PT2274419E - Processos para produzir microfolículos capilares e papilas de novo e respetiva utilização em testes in vitro e em implantes in vivo - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO

"PROCESSOS PARA PRODUZIR MICROFOLÍCULOS CAPILARES E PAPILAS DE NOVO E RESPETIVA UTILIZAÇÃO EM TESTES IN VITRO E EM IMPLANTES IN VIVO" A presente invenção refere-se a um processo para produzir microfoliculos capilares através da co-cultura de papilas de novo com uma outra população de células do foliculo capilar nos recipientes de cultura de células de aderência ultrabaixa. A presente invenção refere-se igualmente a um processo para produzir papilas de novo que podem ser utilizadas num processo para produzir microfoliculos capilares. A presente invenção tem igualmente por objetivo os microfoliculos capilares e as papilas de novo produzidos através dos referidos processos. Os microfoliculos capilares e/ou as papilas de novo podem ser utilizados como implantes para tratar condições capilares reduzidas e para testar efeitos de modulação capilar ou efeitos tóxicos de substâncias in vitro.

Devido ao papel critico que o cabelo desempenha na comunicação não-verbal humana, um indivíduo afetado invariavelmente procura ajuda quando o crescimento capilar diminui. A terapia fundamental, evidentemente, é restaurar ou regenerar folículos capilares cíclicos novos, saudáveis. Até muito recentemente, a medicina foi incapaz de disponibilizar quaisquer tratamentos válidos para os referidos pacientes. Nos finais do século vinte, foram comercializados vários fármacos que, ainda que de forma modesta e de forma inconsistente, estimulavam o crescimento capilar. Os exemplos incluem minoxidil, finasterido e lanatoprost. 0 timing complexo e as inúmeras alterações da expressão genética necessários para a instrumentação do 2 desenvolvimento e dos ciclos de foliculos capilares parecem excluir uma abordagem farmacêutica simples para o tratamento da alopecia avançada. Consequentemente, os respetivos efeitos não cumprem o derradeiro objetivo de gerar foliculos capilares novos num couro cabeludo calvo. Tirando vantagem de tipos de células que sabem como formar foliculos capilares, as terapias com base em células vão chegar às clinicas antes da abordagem puramente molecular.

Uma abordagem à terapia baseada em células para foliculos capilares implicaria a remoção de um pequeno número de foliculos capilares, o isolamento de células competentes e/ou indutivas destes, e a subsequente expansão das referidas células ex vivo mantendo a respetiva capacidade de gerar foliculos capilares novos. Evidentemente, são necessárias condições de cultura que mantenham a capacidade indutiva das células foliculares dérmicas e a capacidade de células epiteliais de foliculos capilares antes que possa ser desenvolvido qualquer tipo de terapia baseada em células para a alopecia. Considerando que estudos recentes demonstraram que a propriedade indutiva das células dérmicas diminui com o tempo in vitro, a investigação tem-se focado na manutenção das propriedades tricogénicas das células de foliculos capilares em cultura. Muito do progresso recente tem resultado dos avanços na metodologia de cultura para foliculos capilares intactos, e dos respetivos componentes celulares. As células de foliculos capilares humanos desenvolvidas em cultura incluem fibroblastos da papila folicular, queratinócitos de bainha exterior da raiz (ORS) e células epidérmicas germinativas da matriz capilar (Tobin et al., J. Invest. Dermatology 104(1), 86-88, 1995). 3 0 objetivo dos esforços da biotecnologia atual é gerar ou reconstituir sistemas orgânicos totalmente organizados e funcionais a partir de células dissociadas que foram propagadas sob determinadas condições de cultura de tecido. Há muito que se reconheceu que o foliculo capilar apresenta uma capacidade regenerativa profunda, completando ciclos durante a vida do indivíduo e reproduzindo a respetiva parte inferior ciclo após ciclo. Os fibroblastos da papila capilar dérmica e a bainha de tecido conjuntivo assemelham-se a células estaminais em caráter e apresentam propriedades indutivas de crescimento capilar específicas. 0 foliculo capilar regenera-se através de interações entre células estaminais epiteliais competentes e células dérmicas indutivas poderosas durante o respetivo ciclo de crescimento. É possível reconstituir um foliculo capilar completo a partir de células estaminais epiteliais e mesenquimais de folículos capilares.

Os maiores desafios que necessitam de ser endereçados com qualquer tipo de tratamento baseados em células para a alopecia incluem a eficiência da formação do foliculo capilar e a escolha do tipo de célula, que estão resumidos por Stenn & Cotsarelis, Curr. Opinion Biotech. 16, 493-497, 2005. Para aplicar a biotecnologia ao foliculo capilar, pode começar-se pelos elementos dérmicos de folículos dissociados com ou sem células competentes do foliculo ou por outras fontes epiteliais. O número de células dissociadas é expandido em cultura, e subsequentemente as células dérmicas isoladamente, ou em combinação com células epiteliais competentes, são reintroduzidas no couro cabeludo alopécico. Os estudos precedentes demonstraram que começar com células dérmicas indutoras corretamente localizadas resulta numa nova formação de folículos. Além 4 disso, começar com a combinação de células dérmicas e epiteliais dissociadas, ou agregadas, tricogénicas demonstrou igualmente ser um modo eficiente de produzir novos foliculos capilares.

As primeiras tentativas de abordagens baseadas em células para tratar a alopecia tendem a utilizar tecido autólogo para aplicar a biotecnologia a foliculos capilares de modo a evitar a rejeição imunitária das células dadoras. Contudo, existe a possibilidade intrigante de desenvolver tecido de foliculos capilares heterólogo (alogénico) para o transplante de tecido, baseada no conceito de que o foliculo capilar é um local privilegiado a nivel imunológico que não expressa antigénios MHC (complexo major de histocompatibilidade) de classe I. No entanto, os testes de segurança e as barreiras a nivel regulamentar para este tipo de abordagem requerem recursos financeiros enormes.

Uma outra abordagem possivel para a aplicação de biotecnologia a foliculos capilares envolve a formação de foliculos capilares como mini-orgãos in vitro, e subsequentemente o transplante dos novos foliculos gerados para o couro cabeludo alopécico. Da DE 101 62 814 B4 é conhecido um equivalente de pele e de cabelo que pode ser produzido através da providência de uma pseudoderme ou de uma preparação de uma pseudoderme, assim como de pseudopapilas compreendendo células de papilas dérmicas cultivadas num portador adequado ou numa matriz adequada, ou de precursores de pseudopapilas compreendendo células de papilas dérmicas cultivadas num meio formador de matriz adequado, capaz de formar uma matriz in situ, e da introdução das pseudopapilas ou dos precursores de pseudopapilas na pseudoderme ou na preparação de uma 5 pseudoderme. Este tipo de abordagem requer um sistema de cultura de células muito mais complexo que envolve matrizes tridimensionais, eventualmente associado a fatores de crescimento adequados, de modo a permitir a diferenciação das células epidérmicas e dérmicas perante a estrutura tridimensional de um foliculo capilar normal. Mais particularmente, a estrutura da papila apenas é obtida através da formação de cavidades, por exemplo através do puncionamento ou da picotagem, na referida pseudoderme, e subsequente implante das referidas pseudopapilas na mesma, que são formadas de modo que as respetivas dimensões correspondem às cavidades formadas na PD. Esta abordagem carece da disposição voluntária de células na estrutura de papilas fisiológicas aproximada, assim como de contactos de células diretos.

