悬细胞后上流式仪检测。

步骤二：细胞因子生产及检测

1)按照以下细胞因子生产配方(以10L UCMSCs培养液原液用量计算)，进行细胞因子的生产：

2)超滤浓缩：收集培养的细胞上清液,先采用0.22μm滤膜进行过滤，然后通过30KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过3KD超滤膜，收集截留液，即为生物活性因子冻干粉原液。

步骤三：冻干粉制备及活性检测

1)按照以下冻干粉配方，进行冻干液体的配制：称取0.4％的右旋糖酐40，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐40溶解，另取一烧杯，称取10％的甘露醇，溶解，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入0.6％的海藻糖，搅拌均匀至澄清。

待液体放至室温，加入因子浓缩液，使因子的终浓度在0.3mg/ml，最终用纯化水定容至10L，搅拌均匀至澄清即可。

2)液体过滤：将溶解均匀的液体用0.22μm的滤器进行过滤，滤液收集在灭过菌的容器中。

3)液体分装：过滤后的液体按照每支西林瓶装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞。

4)冻干：分装后冷冻干燥，得到冻干粉常温贮存备用。

5)活性检测：采用qRT-PCR方法进行检测

1)将成纤维细胞接种于6孔板中，待铺板率达到60％时，即可进行给药试验；

2)每组实验设2个复孔。实验组采用既定的药物浓度，如表1刺激，对照组采用空白培养液进行孵育。在孵育24h后收集细胞；

表1实验分组及给药方法

实验分组	样品原浓度	样品终浓度	液体配制方法
				阴性组	DMEM含10％FBS		2ml/孔
阳性组	30mg/mL	30ug/mL	取VC2uL+2mLDMEM
				样品组	0.6mg	0.1mg/mL	0.6mg冻干粉+6mlDMEM

3)按照Trizol试剂说明书Invitrogen进行RNA提取；

4)按照反转录试剂盒操作说明书TaKaRa进行RNA反转录、并在此基础上，对拟选用的Mn-SOD基因进行qRT-PCR检测；

5)所得数据采用2^-ΔΔCt计算方法进行统计分析。

步骤四：临床应用实例

本发明的冻干粉在通过生物安全性测试后，挑选出10例分别有面部色素沉着、皱纹等面部衰老症状的志愿者，在志愿者知情同意的情况下，进行产品使用，每周一次，定期拍照观察，6次为一个治疗周期。

10例志愿者在使用本产品6次后，均有显著的改善，色素沉着志愿者面部色斑明显变浅，皱纹者皱纹的深度及密度都得到了减轻。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养和冻干粉的制备及活性检测两个步骤，其特征是：

步骤一；所述人脐带间充质干细胞的原代分离与培养分为以下步骤：

1)检测合格的脐带在通过初步的培养和清洗后，使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用有齿直镊撕下两条实心动脉和外膜，获得华通氏胶并用生理盐水冲洗所述华通氏胶，重复清洗2-3次；

2)将所述华通氏胶和细胞消化液混合至离心管中，待消化完后于离心机中进行离心；离心后取单细胞悬液接种至培养瓶中进行传代培养；

3)将培养瓶中P20代内的细胞进行离心、孵化、二次离心和超滤浓缩后得到因子浓缩液；

步骤二；所述冻干粉的制备分为以下步骤：

1)称取0.1％-1％的右旋糖酐，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐-40溶解；

2)另取一烧杯，称取5％-15％的甘露醇，溶解(需加热到60-70℃，至澄清)，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入0.1％-1％的海藻糖，搅拌均匀至澄清；

3)待液体放至室温，加入步骤一中3)中所述因子浓缩液，最终用纯化水定容至10L，搅拌均匀至澄清即可；

4)溶解均匀的液体用0.22μm的滤器进行过滤，滤液收集在灭过菌的容器中；

5)过滤后的液体按照每支7mL的西林瓶装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞；

6)冻干：分装后冷冻干燥，得到冻干粉常温贮存备用。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征是：所述步骤二中的所述右旋糖酐-40需要加热煮沸，至完全澄清才能溶解。

3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征是：所述步骤二中的5)中的所述西林瓶要在121℃，0.1MPa，30min进行高温高压灭菌，并且烘干。

4.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征是：所述步骤二所述冻干粉的制备还包括活性检测，所述活性检测主要以冻干粉的抗氧化活性检测为主，以人成纤维细胞作为检测细胞，以正常培养液作为阴性对照，维生素C作为阳性对照，冻干粉的培养液溶液作为样品，用qRT-PCR方法检测Mn-SOD基因在成纤维细胞上的表达量变化情况。

5.一种人脐带间充质干细胞因子的应用，其特征是：在冻干粉中加入水剂进行溶解即可得到可使用的产品，可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。