CN102027106B

CN102027106B - 用于产生小毛囊和新生乳头的方法及其用于体外测试和体内植入的用途

Info

Publication number: CN102027106B
Application number: CN200980116851.XA
Authority: CN
Inventors: 格尔德·林德纳; 罗兰·劳斯特尔
Original assignee: Technische Universitaet Berlin
Current assignee: Technische Universitaet Berlin
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2009-03-23
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2029-03-23
Also published as: CA2719769C; CA2719769A1; EP2274419B1; HUE026065T2; RU2507254C2; US9764064B2; PT2447357E; RU2010144183A; CN102027106A; EP2447357B1; ES2549055T3; EP2274419A1; DK2274419T3; AU2009228756B2; US20140370070A1; EP2447357A1; PL2447357T3; CY1112945T1; US8841124B2; HRP20120591T1

Abstract

本发明涉及用于产生小毛囊的方法，其包括以下步骤：a)提供新生乳头，b)提供选自成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞的其他细胞群，以及将所述新生乳头与至少一种其他细胞群在非贴壁培养容器中共培养。本发明还涉及产生新生乳头(可用于所述产生小毛囊的方法中)的方法。

Description

用于产生小毛囊和新生乳头的方法及其用于体外测试和体内植入的用途

本发明涉及通过在超低吸附性培养容器中将新生乳头(de novo papillae)与另一毛囊细胞群共培养来产生小毛囊(microfollicle)的方法。本发明还涉及用于产生新生乳头的方法，所述新生乳头可用于产生小毛囊的方法中。本发明的目标还有由前述方法所产生的小毛囊和新生乳头。所述小毛囊和/或新生乳头可用作治疗毛发减少状况的植入物，以及用于对物质的毛发调节作用或毒性作用进行体外测试。

由于毛发在人类非语言交流中具有重要作用，因此当毛发生长减少时，个体常常需要帮助。终极的治疗方法当然是恢复或再生新的、健康的、循环的毛囊。直到不久以前，药物都不能为这些患者提供任何有效的治疗。在20世纪晚期，有一些药物上市，它们确实刺激了毛发生长，尽管程度不高且并不一致。实例有米诺地尔、非那雄胺和拉坦前列素。毛囊发育与循环的协调需要复杂的时间控制和众多基因表达的改变，这很可能使得简单的药物方法无法治疗晚期脱发。因此，其效果无法达到在脱发的头皮上产生新毛囊的最终目的。通过利用已知怎样形成毛囊的细胞类型，基于细胞的疗法会比单纯的分子方法更早地在临床上实现。

基于毛囊细胞之疗法的一种方法需要取出少量毛囊，从其中分离出有活性的和/或诱导性的细胞，然后离体扩增这些细胞同时保持其产生新毛囊的特殊能力。显然，在能够开发出针对脱发的任何类型细胞疗法之前，保持真皮囊细胞(dermal follicular cell)的诱导能力和毛囊上皮细胞活性的细胞培养条件是必需的。早期研究显示，真皮细胞的诱导特性在体外随时间而衰退，因此研究集中于保持毛囊细胞在培养物中的生发能力。许多最新进展是由于完整毛囊及其细胞组分的培养方法的进步。在培养物中培养的人毛囊细胞包括囊乳头成纤维细胞(follicular papilla fibroblast)、外毛根鞘(outer root sheath，ORS)角质形成细胞和来自毛基质(hair matrix)的生发性上皮细胞(Tobin等，J.Invest.Dermatology 104(1)，86-88，1995)。

当前生物工程的努力目标是从已经在确定组织培养条件下增殖的分离细胞开始，产生或重构完全组织化的功能性器官系统。人们早就认识到毛囊具有很强的再生能力，因为它在个体一生中不断循环并再生其下半部分。真皮毛乳头和结缔组织鞘成纤维细胞在性质上与干细胞类似，具有特异性的毛发生长诱导特性。毛囊在其生长周期中利用活性上皮干细胞与强诱导性的真皮细胞之间的相互作用来进行自我更新。从毛囊的上皮和间充质干细胞来重构完整的毛囊是可能的。

针对脱发的任何类型细胞疗法所要解决的主要挑战包括毛囊形成的效率和细胞类型的选择，Stenn和Cotsarelis，Curr.Opinion Biotech.16，493-497，2005对其进行了总结。就毛囊生物工程而言，可从有或没有活性细胞(来自毛囊或其他上皮来源)的分离毛囊的真皮部分开始。将在培养物中扩增解离细胞的数量，然后将真皮细胞单独或与活性上皮细胞一起重新植入脱发的头皮。之前的研究已表明，从正确放置的诱导真皮细胞开始，会导致新毛囊的形成。此外，从解离或聚集的生发性上皮和真皮细胞的组合开始，这也已被证实是产生新毛囊的有效方法。

基于细胞的脱发治疗方法的首次尝试很可能是使用自体组织来进行毛囊生物工程，以避免供体细胞的免疫排斥作用。但是，基于毛囊是不表达I类MHC(主要组织相容性复合体)抗原的免疫赦免位点的理念，能够开发异源(异体)毛囊组织用于组织移植的诱人可能性是存在的。虽然如此，这类方法的安全性测试和法规障碍会需要大量的财力资源。

毛囊生物工程的另一可能方法涉及在体外实际形成作为小器官的毛囊，然后将新形成的毛囊移植回脱发头皮。从DE 101 62 814 B4中已知，可通过提供假真皮或假真皮制备物以及假乳头(含有在合适的载体上或合适的基质中形成的培养的真皮乳头细胞)或假乳头前体(含有在能原位形成基质的合适基质形成介质上培养的真皮乳头细胞)并将所述假乳头或假乳头前体引入所述假真皮或假真皮制备物中来产生皮肤和毛发等同物。这类方法会需要复杂得多的细胞培养系统(包括三维基质，可能含有合适的生长因子)，以使真皮和表皮细胞向正常毛囊的三维结构分化。特别地，乳头结构只能通过在所述假真皮中形成空腔(如通过穿孔或穿刺)并将所述假乳头(其塑形成使其大小与PD中形成的空腔相对应)置于其中来获得。该方法缺乏在近似生理乳头结构中细胞的自发排列和直接的细胞接触。

最近显示了用于产生源于毛囊或其含有乳头的真皮部分的多能干细胞或其后代群的另一方法。WO 2005/071063 A1的方法包括在多能干细胞非贴壁生长和增殖条件下培养所述毛囊或含有乳头的真皮部分。通过该方法并不得到真皮乳头，而是得到直接用于在哺乳动物中诱导毛发生长或再生皮肤的分离的多能干细胞。但是，该文献中也认识到，形成了一定量的贴壁细胞，这被WO 2005/113747 A2所证实，其公开了通过在立体条件下培养而产生来自于至少两种多能成体干细胞类型的多细胞聚集物的方法。目前，所述类器官体仅限于从外分泌腺组织收集的上述干细胞。

