KR20170020724A - 모발 성장을 조정하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

모발 성장을 조정하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본원에 제공된 방법 및 조성물의 실시양태는 대상체에게서 모발 성장을 유도하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태는 모발 성장을 조정하는 작용제에 관하여 스크리닝하는 것을 포함한다.

Description

모발 성장을 조정하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS TO MODULATE HAIR GROWTH}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 "인간 배아 줄기 세포로부터의 모발 성장 유도성 세포의 유래 및 그의 용도"란 발명의 명칭으로 2014년 7월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/022,639를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 포맷의 서열 목록과 함께 출원된다. 이러한 서열 목록은 그 크기가 대략 1.9 Kb이고, 2015년 6월 30일에 작성된, BURNHAM036WO_SEQLIST란 명칭의 파일로서 제공된다. 이러한 전자 포맷의 서열 목록 내의 정보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본원에 제공된 방법 및 조성물의 실시양태는 대상체에게서 모발 성장을 유도하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태는 모발 성장을 조정하는 작용제에 관하여 스크리닝하는 것을 포함한다.
배아 발생에서 모낭은 표피와 하층 중배엽 간의 호혜적 상호 작용에 의해 형성되는 것으로 제안되어 왔다 [1,2,3,4]. 진피 유두 (DP)는 표피 플라코드(placode) 형성에 반응하여 진피에서 세포 응축물로서 처음 생성된다. 모낭의 발생이 진행됨에 따라, 플라코드 내의 표피 세포가 활발히 증식하여 진피 응축물 (지금은 진피 유두라고 불린다)을 감싸서, 이들이 주변 진피와 분리된다 [5]. 이러한 새로운 니치(niche) 조건에 노출된 DP 세포는 BMP-4, 그의 억제제인 노긴(noggin), 및 표면 마커 N-CAM 및 p-75의 발현을 획득한다. 부가적으로, 그들은 특이적 세포외 매트릭스 단백질 [예를 들어, 베르시칸(versican; VCAN)]을 분비하고 고 수준의 알칼리성 포스파타제 활성 (AP)을 나타낸다 [6]. 연구자들은 이중 리포터 Lef1-RFP/K14-H2BGFP 마우스를 사용하여, 전향적으로 단리된 마우스 DP 세포의 상세한 유전적 시그너처(signature)를 확인하였고 [7], 뮤린 DP 유지 및 기능에 대한 요구사항으로서 Wnt, BMP 및 FGF 시그널링 경로를 확인하였다 [8,9,10]. DP 세포는 모발 성장과 순환에 있어서 일정 역할을 하며 [6] 모발의 크기와 모발의 유형을 결정한다 [11,12]. DP 세포는 배아 발생에서뿐만 아니라 출생 후에도 모낭 형성을 유도할 수 있다는 것이 오랫동안 인식되어 왔다. 코털(Vibrissae) DP 세포는 정상적으로 비-발모 피부 영역인 성체 래트의 발바닥에 이식될 때 신생 모발 형성을 유도하였다 [13]. 두피 피부로부터 단리된 인간 DP 세포는 설치류에 이식될 때 모발 형성에 기여하며 [14,15] 배양물에서 각질세포 형태발생을 유도한다 [16].
DP 세포는 탈모 질환에 대한 세포 기반 치료제로서 제안되어 왔다. 그러나, 인간 DP 세포는 필요한 양으로 수득될 수 없고 배양될 때 모낭 형성을 유도할 수 있는 능력을 급속히 상실하기 때문에 이러한 목적에 적합하지 않다 [7,8,17,18]. 따라서, 강력한 모발 성장을 유도할 수 있는 기능적 DP 세포를 개발할 필요가 있다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 유도된 진피 유두 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 모발 성장을 유도하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 유도된 진피 유두 세포의 집단을 수득하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 P-75, 네스틴(nestin), 베르시칸, 평활근 액틴, 알칼리성 포스파타제, 및 비멘틴(vimentin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 유도된 신경 능선 세포의 집단으로부터 생성된다. 일부 실시양태는 또한, 부착 세포에 관하여 선별하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단은 Sox10, Foxd3, 인테그린(integrin) 알파 4, 피브로넥틴에 대한 동족 수용체, CD47, CD184, CD44, P-75, 및 네스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단에는 OCT4, SSEA4, 베르시칸, 평활근 액틴, 및 알칼리성 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 마커가 결여된다.
일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단은 줄기 세포의 집단으로부터 생성된다. 일부 실시양태는 또한, 줄기 세포의 클러스터를 형성하기 위한 조건하에 줄기 세포의 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 상기 클러스터를 현탁액에서 배양하여 구(sphere)를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 상기 구를 기판의 표면 상에 플레이팅하는 것을 포함하는데, 여기서 상기 표면은 피브로넥틴 또는 폴리오르니틴으로 코팅된다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 배아 줄기 세포, 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 만능 줄기 세포는 섬유모세포, 신장 상피 세포, 및 혈액 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 H9 세포, 및 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성된 인간 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 공여자 대상체로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체와 상기 대상체는 동일하다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체와 상기 대상체는 상이하다.
일부 실시양태에서, 상기 투여는 피하 이식을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체 집단에서 대상체 피부의 특정 위치 (그 위치에서의 모발을 포함한다)에 투여한다. 일부 실시양태에서, 두피, 얼굴, 윗입술, 턱, 눈썹, 속눈썹, 팔, 다리, 등, 몸통, 및 복부로 이루어진 군으로부터 선택된 대상체 피부의 위치에 투여한다. 일부 실시양태에서, 반흔 조직을 포함하는 대상체 피부의 위치에 투여한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 탈모증이 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 유도된 진피 유두 세포의 집단을 시험 작용제와 접촉시키는 단계; 및 이러한 유도된 진피 유두 세포의 집단에서 모발 성장에 대한 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 모발 성장을 조정하는 작용제를 스크리닝하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 효과는 시험 작용제와 접촉되지 않은 유도된 진피 유두 세포의 집단과 비교해서, 유도된 진피 유두 세포의 집단 내에서의 모발 성장 속도가 증가되는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 효과는 시험 작용제와 접촉되지 않은 유도된 진피 유두 세포의 집단과 비교해서, 유도된 진피 유두 세포의 집단 내에서의 모발 성장 속도가 감소되는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 효과는 두피, 얼굴, 윗입술, 턱, 눈썹, 속눈썹, 팔, 다리, 등, 몸통, 및 복부로 이루어진 군으로부터 선택된 대상체 피부의 특정 위치에 특징적인 모발의 성장을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 생체 내에서 시험 작용제와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 시험관 내에서 시험 작용제와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 P-75, 네스틴, 베르시칸, 평활근 액틴, 알칼리성 포스파타제, 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 유도된 신경 능선 세포의 집단으로부터 생성된다. 일부 실시양태는 또한, 부착 세포에 관하여 선별하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단은 Sox10, Foxd3, 인테그린 알파 4, 피브로넥틴에 대한 동족 수용체, CD47, CD184, CD44, P-75, 및 네스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단에는 OCT4, SSEA4, 베르시칸, 평활근 액틴, 및 알칼리성 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 마커가 결여된다.
일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단은 줄기 세포의 집단으로부터 생성된다. 일부 실시양태는 또한, 줄기 세포의 클러스터를 형성하기 위한 조건하에 줄기 세포의 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 상기 클러스터를 현탁액에서 배양하여 구를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 상기 구를 기판의 표면 상에 플레이팅하는 것을 포함하는데, 여기서 상기 표면은 피브로넥틴 또는 폴리오르니틴으로 코팅된다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 배아 줄기 세포, 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 만능 줄기 세포는 섬유모세포, 신장 상피 세포, 및 혈액 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 H9 세포, 및 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성된 인간 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 유도된 신경 능선 세포의 집단으로부터 유도된 진피 유두 세포의 집단을 생성시키는 단계를 포함하는, 상기 유도된 진피 유두 세포의 집단을 제조하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 부착 세포에 관하여 선별하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 P-75, 네스틴, 베르시칸, 평활근 액틴, 알칼리성 포스파타제, 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단은 Sox10, Foxd3, 인테그린 알파 4, 피브로넥틴에 대한 동족 수용체, CD47, CD184, CD44, P-75, 및 네스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단에는 OCT4, SSEA4, 베르시칸, 평활근 액틴, 및 알칼리성 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 마커가 결여된다.
