CN109554446A - 一种通过检测细胞模型中的TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供一种通过检测细胞模型中TGF‑β表达量评价冻干粉活性的方法，涉及生物技术领域，解决了冻干粉活性评价的问题，克服了毛囊干细胞和毛乳头细胞不易分离，难培养的困扰，并且TGF‑β作为一种细胞因子来体外评价生发冻干粉的活性，其操作方法简单，实用性强，可作为后期不同批次冻干粉使用前活性评价的参考依据。该通过检测细胞模型中TGF‑β表达量评价冻干粉活性的方法为首先制备人源性ADSCs冻干粉，并分别将生长期的表皮干细胞和黑色素细胞胰酶消化后制备单细胞悬液，先后取两种细胞单细胞悬液混合培养构建表皮‑黑色素细胞模型，之后在此模型上给与冻干粉共培养，RT‑PCR方法进行TGF‑β的表达量检测。

Description

一种通过检测细胞模型中的TGF-β表达量评价冻干粉活性的 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过检测细胞模型中TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法。

背景技术

随着社会竞争加剧，各种压力增大，都会使脱发的发病率呈逐渐上升，以及愈来愈年轻化的趋势。近年来，在我国各大医院脱发患者的门诊量在不断上升。脱发给患者的生活、精神和心理带来了极大的压力。目前市场上预防和治疗脱发的药物大多以中药为主，西药较少，治疗效果均不如意。如非那雄胺和米诺地尔，尽管使用后部分患者症状有所改善，但也因人而异，并不能从根本上解决问题，且均存在副作用，停药后也会反弹。有调查显示，约98%的脱发患者在使用了现有的防治脱发药物半年无效后会选择弃用。植发是近几年流行的新型技术，一般在中西药治疗无效之后，很多患者都会选用植发，但植发需要从自身后枕部健康毛发区取材再植入至前额、头顶等脱发区域，此过程操作时间长，患者有痛苦感，且价格昂贵，术后效果不能保证，还可能伴随有感染、肿胀等并发症。而现售的其它类型的生发产品、育发产品也都号称具有激活毛囊，促进生发的功效，但往往消费者使用后效果并不理想，同样的产品不同批次的甚至可能有红肿，瘙痒、蜕皮等不良反应，因此开发新的有效的生发药物有巨大的临床意义。

随着对毛囊微观水平认知的不断提高，人们意识到毛发再生受到毛囊干细胞及其周围微环境的调控。干细胞是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，具有向多种组织细胞分化的能力，因此开发针对于毛囊部位干细胞微环境修复的再生产品成为治疗脱发药物的发展趋势。

研究发现毛囊及其周围组织能通过自分泌和旁分泌产生一些生物活性因子，经各种途径影响毛发的生长发育和生长周期。其中，对毛囊有重要意义的细胞因子主要有：肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor basic，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、转化生长因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，这些细胞因子的深入研究为防治脱发提供了新的思路。但是，这类药物多难以直接通过皮肤屏障到达毛囊组织，在毛囊局部难以达到有效浓度；同时这些药物容易降解、生物活性也容易下降，从而影响其生发的效果。因此，含细胞因子类的生发药物如何保证细胞因子活性是首要解决的问题。

冻干粉是在无菌环境下将药液冷冻呈固态，抽真空将水分升华干燥后而成的无菌粉注射剂，能最大限度的保证药物成分的活性，便于运输，使用方便。目前市场上不乏效果较好的生发类冻干粉。中国专利CN200710093074.4公开了“一种人源性细胞因子生发剂及其制备方法”是将人成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞的培养上清液制成蛋白冻干粉末，之后将冻干粉末包封在脂质膜中，经过旋转蒸发，冻干后制成易于透过皮肤屏障，更加稳定的冻干粉。此发明所制备的冻干粉有明显的生发效果，但此冻干粉制备过程过于复杂，使用的细胞种类繁多，而且对设备要求高，在临床使用有一定的限制性。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一种从脂肪组织中分离出来的具有多种分化潜能的干细胞，能分泌多种细胞因子，包括HGF、VEGF、FGF、IGF等，且脂肪干细胞存在于皮下脂肪层中，获得来源广泛，分离步骤简单。因此，脂肪干细胞培养液成为制成生发冻干粉的良好选择。