Recentemente demonstrou-se um outro processo para produzir uma população de células estaminais multipotentes ou respetiva progenia, originada a partir de um foliculo capilar ou de uma porção contendo papilas dérmicas do mesmo. 0 processo da WO 2005/071063 AI compreende a cultura do referido foliculo capilar ou da referida porção contendo papilas dérmicas em condições nas quais as células estaminais multipotentes se desenvolvem e proliferam de forma não aderente. As papilas dérmicas não são obtidas através deste procedimento, mas as células estaminais multipotentes isoladas são diretamente utilizadas para induzir o crescimento capilar ou regenerar a pele num mamífero. Contudo, é igualmente demonstrado neste documento que é formada uma determinada quantidade de células aderentes conforme confirmado pela WO 2005/113747 A2, que divulga um processo para produzir agregados multicelulares a partir de pelo menos dois tipos de células estaminais 6 adultas multipotentes ou pluripotentes através da cultura sob condições estéricas. Presentemente, os corpos organoides estão restringidos às células estaminais acima referidas reunidas a partir do tecido glandular exócrino.

Da US 2005/0233450 AI é conhecido desenvolver papilas dérmicas em condições não aderentes, mas não revesti-las com proteinas da matriz extracelular.

Por isso, o problema técnico que está na base da presente invenção é evitar as desvantagens acima referidas do estado da técnica e providenciar um processo para gerar foliculos capilares e papilas reconstruídos que podem ser livremente e facilmente dispostos na dimensão e na forma de uma DP fisiológica. Outro problema endereçado pela presente invenção é encontrar um equivalente capilar ou um substituto dérmico, adequado como modelo in vitro, mais particularmente para testar e/ou avaliar substâncias ativas, mais particularmente no foliculo capilar. A presente invenção resolve o problema através da providência de um processo para produzir um microfoliculo capilar de mamifero compreendendo os seguintes passos: (a) disponibilizar pelo menos uma papila de novo; (b) disponibilizar pelo menos uma outra população de células selecionada do grupo dos fibroblastos, dos queratinócitos e/ou dos melanócitos, e (c) co-cultivar a papila de novo com pelo menos uma outra população de células sob condições de cultura de células não aderentes.

Os termos "papilas de novo" ou "neopapilas" são arbitrariamente utilizados no presente documento e designam 7 agregados de células dos fibroblastos da papila capilar dérmica (DPF) de mamífero, que apresentam pelo menos metade da dimensão e aproximadamente a forma de uma papila dérmica fisiológica (DP) de um foliculo capilar após isolamento. As papilas de novo podem compreender um revestimento compreendendo uma ou várias proteínas da matriz extracelular diferentes, preferencialmente colagénio IV, fibronectina e/ou laminina. 0 referido revestimento pode ser gerado através dos DPFs que formam as papilas de novo em si, ou pode ser adicionado em qualquer fase antes das papilas de novo serem co-cultivadas de acordo com o passo (c) do processo para a produção de microfolículos capilares.

Os termos "microfolículo" e "neofolículo" são utilizados arbitrariamente no presente documento e referem-se a uma estrutura de foliculo capilar de mamífero incompleta que é composta por um suporte celular dérmico, mas carece de outros tipos de células, tais como células musculares, nervos, vasos sanguíneos, etc., resultando numa dimensão reduzida quando comparada com o foliculo natural. Um microfolículo é composto por uma papila de novo estavelmente coberta ou colonizada por células de pelo menos uma outra população de células selecionada do grupo dos fibroblastos, dos queratinócitos e/ou dos melanócitos. Os fibroblastos, os queratinócitos e/ou os melanócitos não têm de ser originários de um foliculo capilar de mamífero, mas podem ser derivados de outros tecidos de mamífero. Preferencialmente um microfolículo é composto por uma papila de novo estavelmente coberta ou colonizada por células de pelo menos uma outra população de células, que pode ser derivada e/ou é derivada de um foliculo capilar de mamífero, por exemplo selecionado do grupo dos fibroblastos da bainha de tecido conjuntivo, dos queratinócitos e/ou dos melanócitos. A forma tridimensional do referido microfoliculo replica a aparência tridimensional de um foliculo capilar de mamífero fisiológico. Os microfolículos podem particularmente ser papilas de novo formadas tridimensionalmente, opcionalmente espacialmente demarcadas, reconstruídas com estruturas semelhantes a um foliculo na superfície das papilas de novo, incluindo aquelas reminiscentes da última etapa da morfogénese capilar, e compreendendo as células da papila dérmica. A presente invenção refere-se a um processo para produzir microfolículos capilares, compreendendo vários passos.

Os referidos passos compreendem a disponibilização de papilas de novo. De acordo com a presente invenção, as papilas de novo a serem preparadas podem ser produzidas por qualquer processo adequado, preferencialmente são utilizadas as papilas de novo produzidas de acordo com um dos processos para a produção de papilas de novo de acordo com a invenção abaixo divulgada.

Os referidos passos compreendem igualmente a disponibilização de outras populações de células. A outra população de células pode ser derivada de um foliculo capilar de mamífero, preferencialmente do mesmo foliculo capilar utilizado para a preparação da DP, e o co-cultivo de papilas de novo com pelo menos uma outra população de células em recipientes de cultura de células não aderentes. Pelo menos 4 populações de células diferentes, isto é, DPFs, fibroblastos da bainha de tecido conjuntivo (CTSF), queratinócitos (KC), e melanócitos (MC), podem ser isoladas a partir de um foliculo capilar de mamífero de um modo 9 definido, separadamente cultivados sob condições estandardizadas, e subsequentemente multiplicadas. É igualmente possivel formar culturas de células de viabilidade a longo prazo a partir destes isolamentos e utilizá-las por exemplo para processos de rastreio.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção as outras populações de células são selecionadas do grupo dos fibroblastos, dos queratinócitos e dos melanócitos. Os fibroblastos, os queratinócitos e/ou os melanócitos não têm de ser originários de um foliculo capilar de mamífero, mas podem ser derivados de outros tecidos de mamífero. Os fibroblastos preferencialmente são originários da bainha de tecido conjuntivo.

Preferencialmente pelo menos uma outra população de células pode ser derivada e/ou é derivada de um foliculo capilar de mamífero, selecionado do grupo dos fibroblastos da bainha de tecido conjuntivo, dos queratinócitos e/ou dos melanócitos.

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção as papilas de novo são co-cultivadas pelo menos com queratinócitos. Os queratinócitos são suplementados para a neogénese microfolicular básica. De acordo com ainda outra forma de realização preferida da presente invenção os queratinócitos e os melanócitos são simultaneamente disponibilizados à cultura de papilas. A adição de melanócitos é particularmente útil para investigações da pigmentação capilar, ou com o propósito de um futuro implante com uma determinada cor de cabelo. Os outros componentes de células, separadamente expandidos podem ser adicionados a um recipiente de cultura de células 10

não aderente abaixo descrito para o processo para produzir papilas de novo, tais como os recipientes de cultura de células de aderência ultrabaixa, nos quais as neopapilas já foram produzidas. Os queratinócitos, ou as misturas de queratinócitos e melanócitos são adicionados às neopapilas revestidas numa proporção de mistura especifica e incubados com um meio adequado nos recipientes de cultura de células não aderentes durante vários dias. Preferencialmente as proporções de KC para MC são de 2:1, 5:1, 10:1 ou 20:1. O co-cultivo dura pelo menos 12 horas, preferencialmente de 1 dia a 5 semanas, mais preferencialmente de 2 dias a 3 semanas, ainda mais preferencialmente de 1 semana ou essencialmente 2 dias. Para elaborar um neofoliculo multicamada, que ainda replica melhor a estrutura e a função do foliculo capilar, este pode ser obtido através do revestimento do neofoliculo gerado com CTSF durante um determinado período de tempo selecionado de 12 horas a 10 dias, preferencialmente de 1 dia a 5 dias, mais preferencialmente essencialmente 2 dias. Sob as referidas condições, a mistura de células desenvolve-se para formar uma estrutura folicular, formando caracteristicas típicas de um foliculo capilar, tais como o desenvolvimento de um fio de cabelo. A estrutura que se assemelha a um órgão é designada por microfoliculo aproximadamente a partir da formação do fio de cabelo.