일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 집단은 줄기 세포의 집단으로부터 생성된다. 일부 실시양태는 또한, 줄기 세포의 클러스터를 형성하기 위한 조건하에 줄기 세포의 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 상기 클러스터를 현탁액에서 배양하여 구를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 또한, 상기 구를 기판의 표면 상에 플레이팅하는 것을 포함하는데, 여기서 상기 표면은 피브로넥틴 또는 폴리오르니틴으로 코팅된다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 배아 줄기 세포, 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 만능 줄기 세포는 섬유모세포, 신장 상피 세포, 및 혈액 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 H9 세포, 및 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성된 인간 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 전술된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 유도된 진피 유두 세포의 집단을 포함한다.
도 1a 내지 1e는 NC 중간체를 통하여 hESC를 DP-유사 세포로 분화시키는 것을 도시한 것이다. 도 1a는 분화 전략을 도식적으로 나타낸 것이다. 도 1b는 hESC-NC 배양물에서 이동성 NC 마커 Sox 10 및 Foxd3의 발현을 나타내는 2개의 현미경 사진이다. 면역형광 염색, DAPI (청색). 도 1c는 hESC-NC 배양물에서 NC 마커 인테그린 알파-4 (ITGA4) 및 hESC 마커 OCT4 및 SSEA4의 유동 세포계수 분석을 나타내는 일련의 3개의 그래프이다. 도 1d는 hESC-NC, hDP (정상 피부로부터 유래됨) 및 hESC-DP 배양물에서 p-75, 네스틴, 베르시칸, SMA 및 알칼리성 포스파타제 (AP)의 발현을 나타내는 일련의 현미경 사진이다. 면역형광 염색, DAPI (청색). 도 1e는 DP 패턴화(patterning) 동안 hESC-DP 배양물에서 hDP 마커 p-75, 넥신(Nexin)-1, 베르시칸, SMA 및 비멘틴의 Q-PCR 분석을 나타내는 일련의 그래프이다. 제0일 = hESC-NC 세포. hESC-NC 수준에 대한 배수 변화의 로그로서 나타낸, 유전자 발현 수준은 18S에 대해 정규화되었다. 각 유전자에 대해 점선은 hDP 세포 배양물에서의 유전자 발현 수준을 나타낸다. 척도 막대 100 μm.
도 2a 내지 2c는 누드 마우스 내로의 피하 세포 이식의 효과를 도시한 것이다. 도 2a는 단독으로 이식되거나 또는 마우스 신생아 진피 세포 (mDC), hDP, hESC-DP, 14일 동안 혈청에서 분화된 hESC (hESC-혈청), 인간 hESC-유래 신경 능선 세포 (hESC-NC) 및 7일 동안 DP로 분화된 hESC-NC (hESC-DP 7일)와 조합하여 이식된 각질세포의 전체 마운트의 입체 영상을 보여주는 일련의 현미경사진이다. 도 2b는 단독으로 이식되거나 또는 mDC, hDP 또는 hESC-DP와 조합하여 이식된 각질세포에 의해 유도된 정량 모발을 나타내는 그래프이다. 도 2c는 각질세포 단독 (점선으로써 가시화됨)과 비교해서 혈청의 존재하에 분화된 hESC (청색 다이아몬드) 또는 이식당 형성된 모발의 수 (적색 라인으로써 가시화된 경향)로서 제시된 hESC-NC (제0일)로부터의 분화 시간에 따른 ESC-DP 세포의 모발 유도 능력의 역학을 나타내는 그래프이다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타내며, 일원(one-way) ANOVA [크루스칼 왈리스(Kruskal-Wallis) 시험, 던(Dunn)의 다중 비교 포스트 시험]를 이용하여 분석하였다. *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.001. 척도 막대 1 mm.
도 3a 내지 3f는 GFP-표지된 hESC-DP 및 hIPSC-DP의 피하 이식을 일련의 현미경사진으로 도시한 것이다. 도 3a는 새롭게 형성된 모발에서 DP (화살표 헤드) 및 진피 캡슐 (화살표)의 위치에서 GFP-양성 hESC-DP 세포를 확인한 전체 마운트 이식체의 입체적 관찰을 도시한 것이고; 삽입된 도면은 DP 영역의 2배 확대를 보여준다. 도 3b는 GFP-표지된 hIPSC-DP가 모발의 DP 및 진피 캡슐에서 발견될 수 있다는 것을 도시한 것이다: 전체 마운트 이식체 (GFP/명시야) 및 8 μm 박편 (명시야). 삽입된 도면, 모낭의 DP 영역에서 GFP-양성 세포의 형광 영상 (명시야 영상에서 DP 영역의 흰색 사각형의 2배 확대). 도 3c 및 3d는 새롭게 형성된 모발의 GFP-양성 DP (GFP/명시야, 공초점 현미경)가 베르시칸 (베르시칸, 공초점 현미경) 및 알칼리성 포스파타제 (AP, 명시야)에 대해 각각 양성이라는 것을 도시한 것이다. 도 3e는 GFP 패널에서 공초점 영상과 함께, 외모근초(outer root sheath) 영역 (화살표)뿐만 아니라 GFP-양성 DP (윤곽선)에서 드물게 (새롭게 형성된 모발의 약 1%) NC-유래 GFP-양성 세포가 검출되었다는 것을 보여준다. 도 3f는 NC-유래 GFP-양성 세포가 이식체 내의 모발 매트릭스에서 발견되었다는 것을 나타낸다 (공초점 현미경). 삽입된 도면은 GFP-양성 세포의 2배 확대를 보여준다; GFP (백색). GFP-양성 세포 전반에 걸쳐 존재하는 여러 개의 멜라닌 과립 (흑색)을 주목해야 한다. 도 3a에 대한 척도 막대 250 μm; 도 3b 내지 3f에 대한 척도 막대 50 μm.
도 4a 내지 4b는 DP 세포 운명 취득에서 BMP 시그널링의 역할을 도시한 것이다. 도 4a는 선택적 BMP 억제제인 도르소모르핀(dorsomorphin)의 부재 또는 존재하에 유래된 hESC-DP 세포의 형태 및 이식 결과를 나타내는 현미경 사진을 도시한 것이다. 세포 배양물에 대한 척도 막대 50 μm 및 세포 이식에 대한 척도 막대 0.5 mm. 도 4b는 선택적 BMP 억제제인 도르소모르핀의 부재 또는 존재하에 hESC-DP 세포에서의 베르시칸, 코린(Corin), 넥신-1, p-75, 비멘틴 및 SMA의 발현의 Q-PCR 분석을 도시한 그래프이다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시되고, 스튜던츠(Student's) t-시험으로 분석하였다. *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.001.
도 5는 hESC-NC 배양물에서의 중간엽 마커 (CD47, CD184, CD44) 발현의 유동 세포계수 분석으로 hESC-NC에서 중간엽 마커의 발현을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 6은 계내에서 인체 모낭 DP 세포에서의 DP 마커의 발현을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. SMA, 알칼리성 포스파타제 (AP), 네스틴 및 베르시칸 동결 박편에 대한 면역형광 염색; DAPI (청색). 척도 막대 100 μm.
도 7은 GFP-양성 hDP 세포가 진피에서 발견될 수 있지만 새롭게 형성된 모발의 DP 영역 내로 혼입되지 않은 누드 마우스의 피부 아래의 인간 DP 세포의 이식을 도시하는 일련의 현미경 사진이다; 전체 마운트 이식체 (삽입된 도면은 DP 영역의 2배 확대를 보여준다). 척도 막대 250 μm.