因此，构成本发明基础的技术问题是避免现有技术的上述缺点以及提供产生重建的毛囊和乳头的方法，它们可自由排列且容易成为生理DP的大小和形状。本发明所解决的另一问题是找到毛发等同物或皮肤替代物，它们将适于用作体外模型，更特别地用于测试和/或评估活性物质，最特别适用于毛囊。

本发明通过提供用于产生哺乳动物小毛囊的方法来解决所述问题，所述方法包括以下步骤：

(a)提供至少一个新生乳头，

(b)提供至少一种其他细胞群，其选自成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞，以及

(c)将新生乳头与所述至少一种其他细胞群在非贴壁培养条件下进行共培养。

术语“新生乳头”或“新乳头”在本文中可互换使用，表示哺乳动物真皮毛乳头成纤维细胞(dermal hair papilla fibroblast，DPF)的细胞聚集物，所述DPF具有分离后毛囊的生理真皮乳头(dermal papilla，DP)的至少一半大小和近似形状。新生乳头可包含包被层，其含有一种或多种不同的细胞外基质蛋白(优选胶原蛋白IV、纤连蛋白和/或层粘连蛋白)。这种包被层可由形成新生乳头的DPF本身产生，或者可以在新生乳头根据产生小毛囊之方法的步骤(c)进行共培养之前的任何阶段加入。

术语“小毛囊”和“新毛囊”在本文中可互换使用，指不完整的哺乳动物毛囊结构，其由真皮细胞支架构成，但缺少其他细胞类型(如肌细胞、神经、血管等)，使其尺寸小于天然毛囊。本发明的小毛囊由新生乳头构成，所述新生乳头被选自成纤维细胞、角质形成细胞和/或黑素细胞的至少一种其他细胞群的细胞稳定覆盖或定殖。所述成纤维细胞、角质形成细胞和/或黑素细胞不必来源于哺乳动物毛囊，而是可以来源于其他哺乳动物组织。优选地，本发明的小毛囊由新生乳头构成，所述新生乳头被至少一种其他细胞群的细胞稳定覆盖或定殖，所述细胞群来自和/或可来自哺乳动物毛囊，例如选自结缔组织鞘成纤维细胞、角质形成细胞和/或黑素细胞。所述小毛囊的三维形式模拟生理哺乳动物毛囊的三维外观。特别地，所述小毛囊可以是三维成形的、任选地在空间区分开的重建新生乳头，所述新生乳头的表面上具有毛囊样结构，包括类似于毛发形态发生最早阶段的那些，并包含真皮乳头细胞。

本发明涉及用于产生毛囊的含有多个步骤的方法。

这些步骤包括提供新生乳头。根据本发明，要提供的新生乳头可通过任何合适方法产生，优选使用按照根据本发明下文所述产生新生乳头的方法之一所产生的新生乳头。

所述步骤还包括提供其他细胞群。所述其他细胞群可来自哺乳动物毛囊，优选来自与DP制备所用相同的毛囊，并在非贴壁培养容器中将所述新生乳头与至少一种其他细胞群共培养。可按照确定的方法从哺乳动物毛囊中分离至少四种不同细胞群，即DPF、结缔组织鞘成纤维细胞(fibroblast of the connective tissue sheath，CTSF)、角质形成细胞(keratinocyte，KC)和黑素细胞(melanocyte，MC)，在标准条件下分别培养，然后进行繁殖。也可以从这些分离物形成具有长期生存力的细胞培养物并使用，例如用于筛选方法。

本发明的一个优选实施方案是，所述其他细胞群选自成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞。所述成纤维细胞、角质形成细胞和/或黑素细胞不必来源于哺乳动物毛囊，而是可来源于其他哺乳动物组织。所述成纤维细胞优选源于结缔组织鞘。

优选地，所述至少一种其他细胞群来自和/或可来自哺乳动物毛囊，其选自结缔组织鞘成纤维细胞、角质形成细胞和/或黑素细胞。

本发明的另一优选实施方案是，所述新生乳头至少与角质形成细胞进行共培养。补充了角质形成细胞以用于基本的小毛囊再生。本发明的另一优选实施方案是，向乳头培养物同时提供角质形成细胞和黑素细胞。添加黑素细胞对研究毛发色素沉着或以后植入期望的发色特别有用。也可向下文所述用于产生新生乳头之方法的非贴壁细胞培养容器(如超低贴壁培养瓶)中加入其他分别扩增的细胞组分，其中所述培养瓶中已产生了新乳头。将角质形成细胞或者角质形成细胞与黑素细胞的混合物以特定混合比加入到包被的新乳头中，并以合适培养基在非贴壁培养容器中孵育数天。KC∶MC的优选比例为2∶1、5∶1、10∶1或20∶1。共培养持续至少12小时，优选1天至5周，更优选2天至3周，最优选1周或大概2天。为了形成更好模拟毛囊结构和功能的多层新生毛囊，其可通过用CTSF包被所产生的新毛囊一段确定时间(选自12小时至10天，优选1至5天，最优选大概2天)来获得。在这些条件下，所述细胞混合物发育成囊状结构，形成毛囊的典型特征，如毛干的发育。从形成大致的毛干开始，所述器官样结构被称作小毛囊。

在用于产生小毛囊的本发明方法的一个优选实施方案中，

(a)提供新生乳头；

(b)将新生乳头与KC、MC或者KC和MC的混合物以预定比例接触，并在非贴壁培养容器中共培养预定长度的时间；

(b’)任选地，重复步骤(b)，优选地，其中使用与第一轮所用不同细胞类型的细胞进行接触和共培养；

(c)任选地，在步骤(d)之前和/或同时，可用细胞外基质蛋白(优选胶原蛋白IV)包被步骤(b)或(b’)的被覆盖新生乳头；

(d)在非贴壁培养容器中将步骤(b)、(b’)或(c)的被覆盖新生乳头与CTSF共培养预定长度的时间。

本发明还涉及提供用于产生新生乳头的方法，其包括如下步骤：

(a)提供来自至少一个哺乳动物毛囊的至少一个真皮乳头(DP)，

(b)通过将所述DP机械固定在细胞培养容器表面上而从所述DP中分离真皮毛乳头成纤维细胞(DPF)，由此使基底层有孔以允许所述DPF迁移出来，

(c)在无胶原蛋白包被的单层培养中扩增分离出的DPF，其中所述DPF至少传代一次，

(d)将所扩增的DPF浓缩成显示出生理DP的大小和形状的细胞聚集物，其中将所述DPF以每个容器表面1,000到100,000个DPF/cm²的细胞浓度在非贴壁培养容器中进行分化，或者将所扩增的DPF浓缩至少48小时，以及

