CN106661547A - 调控毛发生长的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文中提供的方法和组合物的实施方案涉及在受试者中诱导毛发生长。一些实施方案包括筛选调控毛发生长的药剂。

Description

调控毛发生长的方法和组合物
对相关申请的交叉援引
本申请要求2014年7月9日提交的题为“DERIVATION OF HAIR GROWTH INDUCINGCELLS FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS AND USES THEREOF”的美国临时申请No.62/022,639的权益，通过援引将其完整收录。
对序列表的援引
本申请是连同电子格式的序列表一起提交的。序列表是作为题为BURNHAM036WO_SEQLIST，2015年6月30日创建，大小近似1.9Kb的文件提供的。通过援引将电子格式的序列表中的信息完整收入本文。
发明领域
本文中提供的方法和组合物的实施方案涉及在受试者中诱导毛发生长。一些实施方案包括筛选调控毛发生长的药剂。
发明背景
已经提出在胚胎发生中通过表皮和下面的中胚层之间的相互作用形成毛囊[1,2,3,4]。首先响应表皮基板形成在真皮中作为细胞缩合物(cell condensate)产生真皮乳头(DP)。随着毛囊发育前进，基板中的表皮细胞积极增殖并包围现在称作真皮乳头的真皮缩合物，将它们与周围的真皮分开[5]。暴露于这些新的小生境条件，DP细胞获得BMP-4，它的抑制剂成头蛋白，和表面标志物N-CAM和p-75的表达。另外，它们分泌特定的胞外基质蛋白(例如versican(VCAN))且显示高水平的碱性磷酸酶(AP)活性[6]。使用双重报告Lef1-RFP/K14-H2BGFP小鼠进行的研究已经鉴定前瞻性分离的小鼠DP细胞的详细遗传签名[7]并鉴定Wnt，BMP和FGF信号传导途径是鼠DP维持和功能所需要的[8,9,10]。DP细胞在毛发生长和循环中发挥作用[6]且决定毛发尺寸和毛发类型[11,12]。早就认识到DP细胞不仅在胚胎发生中而且在出生后能够诱导毛囊形成。髭DP细胞在移植入成年大鼠的足垫(正常情况下不长毛发的皮肤区域)时诱导重新毛发形成[13]。自头皮分离的人DP细胞在移植入啮齿动物时有助于毛发形成[14,15]且在培养物中诱导角质形成细胞形态发生[16]。
已经提议DP细胞作为毛发减少疾病的基于细胞的治疗。然而，人DP细胞不适合于这一目的，因为它们无法以必需量获得且在培养时迅速失去它们诱导毛囊形成的能力[7,8,17,18]。因此，开发能够诱导强健毛发生长的功能性DP细胞存在未满足的需求。
发明概述
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括一种用于在受试者中诱导毛发生长的方法，其包括对该受试者施用一群诱导的真皮乳头细胞。一些实施方案还包括获得该群诱导的真皮乳头细胞。在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞包含选自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌动蛋白，碱性磷酸酶，和波形蛋白组成的组的标志物。
在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞是自一群诱导的神经嵴细胞生成的。一些实施方案还包括选择粘附细胞。在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞包含选自由Sox10，Foxd3，整联蛋白α4，纤连蛋白的关联受体，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白组成的组的标志物。在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞缺乏选自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌动蛋白，和碱性磷酸酶组成的组的标志物。
在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞是自一群干细胞生成的。一些实施方案还包括在条件下培养该群干细胞以形成该干细胞的簇。一些实施方案还包括悬浮培养该簇以形成球体。一些实施方案还包括在基质的表面上涂布该球体，其中该表面是用纤连蛋白或聚鸟氨酸包被的。