도 8a 내지 8c는 NC 중간체를 통하여 hIPSC가 DP-유사 세포로 분화되는 것을 도시한 것이다. 도 8a는 hIPSC-NC 배양물에서의 신경상피 마커 Sox 2, Sox 9 및 네스틴의 발현을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 면역형광 염색, DAPI (청색). 도 8b는 인간 IPSC-DP 세포 배양물에서의 DP 마커 평활근 액틴 (SMA), P-75 및 네스틴의 발현을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 면역형광 염색, DAPI (청색). 도 8c는 베르시칸, 넥신-1, p-75, 비멘틴 및 SMA의 발현의 Q-PCR 분석을 도시하는 그래프이다. 유전자 발현 수준은 18S에 대해 정규화하였고, 발현의 hESC-NC 수준에 대한 배수 변화 로그로서 나타낸다. 척도 막대 100 μm.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 실시양태는 대상체에게서 모발 성장을 유도시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 유도된 신경 능선 세포의 집단 (이는 결국 줄기 세포의 집단으로부터 생성될 수 있다)으로부터 생성될 수 있다. 유도된 진피 유두 세포의 집단은 대상체 내로 피하 이식되어 모발을 생성시킬 수 있다. 유리하게, 각 세포 집단을 증폭시켜, 이식체에 사용하는 것과 같은 사용에 이용될 수 있는 유도된 진피 유두 세포의 거대 집단을 제공할 수 있다. 유도된 진피 유두 세포를 이용하여, 피부 장애, 예컨대 화상, 반흔 및 탈모가 있는 대상체를 치료할 수 있다. 다른 실시양태는 모발 성장을 조정하는 작용제에 관한 스크리닝을 포함한다. 시험 작용제를 유도된 진피 유두 세포의 집단과 접촉시키고 그 효과를 측정할 수 있다. 모발 성장 속도, 말단 모발 또는 솜털(vellus hair)의 형성, 모간(hair shaft)의 색상, 모간의 두께, 및 모간 내의 디술피드 결합 수준과 관련된 효과를 가져다주는 작용제를 시험할 수 있다.
진피 유두 (DP)는 모낭 형성과 성장 주기를 조절하는 중간엽 세포의 독특한 집단이다. 발생 동안 대부분의 DP 세포는 중배엽으로부터 유래되지만, 두부 모발의 기능적으로 등가인 DP 세포는 신경 능선 (NC)으로부터 유래된다. NC는 발생 중인 배측 신경관으로부터 일시적으로 유발되고 말초 신경계, 부신 수질, 멜라닌 세포 및 각종 두개 안면 중간엽 조직을 포함한 여러 조직을 생성시키는 세포 집단이다 [19]. Lox-STOP-Rosa26 또는 Z/EG 리포터 마우스를 사용한 NC-특이적 (Wnt1-Cre) 계통 추적은 두부의 DP 세포의 많은 부분에 대한 NC 기여의 유전적 증거를 제공하였다 [20,21,22].
본 출원인은 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로부터의 기능적 DP-유사 세포의 도출을 포함하는 방법 및 조성물을 개발하였다 (문헌 [Gnedeva K., et al., "Derivation of Hair-Inducing Cell from Human Pluripotent Stem Cells" (2015) Derivation of Hair-Inducing Cell from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 10(1): e0116892. doi:10.1371/journal.pone.0116892] 참조; 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, hESC를 이용하여 NC 세포를 생성시킬 수 있고, 그 다음에 배양 중인 모발-유도성 DP-유사 세포를 생성시킬 수 있다. hESC-유래 DP-유사 세포 (hESC-DP)는 성체 인간 DP 세포에서 전형적으로 발견되는 마커 (예를 들어 p-75, 네스틴, 베르시칸, SMA, 알칼리성 포스파타제)를 발현하였고, 면역결핍성 누드 마우스의 피부 아래에 이식될 때 모낭 형성을 유도시킬 수 있었다. hESC-유래 DP-유사 세포는 새롭게 형성된 모낭의 DP 내로 혼입된 GFP를 발현하도록 조작되었고, 적당한 마커를 발현하였다. BMP 억제제인 도르소모르핀이 hESC-DP 배양물로부터 모발 유도 활성을 제거했기 때문에 BMP 시그널링이 hESC-DP 유래의 한 요인이다.
모발 성장을 유도시키는 방법
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 대상체에게서 모발 성장을 유도시키는 방법을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단을 상기 대상체에게 투여한다. 투여 방법은 유도된 진피 유두 세포를 대상체의 피부 내로 이식하는 것을 포함할 수 있는데, 예를 들어 투여는 유도된 진피 유두 세포를 피하 이식하는 것을 포함할 수 있다. 유도된 진피 유두 세포는 대상체 피부의 어떠한 위치에도 투여할 수 있는데, 예를 들어 두피, 얼굴, 윗입술, 턱, 눈썹, 속눈썹, 팔, 다리, 등, 몸통, 손, 발, 및 복부와 같은 대상체 피부의 특정 위치에 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체 피부의 위치는 반흔 조직을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 탈모증이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유류, 예컨대 인간이다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 다른 세포 유형, 예컨대 단리된 유도된 신경 능선 세포로부터 생성되었던 진피 유두 세포의 특징을 지닌 세포의 단리된 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 특징은 진피 유두 세포와 연관된 마커, 예컨대 단백질, 발현된 핵산, 모낭 형성을 유도시키는 활성, 각질세포 형태발생을 유도시키는 활성, 및 모간 성장을 유도시키는 활성을 포함할 수 있다. 마커의 예는 BMP-4, 노긴, N-CAM, 및 p-75, 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 베르시칸 (VCAN), 알칼리성 포스파타제 활성 (AP), 네스틴, 평활근 액틴, 및 비멘틴을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포는 유도된 신경 능선 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부착 세포는 유도된 진피 유두 세포의 단리된 집단을 생성시키는 유도된 신경 능선 세포의 집단으로부터 선택된다. 예를 들어, 유도된 신경 능선 세포의 집단은 기판 상에 플레이팅할 수 있고, 부착 세포는 이러한 기판에 부착시킬 수 있으며, 비-부착 세포는 상기 기판로부터 세척할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기판은 플라스틱이다.
일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포의 특징은 신경 능선 세포와 연관된 마커, 예컨대 단백질, 발현된 핵산, 세포, 예컨대 멜라닌 세포, 두개안면 연골 및 뼈, 평활근, 말초 및 장의 뉴런 및 신경교를 생성시킬 수 있는 활성을 포함할 수 있다. 마커의 예는 Sox10, Foxd3, 인테그린 알파 4, 피브로넥틴에 대한 동족 수용체, CD47, CD184, CD44, P-75, 및 네스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서 유도된 신경 능선 세포의 집단에는 OCT4, SSEA4, 베르시칸, 평활근 액틴, 및 알칼리성 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 마커가 결여된다.