(e)用细胞外基质蛋白(优选胶原蛋白IV、纤连蛋白和/或层粘连蛋白)包被新生乳头。

(a)提供来自至少一个哺乳动物毛囊的至少一个真皮乳头(DP)，

(c)在无胶原蛋白包被的单层培养中扩增所分离的DPF，其中所述DPF至少传代一次，

(d)将所扩增的DPF浓缩成显示出生理DP的大小和形状的细胞聚集物，其中将所述DPF以每个容器表面1,000到100,000个DPF/cm²的细胞浓度在非贴壁培养容器中进行分化，并且其中将所扩增的DPF浓缩至少48小时；

(e)任选地，用细胞外基质蛋白(优选胶原蛋白IV、纤连蛋白和/或层粘连蛋白)包被新生乳头。

特别地，正是所分离DPF的扩增和生理施用形式代表了现有技术将这些细胞用于毛发生长诱导的限制因素。需要多个增殖周期才能达到所需的细胞数量，这期间单层培养物中培养的细胞(特别是真皮乳头成纤维细胞)丧失其诱导能力，经验显示是在5-8个增殖周期后。这样处理的细胞去分化并表达干细胞标志物，但不再能用于产生毛囊。

出乎意料地，本发明人证实，在本发明的特定培养条件下(其中在细胞培养之后扩增的DPF以确定的浓度转移到特殊非贴壁细胞培养容器中)，细胞在数天到数周后达到分化和稳定水平或重新获得其毛发生长诱导能力。除了重新获得诱导特性以外，出乎意料地发现，作为活跃的细胞间接触和信号分子交换的结果，所述细胞随后形成细胞聚集物并分化。在这些特定条件下，分离之后这样处理的细胞在浓缩成与毛囊中真皮乳头生理形状大致对应的大小和形状。为此，所用细胞/培养容器表面的比例至关重要。

在步骤(a)之前，毛囊取自作为患者或供体的哺乳动物。特别是从人、啮齿动物、猪、犬科动物、猴、羊、猫或狗(优选人)中收集样品。基本上优选通过皮肤活检收集组织样品，特别是从患病位置附近所选取的。在本发明中，毛囊样品优选从头发、胡须、眉毛、阴毛或其他体毛中提取。毛囊的提取根据医疗管理规范进行。可纯化所述样品以除去干扰物质。

步骤(a)中来自毛囊的DP的提供以及DPF的分离按照从之前标准流程新开发的形式来进行。使用小片皮肤活检，将表皮从下层的真皮和脂肪组织上切下，例如使用解剖刀。将所述脂肪组织稍加压迫(例如使用镊子)，以便于在解剖显微镜下容易地制备其中的毛球。将这样分离的毛囊固定在毛干上(例如再次用镊子)，将结缔组织鞘小心地沿径向分离(例如用另外一把镊子)，从而将所述毛球外翻而暴露DPF和带有毛基质的毛干。通过这种方法，将毛球的近端部分与结缔组织鞘成纤维细胞和真皮乳头一起容易地与毛囊的其余部分分开，比如通过使用针或插管。此外，任选地制备毛干(其包含同样需要的毛基质角质形成细胞和黑素细胞)用于进一步培养。

之后在步骤(b)中，将分离的真皮乳头转移到细胞培养容器中，并机械固定在容器表面上。优选地，通过使用针尖或解剖刀使分离的真皮乳头机械停止在培养容器底部来获得DPF，而不对其进行酶促分离。优选每个培养容器孵育1至8个DP。特别地，例如，将2至4个DP 转移到例如6孔或12孔培养板的每个孔中，并固定在板底。结果，基底层稍有穿孔，但大致保留了乳头形态，并且DPF可从真皮乳头中迁移出来并增殖。

在步骤(c)中DPF的培养在标准培养基中不使用胶原蛋白包被来实现，所述标准培养基优选含有减量的胎牛血清(FCS)(例如10％，而不是常规的20％FCS)且额外补充抗生素(如1×青霉素/链霉素)。分离之后，第一次培养基更换优选最早在1周、最晚2周后进行。一旦细胞从DP中长出，就根据细胞密度每周1到2次更换培养基。当细胞达到70-80％会合时，使其从板底脱离(例如通过在室温下使用胰蛋白酶/EDTA)并传代到其他培养容器(如T25细胞培养瓶)中。在培养过程中，可进一步扩增细胞以直接用于实验，或将其冷冻在液氮中备用。尽管传代数不受限制，因此如果有存活力的话就可将细胞扩增至任意高的密度，但是优选将所述DPF传代至少两次，更优选至少五次，最优选少于九次。对高通量方法，优选传代八次。因此，在本发明的另一优选实施方案中，通过浓缩非诱导性DPF来实施所述方法。意想不到的发现是，这种缺乏诱导特性的DPF仍可用于组织工程。

接下来是步骤(d)的浓缩阶段，其中在含有培养基的非贴壁培养容器中培养所分离、增殖的DPF，所述培养基包含确定的组分，即标准培养基。在这一系统中，特殊的容器表面或容器表面(特别是底面)的特殊涂层减弱了细胞附着，或者甚至阻止细胞附着到表面上。优选地，非贴壁培养容器由玻璃、聚苯乙烯和/或用抗贴壁涂层处理的表面制成。更优选地，对容器应用PTFE或聚HEMA包被的表面。本发明范围内特别优选使用超低附着培养容器，例如由Corning、Inc.、USA分销的那些。这种非贴壁容器和涂层为本领域技术人员所知，且易于购买或加工。

自由接触的结果是，细胞聚集成确定的大小，在数天后形成大小和形状与原始乳头相似的聚集物。优选将扩增的DPF浓缩至少48小时、2至5天，更优选2至3天，最优选大概2天；并任选地进一步培养3至15天，优选5至10天或2至21天。同样，所形成浓缩物的大小和形状取决于取出皮肤活检的区域。从胡须、体毛、眉毛、阴毛或头发取出并经过扩增的DPF形成不同大小的细胞聚集物，这又进而决定了相应毛发的形状、大小和长度。更重要的是接种到瓶中的起始细胞数，它必须与容器表面为合适的比例。在所述方法的另一实施方案中，步骤(d)中每个容器表面的细胞浓度为2,000至50,000个DPF/cm²，优选3,000至20,000个DPF/cm²，更优选5,000至10,000个DPF/cm²，最优选大概6,666个DPF/cm²。