毛囊中存在着多种细胞，包括隆突部的毛囊干细胞，真皮的毛乳头细胞和上皮的内、外根鞘细胞。表皮的角质层是药物透皮吸收的主要屏障，药物局部治疗成功的关键是药物必须透过角质层到达病变部位达到有效浓度并维持一定时间。在实际中，人源性的脱发患者毛发标本不易获得，且毛囊干细胞、毛乳头细胞及内、外根鞘细胞不易分离，培养基特殊，且只能使用低代次的细胞进行研究，因此在体外细胞水平上进行产品功效评价时其细胞来源就受到了限制。表皮-黑色素细胞共培养模型是接近于人体正常皮肤生理结构的模型，即两种细胞接种比例为10:1时更接近于生理状态，目前被广泛用于色素性皮肤疾病的研究中。

已有资料显示，转化生长因子β（TGF-β）对毛囊有直接的作用，是毛囊生长发育过程中不可缺少的信号，并通过Smad途径、Ras-MAPK途径在调控毛囊生长周期中起着重要作用。在成熟毛囊中，转录生长因子β（TGF-β）通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡从而诱导毛囊由生长期向退行期转变。TGF-β1控制毛发周期生长中期的起始，也是一种重要的毛囊退化期启动因子，敲除TGF-β1基因的小鼠生长期向退行期的转变明显延迟；给小鼠背部注射TGF-β1，毛囊提前进入退行期。此外，TGF-β1 可能参与了雄激素性脱发的发生，即雄激素通过诱导毛乳头细胞表达 TGF-β1 而抑制毛囊角质形成细胞的增殖。TGF-β2通过内源性细胞凋亡途径引起毛囊角质细胞的凋亡从而促进毛囊由生长期向退行期转变，从而抑制毛发生长。这些研究都表明了TGF-β在毛发生长发育过程中的重要作用。由于 TGF-β1 和 TGF-β2能够诱导毛囊由生长期向退行期转变, 因此如果局部应用 TGF-β1、TGF-β2 或 TGF-β受体拮抗剂将有望治疗雄激素性脱发等与退行期提前发生有关的毛发疾病。 相反, 应用其激动剂则可以治疗多毛症等一些与生长期延长有关的毛发疾病。因此生发冻干粉功效的好坏可以以TGF-β基因的表达量作为评价冻干粉活性的一个标准。目前并无将TGF-β作为评价标准来体外评价冻干粉活性。

发明内容

本发明实施例提供了一种通过检测细胞模型中TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法，解决了冻干粉活性评价的问题，克服了毛囊干细胞和毛乳头细胞不易分离，难培养的困扰，并且TGF-β作为一种细胞因子来体外评价生发冻干粉的活性，其操作方法简单，实用性强，可作为后期不同批次冻干粉使用前活性评价的参考依据。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

一种通过检测细胞模型中TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法，包括以下步骤：

（1）人源性ADSCs冻干粉的制备

将低温保存的10代以内ADSCs细胞用低剂量UVB照射3-6min后，在细胞工厂中扩大培养，3d后无菌条件下收集培养液。经过冷冻、抽真空干燥后获得ADSCs冻干粉。

（2）表皮-黑色素共培养细胞模型的建立

将临床获得的无菌男性包皮组织经过酶消化法处理后分离得到表皮细胞和黑色素细胞，并将两种细胞贴壁培养。将培养的处于生长期的表皮细胞消化后，加入至六孔板中培养2d，之后将黑色素细胞消化，按照适当的比例加入至已培养2d的表皮细胞六孔板中，恒温培养箱培养1d。

（3）冻干粉和细胞模型的共培养及TGF-β的检测

将步骤（1）获得的冻干粉以给药形式加入至步骤（2）的细胞模型中，冻干粉和细胞在恒温培养箱中共培养24h，以不加冻干粉的细胞模型作为对照组。24h后Trizol裂解细胞，提取细胞RNA，测定各组RNA浓度，以获得的RNA为模板，合成cDNA；以GAPDH为内参基因，RT-PCR检测TGF-β的表达量，按照2△△C(T)方法分析TGF-β的表达量，评价冻干粉活性。

上述步骤（2）具体是：将无菌的包皮组织PBS清洗两遍后，去除皮下结缔组织，将皮片剪成小块，加入Dispase进行4℃过夜消化，消化时间为16-18h。消化后轻轻撕掉表皮，用胰蛋白酶将表皮进行二次消化，之后将消化液过滤，离心，得到表皮细胞和黑色素细胞，表皮培养液培养表皮细胞，黑色素培养液培养黑色素细胞。将处于生长期的表皮细胞胰酶消化后，以2*104个/孔的密度接种于6孔板中，37℃，5%的CO2培养箱培养2d。将处于生长期的黑色素细胞消化后，以2*103个/孔的密度接种于已培养2d的表皮细胞的6孔板中，37℃，5%的CO2培养箱培养48h，即得表皮-黑色素细胞模型。