De acordo com uma forma de realização preferida do processo para produzir microfoliculos capilares de acordo com a presente invenção esta compreende os seguintes passos: (a) a disponibilização de papilas de novo; (b) o contacto das papilas de novo com KC, MC ou uma mistura de KC e de MC numa proporção predeterminada e o co- 11 cultivo num recipiente de cultura de células não aderente durante um periodo de tempo predeterminado; (b') opcionalmente, a repetição do passo (b), preferencialmente em que as células de um tipo de célula diferente são utilizadas para o contacto e para o co-cultivo utilizados na primeira ronda; (c) opcionalmente as papilas de novo cobertas do passo (b) ou (b' ) podem ser revestidas com uma proteina da matriz extracelular, preferencialmente colagénio IV, antes e/ou simultaneamente com o passo (d); (d) as papilas de novo cobertas do passo (b), (b') ou (c) são co-cultivadas com CTSF durante um período de tempo predeterminado num recipiente de cultura de células não aderente. A presente invenção disponibiliza igualmente um processo para a produção de papilas de novo compreendendo os seguintes passos: (a) disponibilizar pelo menos uma papila dérmica (DP) de pelo menos um folículo capilar de mamífero; (b) isolar os fibroblastos da papila capilar dérmica (DPFs) da DP através da fixação mecânica da referida DP na superfície de um recipiente de cultura de células, sendo que a lâmina de base é perfurada para permitir a saída dos referidos DPFs por migração; (c) expandir os DPFs isolados numa cultura monocamada sem revestimento de colagénio, em que os referidos DPFs são submetidos a uma passagem pelo menos uma vez; (d) condensar os DPFs expandidos em agregados de células que apresentam a dimensão e a forma da DP fisiológica, em que os referidos DPFs são diferenciados em recipientes de cultura de células não aderentes numa concentração de células por superfície de recipiente de 1.000 para 100.000 12 DPFs/cm2, sendo que opcionalmente os DPFs expandidos são condensados durante pelo menos 48h, e (e) revestir as papilas de novo com proteinas da matriz extracelular, preferencialmente colagénio IV, fibronectina e/ou laminina. A presente invenção disponibiliza igualmente um processo para produzir papilas de novo compreendendo os seguintes passos: (a) disponibilizar pelo menos uma papila dérmica (DP) de pelo menos um foliculo capilar de mamífero; (b) isolar os fibroblastos da papila capilar dérmica (DPFs) da DP através da fixação mecânica da referida DP na superfície de um recipiente de cultura de células, sendo que a lâmina de base é perfurada para permitir a saída dos referidos DPFs por migração; (c) expandir os DPFs isolados numa cultura monocamada sem revestimento de colagénio, em que os referidos DPFs são submetidos a uma passagem pelo menos uma vez; (d) condensar os DPFs expandidos em agregados de células que apresentam a dimensão e a forma da DP fisiológica, em que os referidos DPFs são diferenciados em recipientes de cultura de células não aderentes numa concentração de células por superfície de recipiente de 1.000 para 100.000 DPFs/cm2, e em que os DPFs expandidos são condensados durante pelo menos 48 h, (e) revestir as papilas de novo com proteínas da matriz extracelular, preferencialmente colagénio IV, fibronectina e/ou laminina. São particularmente a expansão dos DPFs isolados e a forma de administração fisiológica que representam fatores limitativos à utilização das referidas células na indução 13 do crescimento capilar de acordo com o estado da técnica. São necessários vários ciclos de multiplicação para alcançar a quantidade de células necessária, sendo que durante o processo as células cultivadas em culturas monocamada, especialmente aquelas dos fibroblastos da papila dérmica, perdem as respetivas capacidades indutivas, nomeadamente, após 5-8 ciclos de multiplicação conforme demonstrado em experiências. As células tratadas diferenciam-se e expressam marcadores de células estaminais, mas já não podem ser utilizadas para gerar foliculos capilares.

Surpreendentemente foi demonstrado pelos inventores que as células atingem o nivel de diferenciação e de estabilização ou recuperam a respetiva capacidade indutora de crescimento capilar após vários dias a várias semanas sob as condições de cultura especificas da invenção, em que os DPFs expandidos que seguem a cultura de células são transferidos numa concentração bem definida para recipientes de culturas de células não aderentes especiais. Além da recuperação das propriedades indutivas, surpreendentemente verificou-se que como resultado de contactos célula-célula ativos e a permuta de moléculas sinalizadoras, subsequentemente as células formam agregados de células e diferenciam. Sob as referidas condições especificas, as células tratadas condensam-se aproximadamente na forma e na dimensão correspondentes à forma fisiológica de uma papila dérmica num foliculo capilar seguindo-se o isolamento. Para este efeito, a proporção de células utilizadas/superficie de recipiente de cultura de células é de importância crucial.

Antes do passo (a) , um foliculo capilar é retirado de um mamifero que tanto pode ser um paciente como um dador. Mais 14 especificamente a amostra é colhida de um ser humano, de um roedor, de um porco, de um canídeo, de um macaco, de uma ovelha, de um gato ou de um cão, preferencialmente de um ser humano. Preferencialmente a amostra de tecido deve ser colhida por biopsia cutânea, mais especificamente colhida próximo da localização do padecimento. Na presente invenção, preferencialmente a amostra do folículo capilar é colhida do cabelo, da barba, das sobrancelhas, dos pelos púbicos ou de outros pelos corporais. A colheita do folículo capilar deve seguir a boa prática médica. A amostra pode ser purificada para remover substâncias perturbadoras. A providência de DPs dos folículos capilares e o isolamento dos DPFs de acordo com o passo (a) são realizados de uma forma desenvolvida de novo a partir de protocolos estandardizados anteriores. Utilizando as peças pequenas de biopsias cutâneas, a epiderme é separada da derme e do tecido adiposo subjacentes, por exemplo através da utilização de um bisturi. 0 tecido adiposo é ligeiramente comprimido, por exemplo através da utilização de pinças, de modo que os bolbos capilares localizados neste são facilmente preparados sob um microscópio de dissecação. Os referidos folículos capilares isolados são fixados no fio de cabelo, por exemplo novamente através de pinças e a bainha de tecido conjuntivo é cuidadosamente separada de forma diamétrica, por exemplo por meio de outro par de pinças, de modo que o bolbo é evertido para expor os DPFs e o fio de cabelo com a matriz capilar. Deste modo, a parte proximal do bolbo, conjuntamente com os fibroblastos da bainha de tecido conjuntivo e as papilas dérmicas são facilmente separados da parte restante do folículo capilar, por exemplo através da utilização de uma agulha ou de uma 15 cânula. Além disso o fio de cabelo, que compreende os queratinócitos e os melanócitos da matriz capilar necessários, optimamente é preparado para cultura adicional.