일부 실시양태에서, 유도된 신경 능선 세포는 줄기 세포의 집단으로부터 생성될 수 있다. 줄기 세포로부터 유도된 신경 능선 세포를 생성시키는 방법의 예가 문헌 ([Bajpai R., et al. Cell Death and Differentiation (2009) 16, 807-825] 및 [Curchoe CL, et al. (2010) Early acquisition of neural crest competence during hESCs neuralization. PLoS One 5: e13890]; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 줄기 세포의 클러스터를 형성하기 위한 조건하에 배양된다. 일부 실시양태에서, 상기 클러스터는 현탁액에서 배양하여 구를 형성한다. 일부 실시양태에서, 상기 구는 기판의 표면 상에 플레이팅한다. 일부 실시양태에서, 상기 표면은 피브로넥틴 또는 폴리오르니틴으로 코팅된다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 또는 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다. 유도된 만능 줄기 세포는 각종 공급원, 예컨대 섬유모세포, 신장 상피 세포, 및 혈액 세포로부터 생성될 수 있다. 유도된 만능 줄기 세포를 생성시키는 방법의 예는 문헌 ([Takahashi, K. and Yamanaka, S (2006) Cell 126 (4): 663-76]; [Zhou H, et al. (2009) Cell Stem Cell 4 (5): 381-4]; [Zhou, et al., (2012) Nature Protocols 7 (12): 2080-2089]; 및 [Moad, M., et al. (2013) European Urology 64 (5): 753-761]; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포의 집단은 세포, 예컨대 H9 세포, 또는 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성된 인간 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 공여자 대상체로부터 수득된다. 예를 들어, 세포의 샘플은 공여자 대상체로부터 취할 수 있고; 이러한 세포의 샘플로부터 생성된 유도된 만능 줄기 세포의 집단으로부터 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체와 상기 대상체는 동일하다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체와 상기 대상체는 상이하다.
모발 성장을 조정하는 작용제를 스크리닝하는 방법
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 모발 성장을 조정하는 작용제를 스크리닝하는 방법을 포함한다. 이러한 일부 실시양태는 유도된 진피 유두 세포의 집단을 시험 작용제와 접촉시키는 단계; 및 이러한 유도된 진피 유두 세포의 집단에서 모발 성장에 대한 효과를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 작용제는 화합물, 몇 가지 화합물을 포함하는 조성물, 및 물리적 조건, 예컨대 온도 및 pH를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 효과는 시험 작용제와 접촉되지 않은 유도된 진피 유두 세포의 집단과 비교해서, 유도된 진피 유두 세포의 집단 내에서의 모발 성장 속도의 변화, 예컨대 유도된 진피 유두 세포의 집단 내에서의 모발 성장 속도의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다. 모발 성장 속도는 모간의 형성 속도, 또는 모간을 형성하는 활성을 갖는 모낭의 형성 속도에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 효과는 두피, 얼굴, 윗입술, 턱, 눈썹, 속눈썹, 팔, 다리, 등, 몸통, 및 복부로 이루어진 군으로부터 선택된 대상체 피부의 특정 위치에 특징적인 모발의 성장을 포함할 수 있다. 대상체 피부의 특정 위치의 모발의 특징적인 예는 모간의 두께, 길이, 강도, 및 모발 주기의 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 효과는 모발, 예컨대 말단 모발, 또는 솜털의 성장을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 효과는 모간의 색상, 예컨대 갈색, 흑색, 적색, 백색, 회색, 및 금발을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 효과는 모간에서의 컬(curl) 정도를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 효과는 모간의 두께를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 효과는 모간에서의 디술피드 결합의 수준을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 생체 내에서 시험 작용제와 접촉된다. 예를 들어, 유도된 진피 유두 세포는 대상체의 피부 내로 이식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 진피 유두 세포의 집단은 시험관 내에서 시험 작용제와 접촉된다.
실시예
NC 세포 중간체를 이용한 hESC -DP의 도출
인간 DP-유사 세포는 NC 중간체를 통하여 hESC로부터 수득하였다 (도 1a). hESC는 기존에 보고된 바와 같이 [24,25] hESC-유래 신경 능선 세포 (hESC-NC)로 분화되도록 유도되었다. hESC-NC 배양물은 신경 능선 마커 Sox10 및 Foxd3의 강력한 발현을 나타내었다 (도 1b). 유동 세포계수 분석 결과, 배양된 hESC-NC 세포의 거의 80%가 NC 마커 인테그린 알파 4 (ITGA4), 피브로넥틴에 대한 동족 수용체를 발현하고 [26], OCT4 및 SSEA4의 발현은 결여되는 것으로 확증되었는데, 이는 미분화된 hESC의 부재를 암시한다 (도 1c).
신경 능선은 각종 중간엽 조직에 대한 중간체를 유발시키는 세포의 다능성 집단이다 [19]. FACS 분석 결과, 분화 14일째의 hESC-NC 세포는 중간엽 줄기 세포 마커 CD47 (99.95%), CD184 (20%), 및 CD44 (52.58%)를 발현한 것으로 밝혀졌다 (도 5). DP-유사 세포를 생성하기 위해, hESC-NC를 추가로 2주 동안 10% FBS를 함유하는 DMEM-F12 배지에서 분화하도록 유도시켰다 (도 1a). DP 세포는 체세포 진피 줄기 세포이고 [27], 중간엽 줄기 세포 (MSC) 마커를 발현한다 [28]. 따라서, 중간엽 세포는 조직 배양 플라스틱에 대한 우선적 부착을 이용하여 분화되는 hESC-NC 배양물로부터 강화되었다 [29]. 일상적으로, hESC-NC 배양물의 약 20%가 플라스틱에 부착되었고 혈청 함유 배지 내에서 계대되어 hESC-유래 DP-유사 세포 (hESC-DP)가 생성되었다. 이러한 결과는 hESC-유래 NC 세포가 MSC 및 DP 세포에 대한 단리 프로토콜 및 배양 조건을 이용하여 강화될 수 있는 세포의 중간엽 전구 집단을 함유한다는 것을 암시한다.
hESC -DP 세포의 특징화
마우스 배측 피부 DP 세포의 시그너처 유전자는 편집되었지만 [7], 인간의 두부 진피 유두 세포에서의 유전자 발현에 관해서는 거의 공지되지 않았다. 마우스와 인간의 DP 세포 둘 다에 대한 마커를 이용하여 중간엽 hESC-DP를 특징화하였다. DP와 신경 능선에 대한 공통 마커인 P-75 및 네스틴이 hESC-NC 세포, 배양된 인간 DP 세포 (hDP) (정상적인 인간 피부로부터 단리됨) 및 hESC-DP 세포에서 검출되었다 (도 1d) [21]. 다른 인간 DP 마커인 베르시칸, 평활근 액틴 (SMA) 및 알칼리성 포스파타제 (AP)는 hESC-NC 세포에서 검출되지 않았지만, hDP 및 hESC-DP 배양물에 존재하였다 (도 1d). hDP에서 네스틴, 베르시칸, SMA 및 AP에 대한 염색의 특이성은 인간 두피 피부 박편을 이용하여 확증하였다 (도 6). hESC-NC에서의 NC 마커 P-75 (약 30%) 및 네스틴 (약 90%)의 발현은 hESC-DP 배양물에서와 유사하였고 (p-75 약 40%, 네스틴 약 90%), hDP 세포에서의 발현과 근접한 패턴을 나타내었다 (P-75 약 20%, 네스틴 약 90%). 이와는 달리, hESC-NC 세포는 베르시칸 (<1%), SMA (<3%)에 대하여 음성이었고 AP 활성은 완전히 결여된 반면, 대다수의 hESC-DP는 베르시칸 (약 70%), SMA (약 70%)를 발현하였고, 인간 DP 세포에서 발견된 것과 유사한 고 수준의 AP 활성을 나타냈는데, 베르시칸, SMA 및 AP에 대해 거의 100% 양성이었다. 마커의 전반적인 세포 형태와 세포하 국재화는 인간 DP 세포의 배양물과 hESC-DP의 배양물 간에 유사하였다. hESC-NC가 hESC-DP로 분화하는 동안 DP 마커의 발현 역학을 정량적으로 평가하기 위해, Q-PCR 분석을 이용하였다. 시험된 모든 인간 DP 마커 (p-75, 넥신-1, 베르시칸, SMA, 및 비멘틴)의 발현 수준은 hESC-NC 분화 동안 점진적으로 증가하였고, 2주 후에는 인간-DP 세포 배양물에서 발견된 것과 거의 동등한 수준이거나 또는 그 보다 더 높았다 (도 1e). 취합해 보면, 이들 결과는 hESC-DP 배양물 내에 인간 DP-유사 세포가 존재한다는 것을 암시한다.