上述步骤（3）具体是：弃掉6孔板中的培养基，用适量的表皮-黑色素细胞培养基将 冻干粉溶解，按照2mL/孔的量加入至6孔板中，使冻干粉和表皮-黑色素细胞模型充分接触， 在37℃，5%的CO2培养箱培养。24h后弃掉培养基，PBS清洗一遍细胞，加入1mL/孔的Trizol裂 解液裂解细胞，按照RNA常规提取方法提取细胞RNA，并测定RNA浓度和纯度，选择A260/A280 比值为1.8-2.0之间的RNA为模板，按照Takara反转录试剂盒操作说明进行cDNA合成，合成 体系为20uL。之后以此cDNA为模板，以SYBR Green为染料，以GAPDH为管家基因，进行TGF-β 的RT-PCR扩增，扩增体系为20uL，按照2△△C(T)方法分析TGF-β的表达量。

所述步骤（2）中，二次消化表皮采用的使胰蛋白酶消化液（含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA•2Na），消化时间为10-15min，消化液进行800rpm/min，离心5min，得到的沉淀即为表皮细胞，其细胞培养液为无血清的KC培养液，内含牛垂体提取物12.5mg/500mL。

所述步骤（2）中，二次消化表皮采用0.25%的胰蛋白酶，消化时间为5-8min，消化液进行800rpm/min，离心5min，得到的沉淀即为黑色素细胞，其细胞培养液为M254培养基，内含HMGs因子。

所述步骤（3）中，RNA的浓度和纯度的测定使用BioTek Epoch超微量微孔板分光光度计。所述步骤（3）中，cDNA合成所需的RNA加入量（uL）=1000ng/RNA浓度，反转录仪器为Biometra EasyCycler 96。

所述步骤（3）中， RT-PCR扩增仪为Bio-Rad CFX C1000，扩增后2△△C(T)分析在Bio-Rad CFX Manager软件上进行。

所述的表皮-黑色素细胞共培养24h后，两种细胞保持特有形态，且细胞融合良好（图1）。

以上所述实验需至少重复3次后，结果显示TGF-β的表达量明显低于表皮-黑色素细胞模型组，且两组比较有显著性差异时，可推断冻干粉有活性。

本发明用于使用前人源性冻干粉活性质量的把控，评价冻干粉能否通过抑制TGF-β的表达达到生发的目的。本发明具有以下优点：相对于毛囊干细胞和毛乳头细胞获得困难，只能在低代次实验的情况下，表皮细胞和黑色素细胞更易获得，且高代次也可用于毛发相关实验。此外，表皮-黑色素细胞模型接近人体皮肤构造，且首次将此共培养模型和TGF-β用于生发冻干粉的检测，为今后生发育发类产品的体外功效评价提供了参考。

附图说明

图1为给与冻干粉前，表皮-黑色素细胞共培养24h示意图；

图2为给与冻干粉后，表皮-黑色素细胞模型状态示意图；

图3为冻干粉与表皮-黑色素细胞共培养后TGF-β表达的检测结果示意图；

图4为给与市售生发冻干粉前，表皮-黑色素细胞状态示意图；

图5为给与市售生发冻干粉后，表皮-黑色素细胞状态示意图；

图6为市售生发冻干粉与表皮-黑色素细胞共培养后TGF-β表达的检测结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.人源性ADSCs冻干粉的制备

（1）ADSCs的复苏及培养

将低温保存的10代以内的人源性ADSCs细胞从液氮罐中取出，立即置于37℃的水浴锅中，轻轻晃动溶解。待细胞溶解后，将细胞转移至预先加入8mLPBS的离心管中，混匀后1000rpm/min离心5min，弃掉上清，加入α-MEM细胞培养液（含10%的FBS）悬浮细胞，制成单细胞悬液，加入至75cm2的培养瓶内，于37℃，5%CO2培养箱中培养。

（2）ADSCs的扩大化培养

待ADSCs细胞密度为80%-90%时，弃掉培养基，PBS清洗细胞，加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化1-2min，镜下观察细胞收缩、变圆时终止消化。轻轻吹打并将细胞悬液转移至离心管中离心，1000rpm/min离心5min，弃掉上清，加入10mlPBS，将细胞转移至10cm培养皿中，使用UVB紫外照射仪行3-6min低剂量的照射（事先UVB照射仪需紫外消毒处理），照射完成后，离心，加入α-MEM细胞培养液（含10%的FBS）悬浮细胞，制成单细胞悬液，加入至细胞工厂中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。