在这一阶段，自身产生的基质已经在浓缩物周围形成。为了加快这一进程并以靶向方式对其施加影响，此时向培养基中加入生理基质组分以形成模拟真皮乳头特性的囊。在后续步骤(e)中，用由细胞外基质蛋白的组合物包被这样获得的新生乳头。制备该组合物以模拟生理组合物。优选地，它可由胶原蛋白IV、纤连蛋白和/或层粘连蛋白组成。特别优选的是，所述细胞外基质蛋白是重量份2-6∶0.5-2∶0.5-2的胶原蛋白IV、纤连蛋白和层粘连蛋白的混合物，优选重量份大致为4∶1∶1.15。但是，并不排除前述细胞外基质蛋白也可单独使用或以不同体积百分比使用，或与其他基质组合。在本发明的另一实施方案中，所述细胞外基质蛋白还含有其他胶原蛋白(例如1、10A1、18A1)、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖，优选硫酸乙酰肝素、核心蛋白聚糖(decorin)、硫酸角质素、双糖链蛋白聚糖(biglycan)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、多功能蛋白聚糖(versican)、基底膜蛋白聚糖(perlecan)、CD44v3和/或多配体蛋白聚糖(syndecan)。此外，将新乳头的这一包被过程在尽可能低贴壁的细胞培养容器(例如超低附着性细胞培养容器)中进行。所述包被过程进行1至5天，优选1至2天。

本发明还涉及通过可根据本发明方法获得的新生乳头和毛囊。合适时，本说明书关于产生新乳头和小毛囊之方法的前述教导均认为是有效且适用的，而不受限于所述生产方法的产品。

本发明的新生乳头和/或小毛囊都可用于生产皮肤等同物。优选地，根据标准方法例如通过使用Matriderm(Dr.Suwelack Skin & Health Care AG)构建所述皮肤等同物，并且小毛囊的插入位点用双光子激光以规律间距切出，或用打孔机预穿孔得到。因此，含有本发明新生乳头和/或小毛囊的皮肤等同物是本发明的另一目的。除了重建的真皮乳头之外，它们还含有可由自身形成表皮结构或周皮结构的一层或多层角质形成细胞，并任选地含有一层或多层可应用于真皮乳头结构上方的黑素细胞。

本发明的新生乳头和/或小毛囊也可用作植入物。因此，本发明的另一目的是植入物，其含有有效量的本发明新生乳头和/或本发明小毛囊作为活性成分，任选与可药用辅剂一起使用。

相似地，本发明的皮肤等同物可用作移植物。本发明的另一目的是提供移植物，其含有有效量的本发明皮肤等同物作为活性成分，任选与可药用辅剂一起使用。

术语“有效量”表示对疾病或病理状况分别具有预防或治疗相关作用的植入物或移植物的量。预防作用在单个代表渗入之后阻止疾病的发病或甚至病原体的感染，从而严重削弱了所述病原体的后续增殖或甚至使其完全失活。治疗相关作用在一定程度上减轻疾病的一个或多个症状，或者使引起所述疾病或病理状况或与其相关的一个或多个生理或生化参数部分或完全恢复正常。为实现想要的缓解毛发量减少症状的预防或治疗作用，所施用植入物或移植物的相应量要足够高。应当理解的是，任何哺乳动物的具体剂量水平、给药频率和给药周期将取决于多种因素，包括所用具体组分的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、施用时间、施用途径、药物组合和具体疗法的严重程度。使用众所周知的手段和方法，确切的量可由本领域技术人员作为常规实验来确定。

使用药物工程常见的固体或液体载体、溶剂和/或添加剂以及常用辅剂，以合适的量(其取决于预期的施用方式)以已知方式生产本发明的植入物或移植物。这些可药用赋形剂包含盐、缓冲剂、填充剂、螯合剂、抗氧化剂、溶剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂、添加剂、防腐剂和助悬剂。在本发明的含义中，“辅剂”表示在同时、同期或依次施用时允许、强化或改变由植入或移植引起的特定机体应答的每种物质。与活性成分组合以产生单一剂型的赋形剂材料的量根据所治疗的宿主和具体施用方式而变化。

根据引入的方式，植入物或移植物可分别按照多种方法制造。制剂中治疗活性成分的浓度可为约0,1到100wt％不等。它们可单独施用或与其他治疗组合施用。

本发明还教导用于毛发量减少状况的预防或治疗处理的本发明新生乳头、小毛囊和/或皮肤等同物。本发明方法的前述产品优选用于治疗性处理。治疗相关作用在一定程度上减轻毛发量减少的一种或多种症状，或者使引起所述病理状况或与其相关的一个或多个生理参数部分或完全恢复正常。倘若将本发明方法的产品以不同间隔施用，例如为了加强增殖应答并根除所述状况的症状，则将监测认为是一种治疗方法。可使用相同的产品或不同的产品。在本发明的含义中，如果受试者具有开始掉发的任何先决条件如家族因素、遗传缺陷或以前患过疾病，那么预防性处理是可取的。

本发明所涉及的毛发量减少的病理状况可由脱发(例如雄激素性脱发、斑秃等)、遗传性秃顶、瘢痕、烧伤、放射治疗、化学治疗、疾病相关性脱发、意外伤害、毛囊损伤、手术创伤、切口伤或皮肤移植的接受部位创伤所致。

本发明还涉及本发明的新生乳头、小毛囊和/或皮肤等同物用于分别产生植入物或移植物的用途，所述植入物或移植物用于毛发量减少状况的预防或治疗性处理。可施用所述植入物或移植物来提前预防哺乳动物(优选人类个体)开始脱发及其引发的结果，或者治疗正在产生和持续的症状。

本发明的另一目标是提供用于治疗毛发量减少状况的方法，其中在需要这种治疗时将本发明的新生乳头、小毛囊和/或皮肤等同物引入哺乳动物的皮肤中。所述小器官样毛囊(特别是自体/异体人毛囊前体)用于以诱导毛发生长为目的的移植，而皮肤替代物确实使皮肤(优选头皮)再生。将所述小器官样毛囊引入预先脱毛并小型化的受影响皮肤区域毛囊(峡部，isthmus)的开口中。优选地，注射所述新生乳头和小毛囊，更优选利用大约150μm大小的特殊构造装置。还优选的是，将所有组分以自体形式使用，并在GLP/GMP条件下进行处理。所述新生乳头、小毛囊或毛囊区室(hair follicle compartment)刺激新发生的毛发生长，例如在遗传性脱发、瘢痕(烧伤)、疾病相关性脱发、化疗/放射诱导脱发和本说明书中已描述的相似情况下。通过微介质(micro-medium)促进小毛囊成熟成为具有长期生存力的毛囊，即永久性的远端毛囊。