이식시 hESC -DP의 모발-유도 특성
hESC-DP 세포가 무흉선 nu/nu (누드) 마우스에서의 이식시 모낭의 형성을 유도시키기에 적격한지의 여부를 조사하였다. 마우스 피부-유래 진피 전구체의 모발-유도 잠재력을 입증하기 위해 기존에 사용되었던 세포 이식의 패치 방법을 사용하였다 [27]. 간략하게 설명하면, 관심 세포를, 갓난 동물로부터 단리되고 진한 세포 현탁물로서 누드 마우스 내로 피하 이식된 마우스 표피 세포 (각질세포)와 조합하였다. 누드 마우스는 BALB/c (알비노) 유전적 배경을 갖고 있기 때문에, 새롭게 형성된 모발과 기존의 모발은 이식을 위해 짙은색 모발의 C57BL/6 마우스로부터의 표피 세포를 사용함으로써 구별할 수 있었다. 모발-유도 용량은 이식체 당 형성되는 모발의 수로서 측정되었다. 패치 방법은 새롭게 형성된 모발이 형태 발생의 진행된 단계에서 모낭 형태를 교란시키는 피부 표면으로 유입되는 것을 허용하지 않는다. 따라서, 모낭이 형성되긴 하였지만, 완전히 발생되지는 않은, 이식 후 14일에 분석을 수행하였다. 표피 세포만을 이식하면, 최소한의 모발이 유도되었는데, 이는 내인성 DP 세포가 존재하기 때문인 것으로 예상된다 (도 2a, 2b). 양성 대조군으로서 사용된 마우스 진피 세포 (mDC)는 강력한 모발 성장을 유도시켰는데 (P=0.0282), 그 효율은 동일한 이식 모델에 대해 기존에 보고된 것과 유사하다 [27] (도 2a, 2b). 예상된 바와 같이, 성체 두피 피부로부터 단리된 배양된 인간 DP 세포는 음성 대조군 (각질세포 단독)과 비교해서 유의적 수의 모발을 유도시키지 못하였다 (도 2a, 2b). 실제로, 인간 DP 세포가 단일 모발의 이종간의 개량에 기여하는 것으로 밝혀졌지만 [14], 마우스 모델에서 인간 DP 세포의 강력한 모발-유도 능력은 보고되지 않았다 [18]. 이와는 반대로, mDC의 것과 유사한 hESC-DP에 의한 유의적 (P=0.0002) 모발-유도가 관찰되었다 (도 2a, 2b).
hESC가 DP-유사 세포로 분화하는 동안 모발 유도 특성의 역학을 모니터링하기 위해, hESC-DP 및 몇 가지 관련된 세포 집단, 즉 NC 유도의 중간 단계를 건너뛰어 DP 배지에서 2주 동안 분화된 hESC (hESC), hESC-NC 및 부분적으로 분화된 hESC-DP (분화 7일)를 이식하였다 (도 2c). 놀랍게도, 혈청 조건에서 분화된 hESC 뿐만 아니라 hESC-NC를 이식하면, 음성 대조군과 비교해서 모발 성장이 상당히 억제되었다 (도 2c). 따라서, hESC-NC가 hESC-DP 세포로 분화되면, 모발 유도 능력이 거의 100배 증가하였다 (도 2c). 부분적으로 분화된 hESC-NC 이식체에서 형성된 모발의 수는 음성 대조군에서보다 유의적으로 상이하지 않았다 (도 2c).
이러한 결과는 본원에 기재된 hESC-DP 세포가 신생아 마우스 진피 세포와 유사한 강력한 모발 유도 능력을 가진다는 사실과 hESC-NC가 분화 과정을 따라 이러한 능력을 획득한다는 사실을 암시한다.
hESC -DP가 새로 형성된 모낭의 DP 내로 혼입된다
이식된 hESC-DP는 내인성 마우스 DP 세포를 동원/활성화시킬 수 있거나 또는 관찰된 모낭 형성의 유도를 직접적으로 매개할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, hESC-DP가 GFP를 발현하도록 조작하였고, 새롭게 형성된 모낭을 계내 분석하였다 (도 3). 패치 방법을 이용하여 누드 마우스의 피부 아래에 이식한지 14일 후에, 모간의 흑색 색소침착에 의해 결정될 수 있는 새로운 모발 형성을 관찰하였다. hESC-DP 이식체를 입체적으로 관찰한 결과, 새롭게 형성된 모발의 대다수의 DP와 진피 캡슐이 GFP-양성 세포로 구성되었다는 사실이 제안되었다 (도 3a). hESC-DP 이식체로부터 단리된 전체 마운트 모발의 공초점 현미경 검사 결과, 새롭게 유도된 모발 내에 GFP-양성 DP 세포가 존재하는 것으로 나타났다 (도 3c, 3d, 3e). 이들 모발의 GFP-양성 DP는 특이적 마커, 즉 베르시칸 (도 3c) 및 AP (도 3d)에 대해 양성으로 염색되었다. GFP-양성 DP 이외에도, GFP-양성 세포가 외모근초 및 내모근초 영역에 존재하는 것으로 관찰되었다 (도 3e). 모발 매트릭스 내의 GFP-양성 세포의 세포질 내에 멜라닌 과립이 존재하는 것으로 또한 관찰되었다 (도 3f). 이들 데이터는 이식된 hESC-DP가 DP 세포의 모발 유도 기능을 획득할 수 있다는 것을 제안한다.
hIPSC -DP의 유래 및 성상 확인
인간 ESC의 H9 계통 이외에도, 정상 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성되고 기존에 명확히 규명된 인간 유도된 만능 줄기 세포 (hIPSC) 3가지 계통을 사용하였다 [30]. hIPSC-NC 세포는 앞서 기재된 프로토콜에 따라서 생성하였고, 이를 대상으로 하여 신경상피 마커 Sox2, Sox9 및 네스틴의 존재에 관하여 분석하였다. 3가지 계통 모두로부터 수득된 hIPSC-NC는 유사한 발현 패턴을 나타내었다. hIPSC-NC 세포의 약 50%만이 Sox2 및 Sox9를 발현하였고, 부가적으로 네스틴 염색 결과, hESC-NC 세포와 비교해서 형태학적 차이가 드러났다 (도 8a, 도 1d).
상기 언급된 프로토콜을 이용하여, hIPSC-NC 세포를 분화시켜 hIPSC-DP를 수득하였다. DP 마커 SMA, p-75 및 네스틴에 대하여 면역염색할 뿐만 아니라 베르시칸, 넥신-1, p-75, 비멘틴 및 SMA를 Q-PCR 분석한 결과, 1개의 hIPSC 계통 (BJ16)만이 hESC-DP 세포와 비교해서 DP 마커의 일부 발현을 나타내는 세포를 생성시켰다는 것이 밝혀졌다 (도 8b). 도 8c는 hESC-NC 세포와 비교한 hIPSC-DP 내에서의 유전자 발현 수준을 보여준다.
BJ16 IPSC-DP 세포는 패치 이식에 의해 추가로 명확히 규명하였다. 이러한 세포 집단은 음성 대조군과 비교해서 유의적 수의 모발을 유도시키지 못하였다. 그러나, GFP-양성 BJ16 IPSC-DP 세포를 이식하면, hESC-DP 세포의 경우보다 비록 훨씬 더 낮은 빈도 (50개 중 1개의 모발)로 나타나긴 하였지만 GFP-양성 진피 유두 및 진피 캡슐을 수반한 모발이 형성되었다. 이들 모발의 DP 내에 GFP-양성 세포가 존재한다는 사실이 박편에서 확증되었다 (도 3b).