Subsequentemente no passo (b), as papilas dérmicas isoladas são transferidas para um recipiente de cultura de células, e mecanicamente fixadas na superfície do recipiente. Preferencialmente, os DPFs são obtidos através de bloqueio mecânico das papilas dérmicas isoladas no fundo do recipiente de cultura de células utilizando uma ferramenta de precisão ou um bisturi em vez de serem sujeitas à separação enzimática. Preferencialmente devem ser incubadas 1 a 8 DPs por recipiente de cultura de células. Particularmente, 2 a 4 DPs são transferidas para cada placa de cultura de células de 6 poços ou de 12 poços, por exemplo, e fixadas no fundo da placa. Como resultado, a lâmina de base é ligeiramente perfurada, mas a morfologia da papila é mantida, e os DPFs podem sair por migração das papilas dérmicas, e proliferar. A cultura dos DPFs no passo (c) é realizada sem revestimento de colagénio em meio Standard, preferencialmente incluindo uma quantidade reduzida de soro bovino fetal (FCS) , por exemplo 10% em vez dos convencionais 20% de FCS e adicionalmente suplementado com antibióticos, tais como lx penicilina/estreptomicina. Após o isolamento, a primeira mudança do meio preferencialmente é realizada após 1 semana no caso mais cedo, mas após 2 semanas o mais tardar. Assim que as células tiverem crescido para fora da DP, o meio pode ser mudado entre uma a duas vezes por semana, em função da densidade das células. Quando as células alcançam 70%-80% de confluência, 16 são separadas do fundo da placa, por exemplo através da utilização de tripsina/EDTA à temperatura ambiente, e passadas para outros recipientes de cultura de células, tais como frascos de cultura de células do tipo T25. No decurso do cultivo, as células podem ser adicionalmente expandidas para a utilização direta em experiências, ou congeladas em nitrogénio liguido para utilização futura. Embora o número de passagens não seja limitado, de modo que as células podem ser expandidas até alcançar qualquer densidade elevada desde que seja dada viabilidade, preferencialmente os referidos DPFs são passados pelo menos duas vezes, mais preferencialmente pelo menos cinco vezes, ainda mais preferencialmente menos de nove vezes. Para alcançar um débito elevado preferencialmente o procedimento é realizado com oito passagens. Consequentemente, de acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção, o processo é realizado através da condensação de DPFs não indutivos. É uma constatação inesperada verificar que os referidos DPFs com falta de propriedades indutivas ainda podem ser utilizados para a tecnologia de tecidos.

Segue-se a fase de condensação do passo (d) , em que os DPFs separados, multiplicados são cultivados em recipientes de cultura de células não aderentes com meio incluindo componentes bem definidos, isto é, um meio de cultura Standard. No referido sistema, uma superfície de recipiente especial, ou um revestimento especial da superfície de recipiente, especialmente da superfície do fundo, reduz a fixação de células ou previne que as células se fixem na superfície. Preferencialmente, os recipientes de cultura de células não aderentes são feitos de vidro, poliestirol, e/ou de uma superfície tratada com uma camada antiaderente. Mais preferencialmente, é aplicada uma superfície revestida 17 com PTFE ou com poli-HEMA nos recipientes. A utilização de recipientes de cultura de células de fixação ultrabaixa é particularmente preferida no âmbito da presente invenção. Estes são distribuídos por exemplo pela Corning, Inc., EUA. Os referidos recipientes e revestimentos não aderentes são conhecidos do perito na técnica e podem facilmente ser comprados ou produzidos.

Como resultado de um contacto livre, as células agregam-se numa dimensão definida, formando agregados após vários dias que se assemelham à papila original em dimensão e em forma. Os DPFs expandidos preferencialmente são condensados durante pelo menos 48 horas, 2 a 5 dias, mais preferencialmente durante 2 a 3 dias, ainda mais preferencialmente essencialmente durante 2 dias, e opcionalmente adicionalmente cultivados durante 3 a 15 dias, preferencialmente durante 5 a 10 dias ou durante 2 a 21 dias. A dimensão e a forma dos condensados formados depende da zona em que as biopsias cutâneas foram removidas. Os DPFs, que são removidos da barba, dos pelos corporais, das sobrancelhas, dos pelos púbicos ou do cabelo, e sujeitos a expansão formam agregados de células de diferentes dimensões, que por sua vez determinam a forma, a dimensão e o comprimento do cabelo correspondente. É ainda mais crucial o número de células iniciais conforme inoculado no recipiente, que tem de apresentar uma proporção adequada à superfície do recipiente. De acordo com uma outra forma de realização do processo, a concentração de células por superfície de recipiente ascende a 2.000 DPFs/cm2 a 50.000 DPFs/cm2 no passo (d), preferencialmente de 3.000 DPFs/cm2 a 20.000 DPFs/cm2, mais preferencialmente de 5.000 DPFs/cm2 a 10.000 DPFs/cm2, 18 ainda mais preferencialmente essencialmente a 6.666 DPFs/cm2.

Nesta fase, já se formou uma matriz autoproduzida em torno do condensado. Para acelerar este processo e exercer influência sobre este de forma direcionada, são adicionados componentes da matriz fisiológica ao meio nesta fase para formar uma cápsula que replica as propriedades de uma papila dérmica. No passo do processo subsequente (e), as papilas de novo obtidas são revestidas com uma composição de proteínas da matriz extracelular. Esta composição é realizada de modo a replicar as fisiológicas. Preferencialmente consiste de colagénio IV, fibronectina e/ou laminina. Particularmente preferencialmente as proteínas da matriz extracelular são uma mistura de colagénio IV, fibronectina e laminina numa proporção de 2-6 : 0.5-2 : 0.5-2 partes em peso, mais preferencialmente apresentando uma proporção de essencialmente 4 : 1 : 1.15 partes em peso. Não se exclui, contudo, que as proteínas da matriz extracelular acima referidas possam igualmente ser utilizadas individualmente ou com percentagens em volume variáveis ou combinadas com outras matrizes. De acordo com uma outra forma de realização da presente invenção, as proteínas da matriz extracelular compreendem igualmente outros colagénios (por exemplo 1, 10 Al, 18 Al) , gi icosaminoglicanos e/ou proteoglicanos, preferencialmente sulfato de heparano, decorina, sulfato de queratano, biglicano, agrecano, versicano, perlecano, CD44v3 e/ou sindecano. Mais uma vez, o referido revestimento das neopapilas é realizado num recipiente de cultura de células minimamente aderente, por exemplo em recipientes de cultura de células de fixação ultrabaixa. O revestimento é 19 realizado durante 1 a 5 dias, preferencialmente durante 1 a 2 dias. São divulgadas as papilas de novo e os microf oliculos capilares obteníveis através dos processos de acordo com a presente invenção. Os conhecimentos anteriores à presente especificação no que se refere a processos para produzir neopapilas e microfolículos, respetivamente, são considerados válidos e aplicáveis sem restrições aos produtos dos processos de produção se necessário.

Ambos, as papilas de novo e/ou os microfolículos capilares produzidos de acordo com o processo da presente invenção podem ser utilizados para produzir equivalentes de pele. Preferencialmente, os equivalentes de pele são concebidos, por exemplo através da utilização de Matriderm (Dr. Suwelack Skin & Health Care AG) , de acordo com processos estandardizados e os locais de inserção para os microfolículos são cortados em intervalos regulares através de um laser de 2-fotões ou pré-perfurados com um punção. Consequentemente, os equivalentes de pele compreendendo as papilas de novo e/ou os microfolículos capilares são outro objeto da presente invenção. Além das papilas dérmicas reconstruídas, compreendem uma ou várias camadas de queratinócitos, que em si podem formar uma estrutura epidérmica, ou uma estrutura peridérmica, e opcionalmente uma ou várias camadas de melanócitos, que podem ser aplicadas sobre a estrutura das papilas dérmicas.

As papilas de novo e/ou os microfolículos capilares produzidos de acordo com um processo de acordo com a presente invenção podem igualmente ser utilizados como implantes. Por conseguinte, um outro objeto da presente 20 invenção é um implante compreendendo como ingrediente ativo uma quantidade eficaz de papilas de novo de acordo com a presente invenção e/ou de microfoliculos capilares, opcionalmente conjuntamente com adjuvantes farmaceuticamente toleráveis.