在一些实施方案中，该群干细胞包含选自由胚胎干细胞和诱导的多能干细胞组成的组的细胞。在一些实施方案中，该诱导的多能干细胞是自选自由成纤维细胞，肾上皮细胞，和血细胞组成的组的来源生成的。在一些实施方案中，该群干细胞包含选自由H9细胞和自人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞是自供体受试者获得的。在一些实施方案中，该供体受试者和该受试者是相同的。在一些实施方案中，该供体受试者和该受试者是不同的。
在一些实施方案中，该施用包含皮下移植。在一些实施方案中，该施用是对该受试者皮肤的如下部位，在一群受试者中的该部位处包含毛发。在一些实施方案中，该施用是对该受试者的皮肤选自由头皮，面部，上唇，颏部，眉部，睑部，臂部，腿部，背部，躯干，和腹部组成的组的部位。在一些实施方案中，该施用是对该受试者的皮肤包括瘢痕组织的部位。
在一些实施方案中，该受试者具有脱发。
在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，该受试者是人。
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括一种用于筛选调控毛发生长的药剂的方法，其包括使一群诱导的真皮乳头细胞接触测试药剂；并测量对该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的影响。
在一些实施方案中，该影响包括该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的速率与不接触该测试药剂的一群诱导的真皮乳头细胞相比升高。
在一些实施方案中，该影响包括该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的速率与不接触该测试药剂的一群诱导的真皮乳头细胞相比降低。
在一些实施方案中，该影响包括受试者的皮肤选自由头皮，面部，上唇，颏部，眉部，睑部，臂部，腿部，背部，躯干，和腹部组成的组的特定部位特征性的毛发的生长。
在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，该受试者是人。
在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞在体内接触该测试药剂。在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞在体外接触该测试药剂。
在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞包含选自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌动蛋白，碱性磷酸酶，和波形蛋白组成的组的标志物。
在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞是自一群诱导的神经嵴细胞生成的。一些实施方案还包括选择粘附细胞。在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞包含选自由Sox10，Foxd3，整联蛋白α4，纤连蛋白的关联受体，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白组成的组的标志物。在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞缺乏选自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌动蛋白，和碱性磷酸酶组成的组的标志物。
在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞是自一群干细胞生成的。一些实施方案还包括在条件下培养该群干细胞以形成该干细胞的簇。一些实施方案还包括悬浮培养该簇以形成球体。一些实施方案还包括在基质的表面上涂布该球体，其中该表面是用纤连蛋白或聚鸟氨酸包被的。