주목할 만하게, 새롭게 형성된 모발의 유두 및 캡슐 영역 내로의 이식된 세포의 통합은 hESC-DP 및 hIPSC-DP 세포의 경우에서만 관찰되었다. GFP를 발현하도록 조작된 이식된 인간 DP 세포가 진피에 존재하긴 하였지만, 이들 세포는 인접한 모낭의 DP에서는 발견되지 않았다 (도 7). 이러한 결과는 인간 다능성 세포-유래 DP-유사 세포가 성체 인간 피부로부터 분리된 DP 세포와 일부 특이적 마커의 발현을 공유하기는 하지만, 그들의 모발 유도 능력이 더 높고 탈모 질환의 세포 기반 치료에 적용될 수 있다는 것을 암시한다.
hESC -DP의 유래에 있어서 BMP 시그널링의 역할
발생 동안 이동성 NC로부터 DP의 생성에 관여한 기전은 공지되어 있지 않다. 그러나, NC 세포로부터 DP 분화를 유도하기 위해 사용되는 태아 소 혈청이, 배아 발생 동안 중배엽 명세 [32,33]와 시험관 내에서 hESC로부터의 중배엽 유도 [34]에 필수적인 뼈 형성 단백질 (BMP) [31]을 함유하는 것으로 공지되어 있다. BMP 시그널링이 마우스 등 피부 DP 내에서 모낭 유도 잠재력을 유지시켜 주는 기전인 것으로 밝혀졌다 [9]. 널리 연구되어 온 선택적 BMP 억제제인 도르소모르핀을 이용하여 hESC-NC 세포로부터 hESC-DP 세포를 유래하는 데 있어서 BMP 시그널링이 일정 역할을 하는지를 조사하였다 [35]. NC가 DP로 전환되는 동안 도르소모르핀을 부가하면, 양성 대조군과 비교해서 세포 형태에 있어서 명백한 변화가 초래되었는데, 특히 hESC-DP 세포는 특징적인 섬유모세포-유사 신장된 형태를 갖는 반면, 도르소모르핀 처리된 세포는 6각형이었고 그들의 세포질 내의 여러 과립 상에 존재하는 것으로 입증되었다 (도 4a). 더욱이, 누드 마우스 피부 아래에 이식된 도르소모르핀 처리된 세포는 모발 형성을 유도시킬 수 없었는데, 이는 DP 특성의 상실을 시사한다 (도 4a). 도르소모르핀 처리된 세포를 Q-PCR 분석한 결과, BMP 시그널링을 억제하면 DP-특이적 마커 베르시칸 (P=0.0002), 코린 (P=0.0022), 넥신-1 (P=0.0008) 및 비멘틴 (P=0.0001)을 코딩하는 mRNA의 수준은 상당히 감소되었지만, 범(pan) NC 마커 p-75 (변하지 않음) 또는 평활근 마커 SMA (상당히 증가됨)는 그렇치 않은 것으로 밝혀졌다 (도 4b). 그러나, DP 세포는 유일한 분화 작용제로서 BMP를 이용하여 hESC-NC 배양물로부터 유래될 수 없었는데, 이는 다른 시그널링 경로가 두부 DP 세포 운명 취득에 관여한다는 것을 암시한다. 이러한 결과는 BMP 시그널링이 hESC-NC 세포로부터 모발 유도성 hESC-DP의 생성 및/또는 유지에 필요하긴 하지만, 충분하지는 않다는 것을 나타낸다.
그 결과는 혈청 함유 배지에서 배양된 hESC-유래 NC 세포가 인간 DP 세포의 마커를 점진적으로 획득하고, 모발 유도 잠재력을 지닌 부착 세포 집단을 유발시킨다는 것을 제안한다. 인간 DP 세포와 비교해서 hESC-DP의 강력한 모발 유도 능력은 상이한 기전을 통하여 모낭 형성을 유도하는 것으로 공지되어 있는 진피 유두 전구체 세포의 배아 또는 신생아 집단과의 주요 유사성을 반영할 수도 있다 [36].
hESC-DP 배양물은 이질적인 것으로 예상된다. 이들 배양물에 의해 나타난 평균 모발 유도 능력은 신생아 마우스 진피 세포와 유사하였다. 전향적으로 정제된 1차 마우스 DP 세포는 마우스 진피 제제보다 모발 유도에 있어서 약 5배 더 효율적인 것으로 밝혀졌다 [27]. 따라서, hESC-DP 배양물이 모발 유도성 DP-유사 세포의 서브-집단을 포함하는 것이 가능한데, 이는 상기 보고된 평균 보다 훨씬 더 높은 모발 유도 능력을 갖는다. 부가적으로, GFP-양성 hESC-DP가 이식되었을 때, 모낭의 다른 구획 (즉, 외모근초, 내모근초 및 모발 매트릭스)에 GFP-양성 세포가 존재하는 것으로 관찰되었다. 멜라닌 세포는 발생 동안 이동성 NC로부터 유래되는 것으로 공지되기 때문에, 일부 hESC-NC 세포는 hESC-DP 배양물 내에서 멜라닌 세포 전구체를 생성시키는 것으로 예상된다. 유사하게, 일부 hESC-NC는 새롭게 형성된 모발의 각질세포를 생성시킬 수 있는 것이 가능한데, 이는 설치류 NC 세포가 수염의 돌출부(whisker's bulge)에서 표피 줄기 세포를 유발시킬 수 있기 때문이다 [37]. 이러한 데이터는 hESC-DP가 모발 유도 특성을 지닌 DP-유사 세포를 함유하는 NC-유래 세포의 혼합 집단이지만, 멜라닌 세포와 각질세포 형성 세포를 함유할 수도 있다는 것을 암시한다.
상기 결과는 NC 계통으로의 hESC 분화의 중간 단계가 중요한 것으로 보이며, NC 유도를 건너뛰면 모발 유도 활성이 완전히 상실된다는 것을 암시한다. hESC를 NC 세포로 유도하는 것이, 중간엽 세포 유형의 다양성을 피부 내의 NC 세포로부터 하류에 발생적으로 명시된 서브세트 (예를 들어, 발생 중인 두부 DP, 멜라닌 세포, 두부 돌출)로 제한할 수 있다. 따라서, hESC-DP-유사 세포에는, 혈청 함유 배지에서 비교적 통상적인 중간엽-강화 조건, 예컨대 분화 및 부착 세포 유형에 관한 선별을 이용하여 모발 유도성 DP-유사 세포가 현저하게 강화되었다.
상이한 iPSC 계통은 DP-유사 세포로 분화하는 가변적 경향을 나타낼 수도 있다. hiPSC-DP 세포는 패치 방법을 이용하여 이식될 때 모낭 형성을 유도할 수 없었고, 새롭게 형성된 모낭의 DP 내로의 혼입 빈도가 낮았다. 이는 IPSC 분화에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있는, 후성 기억 현상에 따른 결과일 수 있다 [38,39,40]. 이들 실험에 사용된 IPSC 계통은 BJ 섬유모세포로부터 유래되었다 [30]. 그들의 중배엽 기원은 분화의 첫 번째 단계인 외배엽 신경 능선 세포의 유도에 어려움을 야기시킬 수 있었다. 실제로, 일부 hIPSC-NC 세포만이 신경상피 마커 Sox2 및 Sox9를 발현하였다 (도 8a, 8b). 그러나, 다수의 hiPCS 계통과 hESC 계통을 포괄적으로 비교한 결과, 충분히 많은 수의 hiPSC 계통을 hESC 계통과 비교하였을 때, 그들의 분화 잠재력에 있어서 주요 중복이 관찰되었다 [41]. 따라서, 상이한 hESC 계통과 hiPSC 계통 간의 절대 효율이 다양할 수 있긴 하지만, 많은 hiPSC로부터 모발 유도 특성을 가진 세포가 유래되는 것이 가능해야 한다 [42].