De forma semelhante, o equivalente de pele pode ser utilizado como transplante.

No âmbito da presente invenção, os processos para produzir papilas de novo e microfoliculos capilares, que aplicam a condensação de DPFs expandidos em agregados de células fisiológicos através do cultivo tridimensional e uma determinada proporção de concentração de células por superfície de recipiente, são disponibilizados pela primeira vez. Conforme verificado através da formação de microfoliculos produtores de fios de cabelo, e por meio de análises de expressão genética e proteica, os DPFs reassumem as respetivas propriedades indutivas originais após uma condensação especifica. Desde que as propriedades indutivas das células possam ser restabelecidas no decurso do presente processo, o número de passagens para expandir as células não é relevante. Assim, é vantajosamente possível utilizar números constantes e elevados de células iniciais e realizar um fornecimento controlado de meios de um modo reprodutível mediante utilização do cultivo tridimensional em recipientes de cultura de células não aderentes. Comparativamente com outros processos de cultivo 3D para experiências de diferenciação generalistas, tais como culturas de micromassa, de peletes ou o processo de gotas suspensas, as células no sistema de cultura da presente invenção não são forçadas ao contacto célula-célula, mas é-lhes permitido associarem-se individualmente 21 para formar agregados de células e, no caso dos DPFs, condensados semelhantes a papilas. A disponibilização de papilas de novo, de microfoliculos capilares e de equivalentes de pele conforme definidos pelo processo de produção resultam em implantes ou transplantes, respetivamente, para o tratamento profilático ou para o tratamento terapêutico em condições de uma quantidade reduzida de cabelo. Os presentes produtos apresentam várias vantagens. Ambos, o equivalente de foliculo capilar e o substituto de pele são mais estandardizáveis do que o foliculo capilar isolado. Reduzem a procura de foliculos capilares e aproximam-se mais da situação in vivo do que os modelos da técnica anterior. Os modelos tridimensionais complexos simulam o foliculo capilar in vivo na respetiva estrutura e composição histológica, resultando num nivel elevado de relevância da informação providenciada relativamente à eficácia e à compatibilidade de substâncias ativas. Todos os produtos de um processo da presente invenção são igualmente caracterizados por uma estabilidade elevada, baixos custos de produção, manuseamento conveniente, e estão disponíveis a qualquer momento. Estas características constituem a base para uma ação reprodutível em protocolos estandardizados e para uma interação fiável e segura com as respetivas moléculas efetoras correspondentes. 0 respetivo uso é uma nova abordagem promissora para um largo espetro de terapias que causam uma redução direta e imediata dos sintomas.

Os produtos de acordo com um processo da presente invenção são adequados para várias aplicações no campo médico, farmacêutico e cosmético, tais como para o desenvolvimento de produtos cosméticos ou para a descoberta de substâncias 22 ativas com um efeito biológico no foliculo capilar através da influência da pigmentação capilar, do crescimento capilar, da estrutura capilar e similares, que podem ser realizados em sistemas de teste in vitro ou em processos de rastreio, providenciando informação sobre o efeito de substâncias em células foliculares capilares com relevância in vivo. A disponibilização dos produtos formados deste modo representa um beneficio particular para os testes de rastreio de larga escala. Todos eles podem ser utilizados em procedimentos de rastreio adequados para débitos elevados de modo a identificar substâncias ativas ou composições de substâncias ativas para a promoção do crescimento capilar ou a inibição do crescimento capilar, e em testes toxicológicos de substâncias e de químicos. Os processos de produção da presente invenção podem ser realizados de forma simples e rápida. Além disso, o kit adequado é produzido a custos reduzidos.

Conforme utilizados no presente documento, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares de palavras tais como "um", "um" e "o" incluem os respetivos referentes plurais correspondentes a menos que o contexto evidencie claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um recipiente" inclui um recipiente individual ou vários recipientes, que tanto podem apresentar dimensões, formas ou composições idênticas como diferentes e a referência a "um processo" inclui a referência a passos e processos equivalentes conhecidos pelo perito na técnica e assim sucessivamente. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento apresentam o mesmo significado compreendido por um perito na técnica a quem a presente invenção pertence. 23

Embora os processos e os materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, são descritos exemplos adequados abaixo. Os seguintes exemplos são disponibilizados com uma finalidade ilustrativa e não com uma finalidade limitativa. Nos exemplos, são utilizados reagentes e tampões estandardizados livres de atividades contaminantes (sempre que práticos). FIGURAS:

Fig. 1 apresenta: A) Uma punção-biópsia de uma pele dadora retirada de uma cirurgia de lifting. A linha a tracejado indica a linha de corte do limite dermosubcutâneo para um isolamento adicional do foliculo capilar. B) 0 foliculo capilar "amputado" e dissecado (caixa destacada) é dissociado através de uma nova técnica: A bainha de tecido conjuntivo é diametricamente puxada sobre o fio de cabelo resultando numa separação pura do fio de cabelo com queratinócitos e melanócitos da bainha da raiz exteriores e interiores por um lado e a papila dérmica e a bainha de tecido conjuntivo por outro lado. C) A bainha de tecido conjuntivo dissecada com os respetivos fibroblastos e a papila dérmica adjacente, que pode ser exatamente cortada (caixa destacada). D) Uma papila dérmica dissecada retirada por microscopia eletrónica. 24 E) A excrescência do fibroblasto da papila dérmica a partir da papila dérmica ligeiramente arranhada e ancorada, deixando a respetiva estrutura de cápsula quase intacta. F) Um fibroblasto da papila dérmica cultivado da 3a passagem em frascos de cultura de 75 cm2 não revestidos. G) Um fibroblasto da papila dérmica que forma condensados semelhantes a papilas dérmicas em frascos de 75 cm2 de fixação ultrabaixa. Η) A ampliação de uma condensação de um fibroblasto da papila dérmica pronto para ser processado de modo a formar uma neopapila com componentes da matriz extracelular em placas de fixação baixa de 6 poços.

Fig. 2 apresenta: A) Uma neopapila (seta branca) de matriz extracelular e queratinócitos rodeados, que foram adicionados à placa de fixação ultrabaixa para formar um condensado multicelular. B) Os primeiros sinais de formação de estruturas foliculares após 24 h numa cultura de fixação ultrabaixa. C) A formação de neofoliculos após 1 semana. É claramente visivel a formação de um fio de cabelo primitivo. D) A formação de neofoliculos registada por microscopia de luz DIC ilustrando a estrutura da papila dérmica intacta após 1 semana de cultura. 25 E) Os neofolículos inseridos num equivalente de pele apresentando estruturas semelhantes às de um foliculo capilar definidas. A caixa destacada apresenta um foliculo capilar que cresce para baixo. Com o microscópio invertido é visível a porção proximal do folículo/equivalente de pele. F) A cultura adicional de Neofolículos no equivalente de pele demonstrando uma ancoragem evidente do foliculo capilar e um crescimento contínuo.

Fig. 3 apresenta:

Um Neofolículo produzido utilizando KC e MC derivados de fontes diferentes que o foliculo capilar de mamífero durante diferentes fases de desenvolvimento e de formação: A) Fase 1: Neopapila (sem a adição de proteínas da matriz extracelular exógenas) rodeada por melanócitos e por queranócitos, que foram adicionados à placa de fixação ultabaixa para formar um condensado multicelular inicial. B) Fase 2: Primeiros sinais de formação de estruturas foliculares após 24 h numa cultura de fixação ultrabaixa (note-se a protuberância no topo). As células fixas aderem à Neopapila e adotam uma forma achatada. C) Fase 3: Início da formação de Neofolículos após 1 semana com o desenvolvimento de uma bainha semelhante a um foliculo capilar. D) Fase 4: No interior do Neofolículo torna-se visível uma formação claramente visível de um fio de cabelo primitivo. 26

Fig. 4 apresenta: A formação de neopapilas funcionais em dois momentos diferentes: A) Após 48 horas de condensação, e B) Após 7 dias de condensação; no dia 7, a agregação de células é muito mais densa e torna-se visivel a formação da matriz extracelular autoderivada. EXEMPLOS: EXEMPLO 1: 0 isolamento e a cultura de fibroblastos da papila dérmica folicular humana (DPF) , de fibroblastos da bainha de tecido conjuntivo (CTSF), de queratinócitos (KC) e de melanócitos (MC).