本发明还涉及将前述产品用于对发挥毛发调节作用的物质进行直接的药理学和美容学体外测试。所述毛发调节作用特别地选自毛发生长、毛发形状、毛发结构、毛发颜色和毛发色素沉着。优选分析调节毛发生长的效果，在脱发的情况下(如由脱发引起的)以促进毛发生长为目的，以及在不期望的毛发过度生长的情况下(如由多毛症和/或女性多毛症或女性胡须生长或不想要的体毛引起的)以抑制毛发生长为目的。特别地，高通量方法的使用使得制药业和化妆品业能够有效测试现有物质或新物质的潜在毛发生长调节作用。所述物质包括药物制剂、化妆品制剂、化合物、聚合化合物、生长因子、细胞产物、活细胞和/或生物分子。此外，在向小毛囊中加入黑素细胞(即形成色素的细胞)时，可研究物质对所形成毛干的色素沉着和/或着色的作用。类似地，也可测试所述物质对毛发形状和毛发结构的作用，例如形成卷曲等。

可评估或测量下述终点以获得物质在改善毛发结构和影响毛发生长方面之效力的信息：分析毛干形成、毛干的长度生长和特征、毛发阵列分析、真皮乳头的体积和结构、增殖测定(例如Ki67表达、BrdU掺入等)、凋亡测定(例如TUNEL、酶分析、膜联蛋白测定等)、差异性标志物测定(例如免疫组化、原位杂交、RT-PCR等)、测定作为DPF标志物的碱性磷酸酶、分析某些毛发特异性蛋白(毛发特异性角蛋白等)，分析细胞因子、生长因子、趋化因子和所有类型(例如由真皮乳头形成)的信使物质(例如通过BioPlex、ELISA等)，和/或对显示出表现增强的基质蛋白、生长因子(例如MSP、HGF、CTGF等)、转录因子、wnt途径中的分子(例如DKK1、BMP2-4等)、白介素(例如IL-6等)和/或趋化因子/趋化因子受体(例如CXCR等)以及显示出表现降低的凋亡诱导分子和/或增殖刺激分子进行的蛋白质组或表达分析。对毛发色素沉着的影响可以通过黑素细胞的排列/迁移、黑色素颗粒的形成/分布和酪氨酸酶的活性和/或对参与黑色素合成的基因表达进行的芯片分析来测定。本发明的其他实施方案、修改和变化对阅读本说明书的技术人员来说也是明显的，并可将其加以实施而不偏离本发明的范围。

此外，本发明的新生乳头或小毛囊可以分别使用，或者与带有毛囊的皮肤等同物的形成相结合，用于在医药业、制药业和美容业中对物质进行体外药理学和毒理学测试。在必须对其物质和产品进行毒性作用测试的情况下，这种用途(例如以高通量方法进行操作)对制药业、化工业和化妆品业特别有意义。新的法律条文要求用合适的体外测试方法代替以前的动物测试。因此，小毛囊自身以及整合有小毛囊的人造皮肤替代系统可用作毒理学研究(包括刺激、遗传毒效应等)的理想筛选系统。本发明的模型结构可完全替代动物测试并代替不那么合适的现有体外模型，因为本模型使分析复杂生理学过程成为可能。可通过在生物反应器中将所述模型结构与目标物质接触来进行这种测试。在物质特异性孵育期(尤其是3分钟到4小时)之后，将所述模型用培养基进行清洗，其后通过本说明书之前示例性性描述的合适分析方法进行分析。

本发明还教导了用于筛选调节毛发特性之物质的方法，其包括下述步骤：提供本发明的新生乳头、毛囊和/或皮肤等同物的样品，将相应样品分成多个部分，将至少一个部分与待筛选物质进行孵育，以及比较该部分样品中与另一部分未与所述物质孵育的样品中的毛发特性参数。简单地说，本发明方法使得可以通过本发明模型来鉴定和分析对毛发产生影响的物质。将所述样品(应当理解为含有一定数量的本发明目标产品)分成多个部分。至少提供两个亚组；一组用于筛选，同时另一组作为阴性对照。优选地，筛选部分的数量大于对照部分的数量。通常，将多个部分用于高通量筛选。本发明方法中的待筛选物质不受任何限制。在本发明的一个实施方案中，所述物质选自核酸(包括RNAi、核酶、适配体、抗体、肽、糖类、聚合物、分子量在50至1,000Da之间的小分子，以及蛋白质，优选抗体、细胞因子和脂笼蛋白。这些物质通常可以文库形式获得。优选在每部分样品中孵育一种化合物。但是，也可以通过在一个部分中孵育至少两种物质来研究物质的协同效应。另一受试亚组是在无所述物质的情况下同时进行孵育。孵育方法取决于多种参数，例如细胞类型和检测灵敏度，所述参数的优化遵照本领域技术人员已知的常规流程进行。本发明意义上的有效物质的鉴定是间接进行的，优选通过测定表达模式和/或细胞生存力的改变来进行。所述测定在特定时刻进行，并且与实验开始时的信号强度和阴性对照相关联。合适的测试为本领域技术人员所知，或者可按照常规容易地进行设计。

此外，本发明可以试剂盒的方式实施，所述试剂盒含有根据本发明的新生乳头、小毛囊、皮肤等同物、植入物和/或移植物，其特别是用于分别实施治疗毛发量减少状况或筛选物质的本发明方法。本发明的试剂盒可包括这样的物品，其含有如何实施本发明方法的文字说明或向使用者指出该文字说明所在。对于进一步的细节，可参考上文关于本发明治疗方法和筛选方法的陈述，其也适用于本发明的试剂盒。

在本发明的范围内第一次提供了用于产生新生乳头和小毛囊的方法，所述方法通过三维培养以及细胞浓度与培养容器表面的特定比例将扩增的DPF浓缩成生理性细胞聚集物。如同从生成毛干之小毛囊的形成中所见到以及通过基因和蛋白质表达分析所得到的，所述DPF在特定浓缩之后重新表现出其原始的诱导特性。由于本发明过程中可重建细胞的诱导特性，所以扩增细胞的代数并不重要。因此，在非贴壁培养容器中进行三维培养时，有利的是可以使用恒定且大量的起始细胞并以可再现的方式进行培养基的受控补给。与用于普通分化实验的其他3D培养方法(如微团、小块培养或悬滴法)相比，本发明培养系统中的细胞不会被迫使进行细胞-细胞接触，而是能够独立地结合而形成细胞聚集物以及(对于DPF而言)乳头样浓缩物。

提供由所述生产方法所定义的新生乳头、小毛囊和皮肤等同物产生了分别用于毛发量减少状况的预防或治疗性处理的植入物或移植物。本发明产品具有许多优点。毛囊等同物和皮肤替代物比分离的毛囊更为标准化。它们降低了对毛囊的需求，而且比任何已有模型更接近于体内情况。本发明的复杂三维模型模仿体内毛囊的结构和组织学组成，使得在活性物质效力和相容性方面提供了具有高水平相关性的信息。本发明的所有产品的其他特征还有高稳定性、低制造费用、便于操作，并可在任何时间提供。这些特性构成标准化流程中可再现操作的基础，以及与其匹配效应分子之间可靠安全的相互作用的基础。它们的应用是有前途的新方法，可用于直接且即时导致症状减轻的广谱疗法。