최근에는, SKP가 모발 유도에 있어 고도로 강력한 것으로 나타났지만 [27], 노화 과정에서 SKP가 점진적으로 상실되면, 노인들을 위한 모발 재생 요법을 위하여 자가 조직 SKP를 단리하는 것이 방해될 수 있다 [43]. hESC로부터 모발 유도성 DP-유사 세포를 유래시키는 것이, 탈모가 있는 사람들을 위한 세포 기반 치료제의 개발을 향한 첫 번째 단계를 나타낸다.
물질 및 방법
hESC 배양물: H9 hESC 계통을 기존에 보고된 바와 같이 방사된 마우스 배아 섬유모세포 공급자 층 상에 유지시켰다 [24]. hESC로부터 NC 세포의 생성: 분화 프로토콜은 기존에 보고되었다 [24,25]. ESC-DP의 생성: 제1 계대의 NC 세포를 다음 조성의 DP 배지와 함께 3일 동안 배양하였다: DMEM/F-12 글루타맥스(Glutamax) [깁코(Gibco) 10829-018], 10% FBS (깁코 #10437), 1 mM L-글루타민 (깁코 25030-081), 1X 항생제/항진균제 [오메가 사이언티픽(Omega Scientific) AA-40]. 그 후에, 그들을 0.25% 트립신-EDTA 용액 (깁코 25200)으로 단일 세포 현탁액이 되도록 해리시켰고, 밀도 100,000개 세포/mm-2의 코팅되지 않은 배양 접시 상에 플레이팅하였다. 24시간 후에도 부착되지 않은 부유 세포는 그 다음 날 배지 변화를 이용하여 제거하였다. 부착된 세포는 격일로 배지를 변화시킨 코팅되지 않은 플라스틱 접시에서 성장시켰고; 배양물은 4 내지 5일마다 이동시켰다.
면역조직화학 및 FACS 분석: 세포 배양물을 실온에서 10분 동안 PBS 중의 4% PFA로 고정시켰고; 조직 샘플은 4℃에서 밤새 고정시켰다. 고정시킨 후, 세포를 PBS에서 5분 동안 3회 세척하였고, 조직 샘플을 동결된 박편에 대하여 OCT에서 포매시켰거나 또는 모발 해부체 및 전체 마운트 제제에 사용하였다. 세포 및 박편은 염색하기 1시간 전 동안 PBS 중의 0.05% 내지 0.3% 트리톤(Triton) X 100 [시그마(Sigma) T8787]을 이용하여 4% BSA 또는 10% 염소 혈청에서 차단시켰다. 1차 항체를 4℃에서 밤새 적용하였다. 이어서, 세포 또는 박편을 PBS에서 매회 15분 동안 3회 세척하였다. 2차 항체 (PBS 중에서 1:500으로 희석됨)를 암실에서 실온 하에 1시간 동안 적용하였다. 세포를 PBS에서 매회 10분 동안 3회 세척하였다. 핵을 훽스트(Hoechst) 또는 다피(Dapi)로 표지시켰다. FACS 분석을 위하여, 관심 세포를 아쿠타제(Accutase)로 분리시키고, 3% BSA/PBS에 20분 동안 재현탁시켜 비-특이적 결합을 차단시켰다. 이어서, 세포를 얼음 상에서 30분 동안 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 3 ml의 PBS에서 세척하였고, 3% BSA/PBS에서 적당한 2차 항체와 함께 30분 동안 재현탁시켰으며 (1:1,000), 3 ml의 PBS로 세척한 후에 1% BSA/PBS에 재현탁시켰고 프로피디움 아이오다이드 (PI)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 형광에 따라서 분류하였고 [FACSVantageSE DiVa, BD 바이오사이언스 (BD Biosciences; 미국 산호세)], 데이터는 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 다음 항체를 사용하였다: 마우스 모노클로날 CD47 (R&D), 마우스 모노클로날 CD184 [이바이오사이언스(eBioscience)], 마우스 모노클로날 CD44 [노부스(Novus)], 염소 폴리클로날 Foxd3 [산타 크루즈(Santa Cruz)], 토끼 폴리클로날 GFP [인비트로젠(Invitrogen)], 마우스 모노클로날 ITGA4 (R&D), 마우스 모노클로날 네스틴 [케미콘(Chemicon)], 마우스 모노클로날 OCT3/4 (산타 크루즈), 토끼 폴리클로날 P-75 (케미콘), 마우스 모노클로날 SMA (케미콘), 토끼 폴리클로날 Sox2 [압캠(Abcam)], 토끼 폴리클로날 Sox9 [밀리포어(Millipore)], 토끼 폴리클로날 Sox10 (압캠), 마우스 모노클로날 SSEA4 (R&D), 마우스 모노클로날 베르시칸 [세이카가쿠 코포레이션(Seikagaku Corporation)].
Q-PCR: RNeasy 키트를 이용하여 전체 RNA를 추출하였고, 제조업자의 제안에 따라서 퀀티텍 키트(Quantitect kit) [퀴아젠(Qiagen)]를 이용하여 1 μg의 전체 RNA를 역전사시켜 cDNA를 제조하였다. 제조업자의 권고에 따라서 시버그린 마스터 믹스((SyberGreen master mix) (인비트로젠)를 이용하여 Q-PCR을 수행하였다. Q-PCR을 위하여, 18S 발현 수준을 정규화에 사용하였고, 표준 곡선 방법을 이용하여 데이터를 분석하였다. Q-PCR을 다음과 같이 수행하였다: 초기 변성: 95℃에서 10분; 변성 40 주기: 95℃에서 30초, 어닐링: 56℃에서 1분, 연장: 72℃에서 30초; 및 95℃에서 1분 동안 변성, 65℃에서 30초 동안 어닐링 및 95℃에서 30초 동안 최종 변성의 최종 1 주기. 실시간 Q-PCR 프라이머가 다음 표 1에 요약되어 있다.
<표 1>
Figure pct00001
세포: 상이한 계대에서의 ESC-DP 세포를 수득하였다. 세포를 0.1% 트립신-EDTA (깁코 25200)로 단일 세포 현탁액이 되도록 해리시켰고, 순차 원심분리시킴으로써 (1200 RPM으로 5분 동안) PBS로 3회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 100 μl당 5백만 개의 농도로 DP 배지에 재현탁시켰고, 이식될 때까지 얼음 상에 유지시켰다.
마우스 표피 및 진피 세포를 p0-p2 BL6 마우스 피부로부터 수득하였다. 등 피부를 단리하고, 이를 얼음 위에 놓아둔 다음, 5분 동안 5회 진탕시키면서 항생제/항진균제 (최종 1X; 오메가 사이언티픽 AA-40)와 함께 PBS에서 세척하며, 40℃에서 밤새 PBS 중의 0.01% 디스파제(Dispase) (시그마)에서 인큐베이션하였다. 피부의 표피 층을 겸자로 단리하고, PBS에서 5분 동안 세척하며, 37℃에서 8분 동안 0.1% 트립신-EDTA 용액에서 인큐베이션하였다. 피부의 진피 층을 가위로 균질화시키고 37℃에서 45분 동안 0.1% 트립신-EDTA 용액으로 소화시켰다. DP 배지를 부가하여 효소 활성을 차단시켰고 표피 또는 진피를 10분 동안 격렬하게 피펫팅하였다. 세포 여과기 [BD 팔콘(Falcon) 9261365]를 이용하여 세포 현탁물을 단리하고 3회 원심분리시킴으로써 (1200 RPM으로 5분 동안) PBS에서 세척하였다. 세포를 100 μl당 5백만 개의 세포로 DP 배지에 재현탁시켰고, 이식될 때까지 얼음 상에 유지시켰다.