在一些实施方案中，该群干细胞包含选自由胚胎干细胞和诱导的多能干细胞组成的组的细胞。在一些实施方案中，该诱导的多能干细胞是自选自由成纤维细胞，肾上皮细胞，和血细胞组成的组的来源生成的。在一些实施方案中，该群干细胞包含选自由H9细胞和自人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括一种用于制备一群诱导的真皮乳头细胞的方法，其包括：自一群诱导的神经嵴细胞生成该群。一些实施方案还包括选择粘附细胞。在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞包含选自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌动蛋白，碱性磷酸酶，和波形蛋白组成的组的标志物。在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞包含选自由Sox10，Foxd3，整联蛋白α4，纤连蛋白的关联受体，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白组成的组的标志物。在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞缺乏选自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌动蛋白，和碱性磷酸酶组成的组的标志物。
在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞是自一群干细胞生成的。一些实施方案还包括在条件下培养该群干细胞以形成该干细胞的簇。一些实施方案还包括悬浮培养该簇以形成球体。一些实施方案还包括在基质的表面上涂布该球体，其中该表面是用纤连蛋白或聚鸟氨酸包被的。
在一些实施方案中，该群干细胞包含选自由胚胎干细胞和诱导的多能干细胞组成的组的细胞。在一些实施方案中，该诱导的多能干细胞是自选自由成纤维细胞，肾上皮细胞，和血细胞组成的组的来源生成的。在一些实施方案中，该群干细胞包含选自由H9细胞和自人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括通过任一前述方法制备的一群诱导的真皮乳头细胞。
附图简述
图1A-1E描绘hESC经NC中间物分化成DP样细胞。图1A是分化策略的示意图。图1B是两张显微照片，描绘hESC-NC培养物中迁移NC标志物Sox 10和Foxd 3的表达。免疫荧光染色，DAPI为蓝色。图1C是一系列三张图，描绘hESC-NC培养物中NC标志物整联蛋白α-4(ITGA4)和hESC标志物OCT4和SSEA4的流式细胞术分析。图1D是一系列显微照片，描绘hESC-NC，hDP(来自正常皮肤)和hESC-DP培养物中p-75，巢蛋白，Versican，SMA和碱性磷酸酶(AP)的表达。免疫荧光染色，DAPI为蓝色。图1E是一系列图，描绘DP样式形成期间hESC-DP培养物中hDP标志物p-75，微管连接蛋白-1，Versican，SMA和波形蛋白的Q-PCR分析。第0天＝hESC-NC细胞。基因表达的水平(作为相对于hESC-NC水平的倍数变化的对数显示)相对于18S标准化。对于每一种基因，虚线代表hDP细胞培养物中的基因表达水平。比例尺100μm。
图2A-2C描绘裸小鼠中皮下细胞移植的影响。图2A是一系列显微照片，显示单独或与小鼠新生真皮细胞(mDC)，hDP，hESC-DP，在血清中分化14天的hESC(hESC-血清)，人hESC衍生的神经嵴细胞(hESC-NC)和7天分化成DP的hESC-NC(hESC-DP 7天)组合移植的角质形成细胞的全封固物的立体图像。图2B是一张图，描绘由单独或与mDC，hDP或hESC-DP组合移植的角质形成细胞诱导的毛发的量化。图2C是一张图，描绘ESC-DP细胞的毛发诱导能力随自hESC-NC(第0天)分化的时间的动力学，作为每个移植(趋势以红色线显现)或在血清存在下分化的hESC(蓝色菱形)形成的毛发的数目显示，与单独的角质形成细胞(以虚线显现)比较。所有数据以均值±SEM呈现并用单因素ANOVA(Kruskal-Wallis检验，Dunn氏多重比较事后检验)分析。*，P≤0.05；**，P≤0,001。比例尺1mm。