Os foliculos capilares individuais foram obtidos após a microdissecação de amostras de couro cabeludo humano a partir do excesso de cirurgias de lifting, recebidas de acordo com a regulamentação exigida. Para isolar os KC e os MC da matriz, os CTSF e os fibroblastos da papila dérmica (DPF), a pele foi cortada na interface dermosubcutânea com um bisturi e os foliculos capilares numa fase anagénica (fase de crescimento) foram puxados com forcéps sob um microscópio de dissecação.

Ao contrário de técnicas de isolamento anteriormente descritas (por exemplo Magerl et al., Methods Exp. Dermat. 11, 381-385, 2002), as frações puras das populações de células desejadas, foram obtidas através do corte longitudinal do tecido conjuntivo da parte superior do folículo capilar dissecado. Através da fixação do fio de cabelo num local, o CTS pode ser diametricamente puxado sobre a matriz capilar com forcéps na direção da porção 27 proximal mais baixa. Com esta técnica as células DP foram automaticamente desprovidas de revestimento evitando a danificação ou a mistura de tipos de células. Assim, o CTS e a papila dérmica assim como a matriz capilar contendo células KC e MC foram claramente separadas e podem ser facilmente removidas por um bisturi.

Os isolados de DP e de CTS foram separadamente cultivados em placas de cultura de células de 6 poços (2-4 num poço) através da respetiva fixação à placa de cultura com uma agulha. Para possibilitar uma excrescência rápida e manter a morfologia de cápsula e o biótopo do fibroblasto em simultâneo, a membrana fina foi ligeiramente arranhada para libertar os componentes da matriz extracelular (ECM). As células foram submergidas com DMEM+ (Gibco/Invitrogen) com 10% de soro bovino fetal (FCS) até ter sido observado o crescimento de fibroblasto após 1-2 semanas baseado nas variações do dador. Subsequentemente as células foram colocadas num frasco de cultura de 25 cm2 durante mais uma semana e adicionalmente passadas para um frasco de cultura de 75 cm2. Após alcançar a passagem de subconfluência 3 foram divididas por três frascos de 75 cm2 obtendo-se 1.5-2 milhões de DPF ou de CTSF, respetivamente. O KC e o MC do foliculo capilar amelanótico foram removidos do fio de cabelo restante e a matriz capilar fixada por tripsinização (0.05% de tripsina e 0.53 mM de EDTA) e foram separados por tripsinização diferencial e cultivados com os processos Standard conforme descritos em Tobin et al., J. Invest. Dermatology 104(1), 86-88, 1995. 28 EXEMPLO 2: Formação de Neopapilas A quantidade otimizada de 500.000 DPF foi disposta num frasco de cultura de fixação ultrabaixa de 75 cm2 (Corning) contendo DMEM+ e foi autorizada a formar agregados de células. Após 48 horas sem se mexerem estes agregados formam a dimensão de uma papila dérmica de foliculo capilar humano. Subsequentemente os condensados foram transferidos para uma placa de fixação ultrabaixa de 6 poços e adicionada uma mistura de Laminina (concentração final de 11.5 pg/ml), Fibronectina (concentração final de 10 pg/ml) e Colagénio IV (concentração final de 40 yg/ml) aos poços. Após 24-48 horas em cultura, a secreção ECM intrínseca e as proteínas adicionadas formaram um invólucro de matriz estável e neopapilas. Para facilitar uma acumulação e diferenciação de ECM mais rápida, os fatores de crescimento, isto é, o Factor de Crescimento do Hepatócito (30 ng/ml) e/ou o Factor de Crescimento do Tecido Conjuntivo (20 ng/ml) podem ser alternativamente adicionados ao meio. Estas Neopapilas estão prontas para serem implantadas na pele in vivo para desenvolver propriedades indutivas capilares. EXEMPLO 3: Formação de Neofolículos

Foram adicionados 250.000 KC e MC (10:1) às Neopapilas num frasco de cultura de fixação ultrabaixa (6 poços, Corning) e o meio DMEM4- foi alterado para um meio de queratinócitos livres de soro definido (Gibco) . Após 1 semana as Neopapilas cobertas formam estruturas semelhantes a folículos capilares. Estes Neofolículos já podem ser utilizados para testes. Para elaborar um Neofolículo multicamada, que ainda replica melhor a estrutura e a 29 função de um foliculo capilar pode ser obtido através do revestimento do Neofoliculo gerado com uma mistura de colagénio IV (60 yg/ml) com CTSF (200.000 células) em placas de fixação ultrabaixa com DMEM+ 10% FCS durante mais 2 dias e a mudança do meio a cada 3o dia. EXEMPLO 4: Geração de equivalentes de pele com Neofoliculos

Os Fibroblastos de Prepúcio Humano Juvenil foram isolados utilizando os processos anteriormente descritos (Toma et al., Stem Cells 23, 727-37, 2005) e cultivados em DMEM+ 10% FCS. 250.000 fibroblastos dérmicos (foram igualmente utilizados DPF ou CTSF, mas preferencialmente os fibroblastos de prepúcio por razões de manuseamento) foram misturados com uma solução de Fibrinogénio (Sigma, 3 mg/ml) e adicionados 2.0% (v/v) de Aprotinina (20 yg/ml) e 2.5% (v/v) de Trombina a 1.25 U/ml. Esta solução refrigerada foi vertida para câmaras de cultura de transpoço evitando bolhas de ar. Após o ajuste da temperatura durante 2-3 min à temperatura ambiente, 30-40 Neofoliculos foram cuidadosamente introduzidos na solução e foi realizada a polimerização de modo a formar um gel durante 10 min a 37°C. A matriz composta foi embebida em meio DMEM+ durante 48 h.

Os Queratinócitos Dérmicos foram isolados a partir de biopsias cutâneas obtidas de cirurgias de lifting facial ou do prepúcio (Barrandon & Green, Proc Natl. Acad. Sei. 82, 5390-4, 1985) . Brevemente, o tecido adiposo e a derme subjacentes foram cortados e a epiderme restante sintetizada durante a noite numa solução de Tripsina/EDTA (PAA) a 4°C. Os KC foram colhidos utilizando um raspador de células e após a passagem por um filtro de células de 70 ym 30 (Becton Dickinson) foram dispostos em frascos de cultura revestidos com colagénio I. O meio de queratinócitos livres de soro definido (Gibco) foi mudado duas vezes por semana e os KC foram passados ou colhidos com uma confluência de 60%-80%.

Os KC (250.000) foram adicionados no topo da matriz e ficaram a aderir durante 24 horas. As células excedentárias foram tiradas através da mudança do meio de queratinócitos livres de soro definido (Gibco) e após terem alcançado a confluência, as câmaras de transpoço foram elevadas para a interfase ar-liquido para possibilitar a diferenciação dos KC.

Foram igualmente testadas linhas de células (isto é, HaCat para os KC e HS27 para os f ibroblastos) para gerar um modelo de pele similar uma vez que são mais fáceis de cultivar e reduzem as variações dadoras. Foram desenvolvidas em DMEM+ (Gibco) suplementado com 5% de soro bovino fetal (FCS, Gibco). EXEMPLO 5: Formação de Neofoliculos compreendendo células não derivadas de foliculos capilares de mamífero.