인간 진피 유두 세포: 본 연구에서 인간 조직-유래 샘플을 사용하는 것은 2가지 미용 의료 수술로부터의 피부 폐기물 조직을 사용하는 것으로 제한되었다. 피부를 5분 동안 15회 진탕시키면서 항생제/항진균제 (최종 1X; 오메가 사이언티픽 AA-40)와 함께 PBS에서 세척하였다. 이어서, 모낭을 함유한 지방을 메스로 단리하고 DMEM/F12 중 0.2% 디스파제 (시그마)에서 40℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 겸자를 이용하여 지방으로부터 모낭을 단리하고 DMEM/F12 중 0.1% 콜라게나제 유형 I (시그마)에서 5 내지 7시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, DP를 10분 동안 격렬하게 피펫팅함으로써 나머지 모낭으로부터 분리하였다. 모낭이 바닥에 침강된 후, 상등액에 놓인 DP는 5분 동안 1000 RPM으로 원심분리시킴으로서 단리하였다.
세포 이식: 세포 이식 방법은 기존에 상세히 보고되었다 [27]. 간략하게 설명하면, 관심 세포 (ESC-NC, 초기 ESC-DP, ESC-DP, rDP p2)의 100 μl의 현탁액 (5x105개 세포)을 표피 세포의 100 μl 현탁액 (5x105개 세포)과 합하고, 이를 면역결핍성 마우스 (계통 무흉선 Nu/Nu)에게 피하 주사함으로써 이식하였다. 14 내지 21일 후, 마우스를 안락사시키고 이식체를 분석하였다. 음성 대조군에 대해서는, 표피 세포만을 이식하였다.
참고문헌
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Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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SEQUENCE LISTING <110> Terskikh, Alexey V. <120> METHODS AND COMPOSITIONS TO MODULATE HAIR GROWTH <130> BURNHAM.036WO <150> 62022639 <151> 2014-07-09 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtccctgcc ctttgtacac a 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgatccgagg gcctcacta 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aacccagtgg acatatctgt ggct 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tgttgatgcc aagcaccact ttcc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgtgaagtcg aggcctcatg acaa 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tcttggagac gatggccttg ttga 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ttcaagggct tacacgtgga ggaa 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 aattccttct tgccgcattc ccac 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgagcatgac ttccgttgga ctga 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ccactggcca ttctcatgcc aaat 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agaacctgca ggaggcagaa gaat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ttccatttca cgcatctggc gttc 24

Claims (59)

  1. 유도된 진피 유두 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 모발 성장을 유도시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 P-75, 네스틴, 베르시칸, 평활근 액틴, 알칼리성 포스파타제, 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 유도된 신경 능선 세포의 집단으로부터 생성되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 부착 세포에 관하여 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단이 Sox10, Foxd3, 인테그린 알파 4, 피브로넥틴에 대한 동족 수용체, CD47, CD184, CD44, P-75, 및 네스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함하는 것인 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단에 OCT4, SSEA4, 베르시칸, 평활근 액틴, 및 알칼리성 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 마커가 결여되는 것인 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단이 줄기 세포의 집단으로부터 생성되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 줄기 세포의 클러스터를 형성하기 위한 조건하에 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 클러스터를 현탁액에서 배양하여 구를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 구를 기판의 표면 상에 플레이팅하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 표면은 피브로넥틴 또는 폴리오르니틴으로 코팅되는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 줄기 세포의 집단이 배아 줄기 세포, 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 유도된 만능 줄기 세포가 섬유모세포, 신장 상피 세포, 및 혈액 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 생성되는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 줄기 세포의 집단이 H9 세포, 및 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성된 인간 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 공여자 대상체로부터 수득되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 공여자 대상체와 상기 대상체가 동일한 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 공여자 대상체와 상기 대상체가 상이한 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 피하 이식을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 집단에서, 대상체 피부의 위치에 모발을 포함하는 상기 대상체 피부의 위치에 투여하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 두피, 얼굴, 윗입술, 턱, 눈썹, 속눈썹, 팔, 다리, 등, 몸통, 및 복부로 이루어진 군으로부터 선택된 대상체 피부의 위치에 투여하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 반흔 조직을 포함하는 대상체 피부의 위치에 투여하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 탈모증이 있는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유류인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  25. 유도된 진피 유두 세포의 집단을 시험 작용제와 접촉시키는 단계; 및
    유도된 진피 유두 세포의 집단에서 모발 성장에 대한 효과를 측정하는 단계
    를 포함하는, 모발 성장을 조정하는 작용제를 스크리닝하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 효과가 시험 작용제와 접촉되지 않은 유도된 진피 유두 세포의 집단과 비교해서, 유도된 진피 유두 세포의 집단 내에서의 모발 성장 속도가 증가되는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 효과가 시험 작용제와 접촉되지 않은 유도된 진피 유두 세포의 집단과 비교해서, 유도된 진피 유두 세포의 집단 내에서의 모발 성장 속도가 감소되는 것을 포함하는 것인 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효과가 두피, 얼굴, 윗입술, 턱, 눈썹, 속눈썹, 팔, 다리, 등, 몸통, 및 복부로 이루어진 군으로부터 선택된 대상체 피부의 특정 위치에 특징적인 모발의 성장을 포함하는 것인 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유류인 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 생체 내에서 시험 작용제와 접촉되는 것인 방법.
  32. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 시험관 내에서 시험 작용제와 접촉되는 것인 방법.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 P-75, 네스틴, 베르시칸, 평활근 액틴, 알칼리성 포스파타제, 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함하는 것인 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 유도된 신경 능선 세포의 집단으로부터 생성되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 부착 세포에 관하여 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단이 Sox10, Foxd3, 인테그린 알파 4, 피브로넥틴에 대한 동족 수용체, CD47, CD184, CD44, P-75, 및 네스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함하는 것인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단에 OCT4, SSEA4, 베르시칸, 평활근 액틴, 및 알칼리성 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 마커가 결여되는 것인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단이 줄기 세포의 집단으로부터 생성되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 줄기 세포의 클러스터를 형성하기 위한 조건하에 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 클러스터를 현탁액에서 배양하여 구를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 구를 기판의 표면 상에 플레이팅하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 표면은 피브로넥틴 또는 폴리오르니틴으로 코팅되는 것인 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포의 집단이 배아 줄기 세포, 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 유도된 만능 줄기 세포가 섬유모세포, 신장 상피 세포, 및 혈액 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 생성되는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 줄기 세포의 집단이 H9 세포, 및 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성된 인간 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 것인 방법.
  45. 유도된 신경 능선 세포의 집단으로부터 유도된 진피 유두 세포의 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 상기 유도된 진피 유두 세포의 집단을 제조하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 부착 세포에 관하여 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 P-75, 네스틴, 베르시칸, 평활근 액틴, 알칼리성 포스파타제, 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함하는 것인 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단이 Sox10, Foxd3, 인테그린 알파 4, 피브로넥틴에 대한 동족 수용체, CD47, CD184, CD44, P-75, 및 네스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함하는 것인 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단에 OCT4, SSEA4, 베르시칸, 평활근 액틴, 및 알칼리성 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 마커가 결여되는 것인 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 신경 능선 세포의 집단이 줄기 세포의 집단으로부터 생성되는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 줄기 세포의 클러스터를 형성하기 위한 조건하에 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 클러스터를 현탁액에서 배양하여 구를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 구를 기판의 표면 상에 플레이팅하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 표면은 피브로넥틴 또는 폴리오르니틴으로 코팅되는 것인 방법.
  54. 제50항에 있어서, 줄기 세포의 집단이 배아 줄기 세포, 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 유도된 만능 줄기 세포가 섬유모세포, 신장 상피 세포, 및 혈액 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 생성되는 것인 방법.
  56. 제50항에 있어서, 줄기 세포의 집단이 H9 세포, 및 인간 BJ 섬유모세포로부터 생성된 인간 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 것인 방법.
  57. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 유도된 진피 유두 세포의 집단.
  58. 대상체에서 모발 성장을 유도하기 위한, 유도된 진피 유두 세포의 집단의 용도.
  59. 제58항에 있어서, 유도된 진피 유두 세포의 집단이 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것인 용도.
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