本发明的产品适合于医学、药学和化妆品领域的多种应用，如用于开发化妆品，或用于发现通过影响毛发色素沉着、毛发生长、毛发结构等而对毛囊具有生物效应的活性物质，这可通过体外测试系统或筛选方法进行，由此提供与体内情况相关的物质对毛囊细胞之作用的信息。因此，所述产品的提供对大规模筛选测试特别有益。它们均可应用于适于高通量的筛选方法，以鉴定用于毛发的生长促进或生长抑制的活性物质，以及用于物质和化学品的毒理学测试。本发明的产生方法及其产生的筛选方法可以简单快捷的方式实施。此外，可以高成本效益地生产合适的试剂盒。

应当理解的是，本发明不受本文中所述的特定方法、产品、试剂盒或用途的限制，因为它们当然是可以改变的。还应当理解的是，本文中所用的术语只是为了描述特定实施方案，而并非想要限制本发明的范围，该范围仅由所附权利要求所定义。如本文(包括所附的权利要求)中所用的，无数量词修饰的均可包含复数含义，除非上下文中明确指出相反的含义。因此，例如提到“容器”时包括一个或多个容器，它们可以为相同或不同的大小、形状或组成，提到“方法”时包括涉及本领域普通技术人员所知的等同步骤和方法，等等。除非另有定义，否则本文中所用的所有科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。

尽管与本文中所描述的那些相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，还是在下文中描述了合适的实施例。提供下述实施例作为示例而非作为限制。在所述实施例中，使用无污染活性的标准品试剂和缓冲剂(只要有可能)。

附图：

图1显示：

A)取自面部提升手术的供体皮肤的钻取活检。虚线表示用于进一步毛囊分离的真皮皮下边界切割线。

B)通过新技术解离“截断的”和解离的毛囊(突出显示的方框)：将结缔组织鞘沿毛干径向拉出，对毛干进行纯分离，其一侧为外根鞘和内根鞘角质形成细胞和黑素细胞，另一侧为真皮乳头和结缔组织鞘。

C)带有其成纤维细胞和邻近的真皮乳头的解离的结缔组织鞘，其可被准确地切下(突出显示的方框)。

D)电子显微镜术显示的解离的真皮乳头。

E)真皮乳头成纤维细胞从轻微受损并固定的真皮乳头中长出，其囊结构几乎是完整的。

F)在未包被75cm²培养瓶中第三次传代培养的真皮乳头成纤维细胞。

G)在超低附着性75cm²瓶中形成真皮乳头样浓缩物的真皮乳头成纤维细胞。

H)6孔低附着板中待加工成具有细胞外基质组分之新乳头的真皮乳头成纤维细胞浓缩物的放大图。

图2显示：

A)带有细胞外基质及其周围角质形成细胞的新乳头(白色箭头)，已将其加到超低附着板上形成多细胞浓缩物。

B)在超低附着培养物中24小时后囊结构形成的最初迹象。

C)1周后的新毛囊形成。原始毛干的形成清晰可见。

D)由DIC光学显微术显示的新毛囊形成，展示了培养1周后的完整真皮乳头结构。

E)插入到皮肤等同物中的新毛囊，其显示出确定的毛囊样结构。突出显示的方框显示了向下生长的毛囊。使用倒置显微镜可看到囊/皮肤等同物的近端部分。

F)新毛囊在皮肤等同物中的进一步培养，其证实了毛囊的明确锚着和继续生长。

图3显示：

不同发育和形成阶段中的使用来自哺乳动物毛囊以外来源的KC和MC产生的新毛囊：

A)阶段1：被黑素细胞和角质形成细胞所包围的新毛囊(未添加外源细胞外基质蛋白)，其已添加到超低附着板上形成早期多细胞浓缩物。

B)阶段2：在超低附着培养物中24小时后囊结构形成的最初迹象(注意在顶端的突起)。附着的细胞粘附在新乳头上并且采取扁平的形状。

C)阶段3：在毛囊样鞘发育1周后新毛囊形成开始。

D)阶段4：在新毛囊中，清晰可见的初始毛干形成开始可见。

图4显示：

两个不同时间点的功能性新毛囊形成：

A)浓缩48小时之后；以及

B)浓缩7天之后；在第7天，细胞聚集更加致密，并且自身来源的细胞外基质的形成开始可见。

实施例：

实施例1：分离并培养人毛囊真皮乳头成纤维细胞(DPF)、结缔组织鞘成纤维细胞(CTSF)、角质形成细胞(KC)和黑素细胞(MC)

在对来自大量面部提升手术的人头皮样品进行显微解剖后获得了单个毛囊，所述样品按照法规要求获取。为了分离基质KC和MC、CTSF和真皮乳头成纤维细胞(DPF)，使用解剖刀将皮肤于在真皮-皮下界面处切开，在解剖显微镜下用镊子将处于生长阶段(生长期)的毛囊拔出。

与已有描述的分离技术(例如Magerl等，Methods Exp.Dermat.11，381-385，2002)相反，所需细胞群的纯净组分通过对所分离毛囊上部的结缔组织进行纵切获得。通过在一端固定毛干，可用镊子将CTS从毛基质中朝向下方近端部分(lower proximal portion)沿径向拔出。利用该技术可自动暴露DP细胞，避免了损伤和细胞类型的混杂。因此，可将所述CTS和真皮乳头以及包含KC和MC细胞的毛基质明显地分开，并且容易用解剖刀加以剥离。

通过用针将其固定于培养板上，将DP和CTS分离物分别培养在6孔细胞培养板中(每孔2-4个)。为了使其迅速生长但仍同时保持成纤维细胞的囊状形态及微环境，将薄膜轻微划破以松散细胞外基质(ECM)。用外加10％胎牛血清(FCS)的DMEM+(Gibco/lnvitrogen)浸没细胞，直至1-2周之后基于供体改变观察到成纤维细胞生长。然后，将细胞转移于25cm²培养瓶中再培养一周，再进一步传代到75cm²培养瓶中。在达到亚会合(sub-confluence)后，将第3代分到3个75cm²瓶中，获得1.5-2百万个DPF或CTSF。

通过胰酶消化(0.05％胰蛋白酶和0.53mM EDTA)将KC和无黑色素的毛囊MC从剩余发干及附着的毛基质中迁移出来，通过差异性胰酶消化分离，并按照Tobin等，J.Invest.Dermatology 104(1)，86-88，1995中所述的标准方法进行培养。