Os Neofoliculos foram preparados conforme descrito no Exemplo 3 utilizando os KC e os MC obtidos conforme descrito abaixo.

Queratinócitos e Fibroblastos de Prepúcio Humano de Cultura de Células:

Os Fibroblastos e os Queratinócitos de Prepúcio Humano foram isolados a partir de circuncisões utilizando os processos anteriormente descritos (Toma et al., Stem Cells 31 23, 727-37, 2005, Barradon & Green, Proc Natl Acad Sei. 1985, 82:5390-4). Brevemente, o tecido adiposo e a derme subjacentes foram cortados e a epiderme restante sintetizada durante a noite numa solução de Dispase (4 mg/ml, Sigma) a 4°C. Os Queratinócitos foram colhidos utilizando um raspador de células e após a passagem por um filtro de células de 70 ym (Becton Dickinson) foram dispostos em frascos de cultura. Todos os Queratinócitos foram desenvolvidos em frascos de cultura de células revestidos com Colagénio I e meio de Queratinócitos Livres de Soro Definido (Gibco). O meio foi mudado duas vezes por semana e os Queratinócitos foram passados ou colhidos com uma confluência de 60%-80%. Os Fibroblastos foram cultivados em DMEM+ 10% FCS.

Melanócitos Epidérmicos Humanos de Cultura de Células: Partindo de um recipiente criogénico de Melanócitos Ep idérmicos Adultos Humanos (adquiridos na CellMade) os procedimentos de cultura de células foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. Brevemente, foram adicionados 15 ml de Meio de Crescimento dos Melanócitos a um frasco de cultura de células do tipo T75. As células foram rapidamente descongeladas colocando a parte inferior do recipiente num banho de água a 37°C durante 1 minuto. As células foram ressuspendidas num frasco do tipo T-75 contendo o Meio de Crescimento dos Melanócitos. O frasco do tipo T-75 foi colocado numa incubadora a 37°C, humidificada com 5% de C02. 0 Meio de Crescimento dos Melanócitos foi mudado a cada 2-3 dias. As células foram subcultivadas quando a cultura alcançou uma confluência de 80%.

Os neofoliculos resultantes qual são apresentadas são representados na Fig. as diferentes fases 3 na de 32 desenvolvimento dos Neofolículos produzidos utilizando KC e MC derivados de fontes diferentes do foliculo capilar de mamifero. Na fase 1, as Neopapilas (sem adição de proteinas da matriz extracelular exógenas) são rodeadas por Melanócitos e queratinócitos, que foram adicionados à placa de fixação ultrabaixa formando um condensado multicelular inicial. Foi criado um agregado solto. Na fase 2, são visiveis os primeiros sinais de formação de estruturas foliculares numa cultura de fixação ultrabaixa. As células fixadas aderem às Neopapilas e adotam uma forma achatada enquanto é gerada uma protuberância no topo do condensado. Após aproximadamente 1 semana, o Neofoliculo começa a formar-se compreendendo o desenvolvimento de bainhas semelhantes a foliculos capilares. No Neofoliculo estabelecido, torna-se visivel um fio de cabelo primitivo claramente visivel. EXEMPLO 6: Análise da expressão genética de diferentes amostras de células derivadas da papila dérmica humana utilizando o Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays (uma cor) 33

Amostra n.° Amostra de células ID 1 DP 1 2 MONO 2 3 KOND 1 3 4 KOND 2 4

Tabela 2: Lista de amostras A amplificação de RNA SuperAmp® foi realizada de acordo com o procedimento Miltenyi Biotec. Brevemente, a amplificação é baseada num protocolo PCR global utilizando cDNA derivado de mRNA. 0 mRNA foi isolado através de tecnologia baseada em esferas magnéticas. As amostras de cDNA amplificadas foram quantificadas utilizando o espetrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Amostra de Células Concentração (ng/pL) Ratio (260/280) Volume (μΐ) Quantidade total de cDNA (pg) 1 161.92 \—1 00 \—1 20 3.2 2 143.79 1.86 20 2.9 3 123.05 00 00 \—1 20 2.5 4 117.41 1.84 20 2.3

Tabela 3: Sumário dos valores de cDNA A integridade do cDNA foi verificada através da plataforma Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). Os resultados do Bioanalizador foram analisados utilizando uma imagem de gel e um electroferograma utilizando o software especifico Bioanalizador Agilent 2100. O comprimento médio dos produtos de cDNA altamente amplificados situou-se entre 200-1,000 bp. 34 2. Hibridização do Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays

Foram utilizados 250 ng de cada um dos cDNAs como modelo para a rotulação Cy3 que foi realizada de acordo com o protocolo Miltenyi Biotec. Os cDNAs rotulados com Cy3 foram hibridizados durante a noite (17 horas, 65°C) num Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays 4 x 44K (tabela 4) utilizando a câmara e o forno de hibridização recomendados pela Agilent.

Experiência n.° Cy3 Microarray n.° 1 1 251485031842 1 1 2 2 251485031842 1 2 3 3 251485031842 1 3 4 4 251485031842 1 4

Tabela 4: Mapa de hibridização

Finalmente, os microarrays foram lavados uma vez com um tampão 6x SSPE contendo 0.005% de N-lauroilsarcosina durante 1 min à temperatura ambiente e subsequentemente foram lavados uma segunda vez com um tampão 0.06x SSPE pré-aquecido (37°C) contendo 0.005% de N-lauroilsarcosina durante 1 min. A última fase de lavagem foi realizada com acetonitrilo durante 30 seg. 3. Resultados da leitura

Os sinais fluorescentes dos Microarrays Agilent foram detetados utilizando o Agilent's Microarray Scanner System (Agilent Technologies). 4. Análise de imagens e de dados O Agilent Feature Extraction Software (FES) foi utilizado para ler e processar os ficheiros de imagem microarray. O software determina as intensidades das caracteristicas 35 (incluindo a subtração do fundo), rejeita os valores que excedem e calcula confidências estatísticas. Para a determinação da expressão genética diferencial FES os ficheiros de dados de saída derivados foram analisados utilizando o sistema de análise de dados de expressão genética Rosetta Resolver® (Rosetta Biosoftware). Este software oferece - entre outras características - a possibilidade de comparar dois perfis de intensidade individuais numa experiência de ratio. Todas as amostras foram rotuladas com Cy3, neste caso, as experiências de ratio são designadas como controlo versus (vs.) experiências de amostra (saída de dados automatizada do sistema Resolver®). Note-se, que os ratios são sempre calculados dividindo a intensidade do sinal da amostra pela intensidade do sinal de controlo. 5. Listas genéticas Lista de dados em bruto da experiência individual Lista de dados normalizados da experiência individual Lista do ratio genético/Lista genética de candidatos pré-seleccionados

Os dados de saída do Agilent Feature Extraction Software incluem listas genéticas com os conjuntos de dados em bruto completos, designadas por lista de dados em bruto da experiência individual. Além disso, as intensidades dos sinais das listas de dados em bruto da experiência individual são normalizadas dividindo os valores de intensidade pela respetiva mediana. Estas intensidades de sinais normalizadas são adicionadas a uma tabela comum da lista de dados normalizados da experiência individual. Esta lista além dos valores de intensidade normalizados compreende a característica glsPosAndSignif que é indicada com um valor = 1 quando a intensidade do sinal é positiva e está significativamente acima do fundo e um valor = 0 36 quando a intensidade do sinal não é positiva e está significativamente acima do fundo. 0 software Resolver® permite exportar uma lista genética com todos os ratios de amostra/controllogl0 normalizados e mudanças de 10 niveis, descrições sequenciais, valores p, etc., designados por lista de ratio genético (de todos os genes). Por exemplo: Uma "mudança de 10 niveis" nas listas de ratio genético indica uma expressão genética 10 vezes mais elevada no controlo comparativamente com a amostra. Os genes candidatos putativos com uma mudança >2 e um valor p <0.01 são sumarizados numa lista genética de candidatos pré-seleccionados. Um extrato de uma lista da referida natureza compreendendo alguns dos genes diferencialmente expressados é apresentado na tabela.