图3A-3F以一系列显微照片描绘GFP标记的hESC-DP和hIPSC-DP的皮下移植。图3A显示全封固移植物的立体镜观察在新形成的毛发中的DP(箭头)和真皮囊(箭)的位置中鉴定出GFP阳性hESC-DP细胞；插图显示DP区的2倍放大图。图3B描绘在毛发的DP和真皮囊中能找到GFP标记的hIPSC-DP：全封固移植物(GFP/明视野)和8μm切片(明视野)。插图，毛囊的DP区域中的GFP阳性细胞的荧光图像(明视野图像中DP区域的白色正方形的2倍放大图)。图3C和3D分别描绘新形成的毛发的GFP阳性DP(GFP/明视野，共焦显微术)对Versican(Versican，共焦显微术)和碱性磷酸酶(AP，明视野)呈阳性。图3E显示在外根鞘区域(箭)以及GFP阳性DP(轮廓)中检测到很少(～1％的新形成的毛发)NC衍生的GFP阳性细胞，共焦图像在GFP小图中。图3F描绘在移植物中的毛发基质中找到NC衍生的GFP阳性细胞(共焦显微术)。插图显示GFP阳性细胞的2倍放大图；GFP为白色。注意遍及GFP阳性细胞存在的多个黑色素颗粒(黑色)。图3A的比例尺250μm；图3B-3F的比例尺50μm。
图4A-4B描绘BMP信号传导在DP细胞命运获取中的作用。图4A显示多张显微照片，描绘在选择性BMP抑制剂dorsomorphin缺失或存在下衍生的hESC-DP细胞的形态和移植结局。细胞培养物的比例尺50μm，细胞移植的比例尺0.5mm。图4B是一张图，描绘在选择性BMP抑制剂dorsomorphin缺失或存在下hESC-DP细胞中Versican，Corin，微管连接蛋白-1，p-75，波形蛋白和SMA表达的Q-PCR分析。所有数据以均值±SEM呈现并用Student氏t检验分析。*，P≤0.05；**，P≤0,001。
图5是一系列图，以hESC-NC培养物中间充质标志物(CD47，CD184，CD44)表达的流式细胞术分析描绘hESC-NC中间充质标志物的表达。
图6是一系列显微照片，描绘原位人毛囊DP细胞中DP标志物的表达。SMA，碱性磷酸酶(AP)，巢蛋白和Versican冷冻切片的免疫荧光染色；DAPI为蓝色。比例尺100μm。
图7是一系列显微照片，描绘人DP细胞在裸小鼠皮肤下的移植，其中GFP阳性hDP细胞能在真皮中找到但没有将新形成的毛发掺入DP区域；全封固移植物(插图显示DP区域的2倍放大图)。比例尺250μm。
图8A-8C描绘hIPSC经NC中间物分化成DP样细胞。图8A是一系列显微照片，描绘hIPSC-NC培养物中神经上皮标志物Sox 2，Sox 9和巢蛋白的表达。免疫荧光染色，DAPI为蓝色。图8B是一系列显微照片，描绘人IPSC-DP细胞培养物中DP标志物平滑肌肌动蛋白(SMA)，P-75和巢蛋白的表达。免疫荧光染色，DAPI为蓝色。图8C是一幅图，描绘Versican，微管连接蛋白-1，p-75，波形蛋白和SMA的表达的Q-PCR分析。基因表达的水平相对于18S标准化并作为相对于hESC-NC表达水平的对数倍数变化显示。比例尺100μm。
发明详述
本文中提供的方法和组合物的实施方案涉及在受试者中诱导毛发生长。在一些实施方案中，一群诱导的真皮乳头细胞可以自一群诱导的神经嵴细胞生成，后者继而可以自一群干细胞生成。该群诱导的真皮乳头细胞可以皮下移植入受试者，并生成毛发。有利的是，可以扩增每群细胞以提供一大群诱导的真皮乳头细胞可供使用，诸如用于移植。该诱导的真皮乳头细胞可用于治疗具有皮肤病症，诸如烧伤，瘢痕，和毛发减少的受试者。其它实施方案包括筛选调控毛发生长的药剂。可以使测试药剂接触一群诱导的真皮乳头细胞并测量影响。可以测试药剂是否产生涉及毛发生长速率，终毛或毫毛形成，毛干颜色，毛干粗度，和毛干中的二硫键水平的影响。
真皮乳头(DP)是独特的一群间充质细胞，它们调节毛囊形成和生长周期。在发育期间，大多数DP细胞衍生自中胚层，然而，头发的功能等同DP细胞源自神经嵴(NC)。NC是细胞群体，它瞬时源自发育中背神经管且产生多种组织，包括周围神经系统，肾上腺髓质，黑色素细胞和多种颅面间充质组织[19]。使用Lox-STOP-Rosa26或Z/EG报告小鼠进行的NC特异性(Wnt1-Cre)谱系示踪提供了NC对一大群头部DP细胞的贡献的遗传证据[20,21,22]。
申请人已经开发了方法和组合物，包括自人胚胎干细胞(hESC)衍生功能性DP样细胞。参见Gnedeva K.,et al.,“Derivation of Hair-Inducing Cell from HumanPluripotent Stem Cells”(2015)Derivation ofHair-Inducing Cell from HumanPluripotent Stem Cells.PLoS ONE 10(1):e0116892.doi:10.1371/journal.pone.0116892，通过援引将其完整收入本文。在一些实施方案中，hESC可用于生成NC细胞，然后是培养中毛发诱导性DP样细胞。hESC衍生的DP样细胞(hESC-DP)表达通常在成人DP细胞中找到的标志物(例如p-75，巢蛋白，versican，SMA，碱性磷酸酶)且在免疫缺陷性NUDE小鼠的皮肤下移植时能够诱导毛囊形成。改造成表达GFP的hESC衍生的DP样细胞将新形成的毛囊掺入DP且表达适宜的标志物。BMP信号传导是hESC-DP衍生中的一个因素，因为BMP抑制剂dorsomorphin自hESC-DP培养物消除毛发诱导活性。