实施例2：形成新乳头

将优化计数的500,000个DPF接种于含有DMEM+的75cm²超低附着培养瓶(Corning)中，使其形成细胞聚集物。静置48小时后，这些细胞聚集物形成天然人毛囊真皮乳头的大小。然后将聚集物转移到6孔超低附着板中，并向孔中加入层粘连蛋白(终浓度11.5μg/ml)、纤连蛋白(终浓度10μg/ml)和胶原IV(终浓度40μg/ml)的混合物。培养24-48小时后，内源ECM分泌物与加入的蛋白质形成稳定的基质包裹，新乳头已形成。为了促进更快的ECM积累和分化，可以任选地向培养基中加入生长因子，即肝细胞生长因子(30ng/ml)和/或结缔组织生长因子(20ng/ml)。这些新乳头已经准备好植入体内的皮肤以发生毛发诱导特性。

实施例3：形成新毛囊

向超低吸附培养瓶(6孔，Coring)中的新乳头加入250,000个KC和MC(10∶1)，并将DMEM+培养基更换成确定的角质形成细胞无血清培养基(Gibco)。1周后，有覆盖的新乳头形成毛囊样结构。上述新毛囊已经可以用于测试。为了制作更好地模拟毛囊结构和功能的多层新毛囊，其可通过在具有DMEM+10％FCS的超低附着板中用胶原蛋白IV(60μg/ml)和CTSF(200,000个细胞)的混合物包被所产生的新毛囊2天并且其后每3天更换一次培养基而获得。

实施例4：利用新毛囊生成皮肤替代物

使用前人描述的方法(Toma等，Stem Cells 23，727-37、2005)分离幼年人包皮成纤维细胞，并在DMEM+10％FCS中进行培养。将250,000个真皮成纤维细胞(还使用了DPF或CTSF，但由于处理的原因优选包皮成纤维细胞)与纤维蛋白原溶液(Sigma，3mg/ml)相混合，并加入2.0％(v/v)抑肽酶(20μg/ml)和2.5％(v/v)凝血酶1.25U/ml。将所述冷却溶液加入到transwell培养室中，避免气泡。将温度调节至室温2-3分钟后，将30-40个新毛囊轻轻加入到溶液中，在37℃下在10分钟中聚合成凝胶。将所形成的基质用DMEM+培养基浸泡48小时。

从得自面部提升手术或包皮的皮肤活检样品中分离真皮角质形成细胞(Barrandon和Green，Proc Natl.Acad.Sd.82、5390-4、1985)。简单地说，将下层的脂肪组织和真皮切下，并用胰蛋白酶/EDTA溶液(PAA)于4℃消化过夜。使用细胞刮刀收集KC，在经过70μm细胞滤器(Becton Dickinson)后将上述细胞接种到胶原蛋白I包被的培养瓶中。一周两次更换确定的角质形成细胞无血清培养基(Gibco)，当达到60-80％会合时对KC进行传代或收集。

在基质的顶部加入KC(250,000)并使其贴壁24小时。通过更换确定的角质形成细胞无血清培养基(Gibco)来清除过量的细胞，在达到会合后，将transwell小室提升至气液界面以使KC分化。

还测试了用细胞系(即KC的HaCat和成纤维细胞的HS27)产生相似的皮肤模型，因为它们更容易培养和减少供体改变。将它们培养在含有5％胎牛血清(FCS，Gibco)的DMEM+(Gibco)中。

实施例5：形成含有不来自哺乳动物毛囊之细胞的新毛囊

使用如下文所获得的KC和MC按如实施例3所述产生新毛囊。

人包皮角质形成细胞和成纤维细胞的细胞培养：

使用前人所述的方法(Toma等，Stem Cells 23、727-37、2005；Barrandon和Green，Proc Natl Acad Sci.1985、82：5390-4)从包皮环割手术中分离人包皮成纤维细胞和角质形成细胞。简单地说，去除下层的脂肪组织和真皮，将剩余表皮在中性蛋白酶溶液(4mg/ml，Sigma)中4℃消化过夜。然后，使用细胞刮刀收集角质形成细胞，在经过70μm的细胞滤器(Becton Dickinson)后将上述细胞接种到培养瓶中。所有角质形成细胞均培养在胶原蛋白I包被的细胞培养瓶和确定的角质形成细胞无血清培养基(Gibco)中。一周两次更换培养基，当达到60-80％会合时，对角质形成细胞进行传代或收集。将成纤维细胞培养在DMEM+10％FCS中。

人表皮黑素细胞的细胞培养：

从1管人成体表皮黑素细胞(购自CellMade)开始，根据厂商说明书完成细胞培养步骤。简单地说，向T75培养瓶中加入15ml黑素细胞生长培养基。通过将管下半部分置于37℃水浴中1分钟而使细胞迅速解冻。将细胞重悬于含有黑素细胞生长培养基的T-75培养瓶中。将T-75培养瓶置于37℃、5％CO₂的加湿培养箱中。每2-3天更换一次黑素细胞生长培养基。当达到80％会合时，将细胞传代。

所产生的新毛囊示于图3，其显示了使用来自非哺乳动物毛囊来源的KC和MC产生的新毛囊的不同发育阶段。在阶段1中，新乳头(未添加外源细胞外基质蛋白)被黑素细胞和角质形成细胞所包围，将其加入超低附着培养板中以形成早期多细胞聚集物。已经产生了松散的聚集物。在阶段2中，已可在超低附着培养物中观察到形成囊结构的最初迹象。当已经在聚集物顶部形成突起时，附着的细胞粘附在新乳头上并采取扁平的形状。在大约1周后，所述新毛囊开始形成含有毛囊样鞘的发育过程。在已形成的新毛囊中，开始可以看到清晰可见的原始毛干。

实施例5：使用Agilent人类全基因组寡核苷酸微阵列(单色)对来自细胞样品的不同人源真皮乳头进行基因表达分析

1.SuperAmp^TM RNA扩增

如前文所述产生两个独立的天然真皮乳头、1×10³个单层培养的真皮乳头成纤维细胞、48小时后重浓缩的真皮乳头成纤维细胞和14天后重浓缩的真皮乳头成纤维细胞。将所述四种人细胞样品用SuperAmp^TM裂解缓冲液进行裂解。

样品号	细胞样品	ID
			1	DP	1
2	MONO	2
			3	KOND 1	3
4	KOND 2	4

表2：样品列表

根据Miltenyi Biotec的流程进行SuperAmp RNA扩增。简单地说，扩增是基于使用mRNA衍生之cDNA的全局性PCR流程。通过磁珠技术分离mRNA。使用NA-1000分光光度计定量(NanoDrop Technologies)所扩增的cDNA样品。