Nome do gene Função celular Ratio Mono Ratio 48 h Ratio 14 d Processo biológico COMP Matriz -26,07 -100 -16 Glicoproteina da matriz extracelular não colagénica, integridade da matriz, aderência de células MMP10 Matriz -43,08 12,25 8,47 A família da metaloproteinase da matriz (MMP) está envolvida na remodelação da matriz extracelular (tecido) MGP Matriz -100 -8,25 -3, 87 Constituinte estrutural da matriz extracelular, desenvolvimento do organismo multicelular, diferenciação de células CDK8 Ciclo de células 23, 89 16,07 4,47 Membro da família da proteína quinase dependente de ciclina (CDK), regulação de transcrição CDH3 Aderência -100 52,61 34,49 Ligação de ião de zinco, regulação de transcrição PCDHB5 Aderência -100 -100 10,12 Protocaderina beta 5, especificação diferencial de ligações célula-célula LlCAM Aderência 22,49 7,95 -1,65 Regulação do citoesqueleto de actina 37

Nome do gene Função celular Ratio Mono Ratio 48 h Ratio 14 d Processo biológico PCDH20 Aderência -28,97 -27,7 1,76 Protocaderina 20, estabelecimento e funcionamento das ligações especificas célula-célula PECAM1 Aderência -71,51 -100 46, 87 Sinalização da aderência célula a célula Jag2 Citocina -100 -100 -21 Impacto em: diferenciação de células, via de sinalização celular Notch, Regulação da apoptose, proliferação de células, comunicação de células, desenvolvimento do organismo multicelular, ciclo de células, determinação do destino das células, morfogénese do epitélio embrionário, aderência de células, migração de células TNFSF10 Citocina -75 -100 10,24 Apoptose LEF1 Factor de transcrição -100 -100 -8,5 LEF1 é uma proteína nuclear, regulação da via de sinalização celular de recetor Wnt SPRY1 Factores de crescimento -100 -100 -9,25 Regulação Sprouty dos sinais de tirosina quinase CTGF Factores de crescimento 2 -20 4 Fator de crescimento do tecido conjuntivo, mitoatractante major do tecido conjuntivo, resposta ao ferimento, matriz extracelular proteica

Tabela 5: Nível (ratio) de genes definidos medidos por análise de microarray nos fibroblastos (monocamada, condensados durante 48 horas, condensados durante 14 dias) comparados com fibroblastos da papila dérmica nativos. 0 que pode ser deduzido da tabela 5 é que com um período de cultivo prolongado, o nível de expressão de genes envolvidos em arranjos tridimensionais e a formação de 38 tecido se aproximam do nivel de expressão observado em fibroblastos da papila dérmica nativos.

Tabela 1: DMEM +- Dulbecco's modified Eagle Médium -

Composição (Gibco) COMPONENTES Peso Molecular Concentração (mg/L) Molaridade (mM) Aminoácidos Glicina 75 37.5 0.500 L-Alanina 8.9 Cloridrato de L-Arginina 84 L-Asparagina 13.2 L-Ácido aspártico 13.3 2HC1 L-Cistina 63 L-Ácido glutâmico 14.7 Cloridrato de L-Histidina H20 42 L-Isoleucina 105 L-Leucina 105 Hidrocloreto de L-Lisina 146 L-Metionina 30 L-Fenilalanina 66 L-Prolina 11.5 L-Serina 52.5 L-Treonina 95 L-Triptofano 16 Sal dissódico desidratado de L-Tirosina 104 L-Valina 94 Vitaminas Fosfato de Ácido Ascórbico 2.5 Cloreto de Colina 4 Pantotenato de D-Cálcio 477 4 0.00839 Ácido Fólico 441 4 0.00907 i-Inositol 7.2 Niacinamida 4 Cloridrato de Piridoxina 4 Riboflavina 0.4 Cloridrato de Tiamina 4 Sais Inorgânicos Cloreto de Cálcio (CaC12) (anidro) 111 200 1. 80 Nitrato de Ferro (Fe(N03)3''9H20) 0.1 Sulfato de Magnésio (MgS04) (anidro) 97.67 Cloreto de Potássio (KC1) 400 Bicarbonato de Sódio (NaHC03) 3700 Cloreto de Sódio (NaCl) 6400 Fosfato Dibásico de Sódio (Na2HP04-H20) 125 39 COMPONENTES Peso Molecular Concentração (mg/L) Molaridade (mM) Protéinas AlbuMAX® II 400 Transferrina Humana (Holo) 7.5 Cadeia Completa Recombinante de Insulina 10 Oligoelementos Metavanadato de amónio 0.0003 Sulfato de cobre 0.00125 Cloreto de Manganês 5 Selenito de Sódio 0.005 Outros Componentes D-Glucose (Dextrose) 4500 Etanolamina 1.9 Glutationa (reduzida) 307 1 0.00326 Fenol Vermelho 15 Piruvato de Sódio 110 Penicilina/Estreptomicina lOOu/ml|ΙΟΟμ/ml GlutaMAX®

Lisboa, 29 de Junho de 2012

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para produzir microfolículos capilares de mamífero compreendendo os seguintes passos: (a) disponibilizar pelo menos uma papila de novo; (b) disponibilizar pelo menos uma outra população de células selecionada do grupo dos fribroblastos, dos queratinócitos e/ou dos melanócitos, e (c) co-cultivar a papila de novo com pelo menos uma outra população de células sob condições de cultura de células não aderentes.

2. Um processo de acordo com a reivindicação 1, em que a pelo menos uma outra população de células pode ser derivada e/ou é derivada de um folículo capilar de mamífero, que é selecionado do grupo dos fibroblastos da bainha de tecido conjuntivo, dos queratinócitos e/ou dos melanócitos.

3. Um processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a papila de novo do passo (a) é revestida com proteínas da matriz extracelular, preferencialmente colagénio IV, fibronectina e/ou laminina.

4. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que as papilas de novo são produzidas de acordo com qualquer um dos processos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 6.

5. Um processo para produzir papilas de novo que podem ser utilizadas num processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, compreendendo os seguintes passos: 2 (a) disponibilizar pelo menos uma papila dérmica (DP) de pelo menos um folículo capilar de mamífero; (b) isolar os fibroblastos da papila capilar dérmica (DPFs) da DP através da fixação mecânica da referida DP na superfície de um recipiente de cultura de células, sendo que a lâmina de base é perfurada para permitir a saída dos referidos DPFs por migração; (c) expandir os DPFs isolados numa cultura monocamada sem revestimento de colagénio, em que os referidos DPFs são submetidos a uma passagem pelo menos uma vez; (d) condensar os DPFs expandidos em agregados de células que apresentam a dimensão e a forma da DP fisiológica, em que os referidos DPFs são diferenciados em recipientes de cultura de células não aderentes numa concentração de células por superfície de recipiente de 1.000 para 100.000 DPFs/cm2, e (e) revestir as papilas de novo com proteínas da matriz extracelular, preferencialmente colagénio IV, fibronectina e/ou laminina.

6. O processo de acordo com a reivindicação 5, em que os DPFs expandidos são condensados durante pelo menos 48h. Lisboa, 29 de Junho de 2012