用于诱导毛发生长的方法
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括用于在受试者中诱导毛发生长的方法。在一些此类实施方案中，对该受试者施用一群诱导的真皮乳头细胞。施用方法可包括将诱导的真皮乳头细胞移植入该受试者的皮肤，例如施用可包括皮下移植诱导的真皮乳头细胞。该诱导的真皮乳头细胞可施用于受试者的皮肤的任何部位，例如，该受试者的皮肤的部位诸如头皮，面部，上唇，颏部，眉部，睑部，臂部，腿部，背部，躯干，手部，足部，和腹部。在一些实施方案中，该受试者的皮肤的部位包含瘢痕组织。在一些实施方案中，该受试者具有脱发。在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物，诸如人。
在一些实施方案中，一群诱导的真皮乳头细胞可以包括自其它细胞类型(诸如分离的诱导的神经嵴细胞)生成的具有真皮乳头细胞的特征的分离的一群细胞。在一些实施方案中，诱导的真皮乳头细胞的特征可以包括与真皮乳头细胞有关的标志物，诸如蛋白质，表达的核酸，诱导毛囊形成的活性，诱导角质形成细胞形态发生的活性，和诱导毛干生长的活性。标志物的例子包括BMP-4，成头蛋白，N-CAM，和p-75，胞外基质蛋白诸如versican(VCAN)，碱性磷酸酶(AP)，巢蛋白，平滑肌肌动蛋白，和波形蛋白。
在一些实施方案中，可以自诱导的神经嵴细胞生成诱导的真皮乳头细胞。在一些实施方案中，自一群诱导的神经嵴细胞选择粘附细胞以生成分离的一群诱导的真皮乳头细胞。例如，可以将该群诱导的神经嵴细胞涂布在基质上，可以容许粘附细胞附着至该基质，并且可以自该基质洗去非粘附细胞。在一些实施方案中，该基质是塑胶的(plastic)。
在一些实施方案中，诱导的神经嵴细胞的特征可以包括与神经嵴细胞有关的标志物，诸如蛋白质，表达的核酸，能够生成诸如黑色素细胞，颅面软骨和骨，平滑肌，周围和肠神经元和神经胶质等细胞的活性。标志物的例子包括Sox10，Foxd3，整联蛋白α4，纤连蛋白的关联受体，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白。在一些实施方案中，该群诱导的神经嵴细胞缺乏选自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌动蛋白，和碱性磷酸酶组成的组的标志物。
在一些实施方案中，可以自一群干细胞生成诱导的神经嵴细胞。自干细胞生成诱导的神经嵴细胞的方法的例子记载于Bajpai R.,et al.Cell Death andDifferentiation(2009)16,807-825；和Curchoe CL,et al.(2010)Early acquisition ofneural crest competence during hESCs neuralization.PLoS One 5:e13890，通过援引完整收录其每一篇。在一些实施方案中，在条件下培养一群干细胞以形成该干细胞的簇。在一些实施方案中，悬浮培养该簇以形成球体。在一些实施方案中，在基质的表面上涂布该球体。在一些实施方案中，该表面是用纤连蛋白或聚鸟氨酸包被的。
在一些实施方案中，该干细胞包括胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。可以自多种来源生成诱导的多能干细胞，诸如成纤维细胞，肾上皮细胞，和血细胞。生成诱导的多能干细胞方法的例子包括Takahashi,K.and Yamanaka,S(2006)Cell 126(4):663-76；Zhou H,et al.(2009)Cell Stem Cell 4(5):381-4；Zhou,et al.,(2012)Nature Protocols 7(12):2080-2089；和Moad,M.,et al.(2013)European Urology 64(5):753-761中记载的那些，通过援引完整收录其每一篇。在一些实施方案中，该群干细胞包含诸如H9细胞或自人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞等细胞。在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞是自供体受试者获得的。例如，可以自供体受试者取得细胞样品并自该细胞样品生成一群诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，该供体受试者和该受试者是相同的。在一些实施方案中，该供体受试者和该受试者是不同的。