表3：cDNA产量的总结

通过Agilent 2100Bioanalyzer平台(Agilent Technologies)检查cDNA的完整性。使用凝胶图像和来源于Agilent 2100Bioanalyzer expert软件的电泳图来分析Bioanalyzer的运行结果。高度扩增的cDNA产物的平均长度在200-1000bp之间。

2.Agilent全基因组寡核苷酸微阵列的杂交

将250ng每种cDNA作为模板，根据Miltenyi Biotec的流程进行Cy3标记。使用Agilent的推荐杂交室和杂交炉，将Cy3标记的cDNA与Agilent全基因组寡核苷酸芯片4×44K(表4)杂交过夜(17小时、65℃)。

实验编号	Cy3	微阵列编号
			1	1	251485031842_1_1
2	2	251485031842_1_2
			3	3	251485031842_1_3
4	4	251485031842_1_4

表4杂交方案

最后，将芯片用含有0.005％N-月桂酰肌氨酸的6×SSPE缓冲液清洗一次(室温洗1分钟)，然后用含有0.005％N-月桂酰肌氨酸的预热 0.06×SSPE缓冲液再清洗1分钟。最后的清洗步骤为用乙腈清洗30秒。

3.扫描结果

使用Agilent的微阵列扫描系统(Agilent Technologies)检测杂交的Agilent微阵列的荧光信号。

4.图像和数据分析

使用Agilent Feature Extraction软件(FES)读取和处理微阵列图像文件。所述软件测定特征强度(包括背景消除)、去除异常值并计算统计可信度。为了测定差异性基因表达，用Rosetta

基因表达数据分析系统(Rosetta Biosoftware)对由来自FES的输出数据文件进一步进行分析。除其他功能外，所述软件还提供了在比值实验中比较两种单强度谱的可能性。所有样品均用Cy3标记，在此，将所述比值实验设计为对照与样品实验(

系统的自动数据输出结果)。请注意，总是通过用样品信号强度除以对照信号强度来计算所述比值。

5.基因列表、单个实验原始数据列表、单个实验归一化数据列表、基因比值列表/预选候选基因列表

Agilent Feature Extraction软件的输出数据包括具有完整原始数据集的基因列表，被称为单个实验原始数据列表。此外，通过用强度值除以其中值，对单个实验原始数据列表中的信号强度进行归一化。将这些归一化的信号强度与单个实验归一化数据列表的通用表格相结合。这一列表除归一化强度值外还包括特征glsPosAndSignif，所述特征用值＝1表示信号强度是正值并且显著高于背景，用值＝0表示信号强度不是正值且不显著高于背景。

软件能够输出具有所有归一化样品/对照log10比值和倍数变化、序列注释、p值等的基因列表，被称为(所有基因的)基因比值列表。例如：基因比值列表中的“-10倍变化”因而表示与样品相比，对照中的基因表达高10倍。将倍数变化＞2且p值＜001的推定候选基因总结在预选候选基因列表中。表5中显示这种包含一些差异性表达基因的列表的摘录。

表5：与天然真皮乳头成纤维细胞相比，通过微阵列分析所测量的成纤维细胞(单层、压缩48小时、压缩14天)中特定基因的水平(比值)。

从表5中可推断，随着培养时间的延长，参与三维排列和组织形成的基因的表达水平接近在天然真皮乳头成纤维细胞中所观察到的表达水平。

表1：DMEM+-Dulbecco改进的Eagle培养基-成分(Gibco)

Claims

1.产生新生乳头的方法，其包括以下步骤：

(a)提供来自至少一个哺乳动物毛囊的至少一个真皮乳头(DP)，

(b)通过将所述DP机械固定在细胞培养容器表面上而从所述DP中分离真皮毛乳头成纤维细胞(DPF)，由此使所述基底膜有孔以允许所述DPF迁移出来，

(d)将扩增的DPF浓缩成显示生理DP大小和形状的细胞聚集物，其中将所述DPF以每容器表面1,000到100,000个DPF/cm²的细胞浓度在非贴壁培养容器中进行分化，其中将所扩增的细胞浓缩至少48小时，和

(e)用包含终浓度为40μg/ml的胶原蛋白IV、终浓度为10μg/ml的纤连蛋白和终浓度为11.5μg/ml的层粘连蛋白的细胞外基质蛋白混合物包被所述新生乳头。

2.根据权利要求1的方法，其中将所扩增的DPF浓缩2至21天。

3.根据权利要求2的方法，其中将所扩增的DPF浓缩3至15天。

4.用于产生哺乳动物小毛囊的方法，其包括以下步骤：

(a)提供至少一个根据权利要求1至3之一的方法产生的新生乳头，

(b)提供至少来源于哺乳动物毛囊的角质形成细胞，以及

(c)在非贴壁培养条件下将所述新生乳头与所述角质形成细胞进行共培养。

5.根据权利要求4的方法，其包括以下步骤：

(b)提供来源于哺乳动物毛囊的角质形成细胞和选自成纤维细胞和/或黑素细胞的至少一种其他细胞群，以及

(c)在非贴壁培养条件下将所述新生乳头与所述角质形成细胞和至少一种其他细胞群进行共培养。

6.根据权利要求5的方法，其中步骤(b)中所述至少一种其他细胞群来源于哺乳动物毛囊。

7.通过根据权利要求4至6之一的方法所产生的小毛囊。

8.通过根据权利要求1至3中任一项的方法所产生的新生乳头。

9.皮肤等同物，其含有根据权利要求7的小毛囊或根据权利要求8的新生乳头。

10.植入物，其含有根据权利要求7的小毛囊和/或根据权利要求8的新生乳头作为活性成分。

11.移植物，其含有有效剂量的根据权利要求9的皮肤等同物作为活性成分。

12.根据权利要求7的小毛囊、根据权利要求8的新生乳头和/或根据权利要求9的皮肤等同物用于产生植入物或移植物的用途，所述植入物或移植物用于预防或治疗性处理毛发量减少的状况。

13.试剂盒，其含有根据权利要求7的小毛囊、根据权利要求8的新生乳头、根据权利要求9的皮肤等同物、根据权利要求10的植入物和/或根据权利要求11的移植物。

14.根据权利要求7的小毛囊、根据权利要求18的新生乳头和/或根据权利要求12的皮肤等同物用于对物质的毛发调节作用进行体外测试的用途。

15.用于对调节毛发特性的物质进行高通量筛选的方法，其包括以下步骤：

-提供根据权利要求8的新生乳头、根据权利要求7的小毛囊和/或根据权利要求9的皮肤等同物的样品，

-将所述各个样品分成份，

-将至少一份与待筛选物质一起孵育，以及

-将该份的毛发特性参数与未与所述物质一起孵育的另一份样品进行比较。