（3）ADSCs条件培养液的收集及冻干粉制备

待细胞工厂中的ADSCs细胞贴壁培养3d后无菌收集细胞培养液，并立即进行无菌浓度测定及冷冻干燥，待液体达到共晶点后，在真空状态下将液体升华冻干，制备成粉末状注射剂，即冻干粉。

2.表皮-黑色素细胞模型建立

（1）表皮细胞的分离及培养

将无菌的包皮组织PBS清洗后，剥离去除皮下疏松结缔组织，将皮片剪切成3*9mm的大小，浸泡于约5倍于组织的0. 25%Dispase酶液中，4 ℃消化16-18h。之后从取出的皮片上轻轻撕离表皮，双抗PBS洗两遍。将表皮放入细胞培养瓶或培养皿中，加入适量预热至37℃的胰酶/EDTA（含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA•2Na）消化液消化，消化时间为8-10min，并在消化过程中间隔晃动培养瓶。消化完成后加血清终止消化，液体经200目筛网过滤，滤液经两次800rpm/min离心6min后，加入表皮细胞培养液（KC培养液，含12.5mg/500mL的牛垂体提取物）悬浮，37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后换液观察。

(2)黑色素细胞的分离及培养

将无菌的包皮组织PBS清洗后，剥离去除皮下疏松结缔组织，将皮片剪切成3*9mm的大小，浸泡于约5倍于组织的0. 25%Dispase酶液中，4 ℃消化16-18h后转入恒温培养箱中孵育1h。轻轻撕离表皮，双抗PBS洗两遍，加入0.25%的胰蛋白酶消化5min，终止消化后，消化液经200目筛网过滤， 滤液1200rpm/min离心5min后弃上清，加入黑色素细胞培养基（M254培养基，内含HMGs因子）悬浮、37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后换液观察。

(3)表皮-黑色素细胞模型的构建

将处于生长期的表皮细胞培养至90％融合时，进行传代。弃掉旧的培养基，PBS清洗两遍后，加入胰酶/EDTA消化液（含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA•2Na）消化10-15min，加入含血清培养液终止消化，1000rpm/min离心5min后弃上清，PBS清洗后，1000rpm/min离心5min，弃上清，加入M254表皮细胞培养液悬浮，细胞计数后，加入6孔板中培养2d，细胞接种密度为2*104个/孔。

将处于生长期的黑色素细胞培养至90％融合时，进行传代。弃掉旧的培养基，PBS清洗两遍后，加入胰酶消化1-2min，加入含血清培养液终止消化，1000rpm/min离心5min，弃上清，进行细胞计数后，加入已培养2d的表皮细胞的6孔板中，细胞接种密度为2*103个/孔。每孔加入2mL表皮-黑色素培养基混合液（表皮培养液与黑色素培养液的比例为2:1），37℃、5％CO2培养箱中培养，即为表皮-黑色素细胞模型。

3.TGF-β的检测

（1）冻干粉与表皮-黑色素细胞模型的共培养

在超净工作台中将冻干粉用表皮-黑色素培养基混合液溶解后加入表皮-黑色素模型中，每孔2mL，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。以不加冻干粉的表皮-黑色素模型作为对照。

（2）细胞RNA的提取及浓度测定

弃掉细胞培养上清，每孔加入1mL Trizol试剂，充分裂解细胞后按照常规RNA提取方法提取细胞RNA。之后进行核酸浓度测定，并测定A260/A280数值。步骤如下：

每毫升细胞裂解液中加入200uL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置5min；

将分层的液体转移至事先预冷的4℃离心机中，12000rpm/min离心15min，此时样品 分为三层，底层为黄色水相，上层为无色水相和一个中间层；

轻轻将无色水相约400-500uL液体转移至1.5mL离心管中，加入等量的异丙醇，-20 ℃放置1-2h；

4℃，12000rpm/min离心10min，离心后弃上清，管底/管壁可见有白色沉淀产生；

加入500uL 75%的乙醇溶液洗涤，轻弹管壁，使白色沉淀溶解在乙醇溶液中；

4℃，12000rpm/min离心5min，弃上清；

室温放置5-10min干燥，待管壁沉淀周围透明即可；

每管加入30uL无RNase的DEPC水，轻轻吹打，并在56℃水浴锅中放置5-10min助溶。

将步骤获得的RNA使用BioTek Epoch超微量微孔板分光光度计测定其浓度 和纯度， A260/A280比值为1.8-2.0之间的RNA才可用到后续实验中。

（3）RNA的反转录

按照Takara反转录试剂盒的操作说明在PCR仪上进行。反转录体系为20uL，体系分配如下：

5*PrimeScript Buffer	4 uL
		RT Enzyme Mix	1 uL
Oligo d Tprimer	1 uL
		Random 6 mers	1 uL
RNA	x uL
		H2O	补足至20uL

反转录程序为：37℃ 15min，85℃，5s，4℃ forever。

（4）RT-PCR检测样品中TGF-β的表达量

以人源的GAPDH为内参基因，将反转录的cDNA作为模板，以SYBR Green 为染料进行 TGF-β的RT-PCR扩增。扩增体系为20uL，具体如下：

SYBR Green	10 uL
		Primer-F	0.5 uL
Primer-R	0.5 uL
		cDNA	1 uL
H2O	8 uL

反应条件：95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 30s，共40个循环；熔解曲线分析，60℃-95℃，间隔0.5℃采集一次信号，持续5s。

TGF-β引物：F：5，-GGCCAGATCCTGTCCAAGC-3，

R：5，-GTGGGTTTCCACCATTAGCAC-3，

GAPDH引物：F：5，- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3，

R：5，-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3，

利用Bio-Rad CFX Manager软件，将扩增得到数据进行2△△C(T)分析，以GAPDH基因的表达量作为Reference，以正常表皮-黑色素细胞模型作为样品阴性对照。

结果：表皮细胞与黑色素细胞共培养24h后细胞状态良好，两种细胞相互融合（图1）；加入冻干粉后，两种细胞融合较好（图2），RT-PCR检测，TGF-β基因扩增曲线平整，熔解曲线有单一的峰出现，与对照组相比，TGF-β表达量明显降低，且有极显著性差异（p﹤0.01）（图3），说明此人源性ADSCs冻干粉确有降低TGF-β表达量的功效，有生发的活性。

实施例2：

市售生发冻干粉对表皮-黑色素细胞模型中TGF-β含量的影响

1.表皮细胞和黑色素细胞使用前鉴定

（1）镜下观察

在表皮细胞和黑色素细胞胰酶消化的当天，对各自培养瓶中的上清液进行颜色观察，在倒置显微镜下观察细胞形态、细胞密度、有无细菌或霉菌生长。如有可疑，需抽样作无菌试验培养细菌、霉菌。

（2）活细胞比例：在表皮细胞和黑色素细胞胰酶消化的当天对收集的细胞悬液抽样检查活细胞比例占95％以上。

2.表皮-黑色素细胞模型的建立

将表皮单细胞悬液种植于6孔板中，培养2d后，加入黑色素细胞悬液，两种细胞共培养24h，镜下观察细胞融合情况，细胞有无污染现象。

3.市售生发冻干粉与表皮-黑色素细胞模型共培养后TGF-β表达的检测

将已证明具有促进毛发再生功效的市售生发冻干粉加入表皮-黑色素细胞模型中共培养，以正常表皮-黑色素细胞模型为对照。共培养24h后，收集细胞，提取细胞RNA，并进行反转录，RT-PCR扩增，之后进行数据分析。

结果：给与市售生发冻干粉前，表皮细胞和黑色素细胞融合较好，细胞无污染现象（图4）；冻干粉与细胞模型共培养后，细胞增殖良好，形态正常，无细胞死亡、崩解现象出现（图5），说明该生发冻干粉对细胞生长无毒性作用；RT-PCR扩增后TGF-β检测结果显示（图6），该市售生发冻干粉作用于表皮-黑色素细胞模型上，相对于细胞模型对照组，TGF-β的表达量明显降低，且有极显著性差异（p﹤0.01），与其宣传功效相一致。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种通过检测细胞模型中TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）收集人源性脂肪间充质干细胞（ADSCs）的培养液，浓缩、冻干处理后制备成冻干粉；

（2）分别将生长期的表皮细胞、黑色素细胞共培养后制备表皮-黑色素细胞模型；

（3）将权利要求（1）中的冻干粉以给药形式加入权利要求（2）中的表皮-黑色素细胞模型中，放入培养箱中培养，培养时间为24h；

（4）提取权利要求（3）中的细胞RNA，反转录，RT-PCR进行TGF-β表达量的检测；

（5）以PCR检测获得的TGF-β在mRNA水平的表达量变化评价冻干粉是否活性。

2.根据权利要求1所述的通过检测细胞模型中TGF-β表达量评价冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（5）中的评价冻干粉活性，具体为：进行TGF-β检测的PCR检测实验重复验证至少三次，至少获得三次TGF-β表达量数据，且每次TGF-β表达量明显低于细胞模型对照组，且有显著性差异（p﹤0.05）时，判定冻干粉有促进毛发生长的活性。