用于筛选调控毛发生长的药剂的方法
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括用于筛选调控毛发生长的药剂的方法。一些此类实施方案包括使一群诱导的真皮乳头细胞接触测试药剂；并测量对该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的影响。在一些实施方案中，药剂可以包括化合物，包含数种化合物的组合物，和物理条件，诸如温度和pH。
在一些实施方案中，该影响可以包括该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的速率与不接触该测试药剂的一群诱导的真皮乳头细胞相比的变化，诸如该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长速率升高或降低。毛发生长速率可以通过毛干的形成速率或具有活性形成毛干的毛囊的形成速率来测量。
在一些实施方案中，该影响可以包括受试者的皮肤选自由头皮，面部，上唇，颏部，眉部，睑部，臂部，腿部，背部，躯干，和腹部组成的组的特定部位特征性的毛发的生长。受试者的皮肤的特定部位的毛发的特征的例子可以包括毛干的粗度(thickness)，长度，强度，和毛发周期的长度。在一些实施方案中，该影响可以包括毛发诸如终毛或毫毛的生长。在一些实施方案中，该影响可以包括毛干的颜色，诸如棕色，黑色，红色，白色，灰色，和金色。在一些实施方案中，该影响可以包括毛干的卷曲程度。在一些实施方案中，该影响可以包括毛干的粗度。在一些实施方案中，该影响可以包括毛干中二硫键的水平。
在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞在体内接触该测试药剂。例如，可以将该诱导的真皮乳头细胞移植入受试者的皮肤。在一些实施方案中，该群诱导的真皮乳头细胞在体外接触该测试药剂。
实施例
使用NC细胞中间体衍生hESC-DP
自hESC经NC中间体获得人DP样细胞(图1A)。如先前所述诱导hESC分化成hESC衍生的神经嵴细胞(hESC-NC)[24,25]。hESC-NC培养物显示强健的神经嵴标志物Sox10和Foxd3表达(图1B)。流式细胞术分析确认了接近80％培养的hESC-NC细胞表达NC标志物整联蛋白α4(ITGA4)，纤连蛋白的关联受体[26]，且缺乏OCT4和SSEA4表达，提示未分化hESC的缺失(图1C)。
神经嵴是多效的一群细胞，它们产生多种间充质组织的前体[19]。FACS分析显示hESC-NC细胞在分化14天时表达间充质干细胞标志物CD47(99.95％)，CD184(20％)，和CD44(52.58％)(图5)。为了生成DP样细胞，在含有10％FBS的DMEM-F12培养基中进一步诱导hESC-NC分化另外两周(图1A)。DP细胞是体真皮干细胞[27]且表达间充质干细胞(MSC)标志物[28]。因此，利用对组织培养塑胶的优先粘附自分化中的hESC-NC培养物富集间充质细胞[29]。例行地，约20％hESC-NC培养物粘附至塑胶并在含有血清的培养基中传代，产生hESC衍生的DP样细胞(hESC-DP)。这些结果提示hESC衍生的NC细胞含有间充质祖细胞群，可以利用分离方案和培养条件富集MSC和DP细胞。
hESC-DP细胞的表征
已经汇编小鼠背部皮肤DP细胞的签名基因[7]，然而，关于人头部真皮乳头细胞中的基因表达知道的很少。利用小鼠和人DP细胞二者的标志物来表征间充质hESC-DP。在hESC-NC细胞，培养的人DP细胞(hDP)(自正常人皮肤分离)和hESC-DP细胞中检测到DP和神经嵴共同的标志物，P-75和巢蛋白(图1D)[21]。在hESC-NC细胞中没有检测到其它人DP标志物：Versican，平滑肌肌动蛋白(SMA)和碱性磷酸酶(AP)，但是它们存在于hDP和hESC-DP培养物中(图1D)。使用人头皮皮肤切片确认了hDP中巢蛋白，Versican，SMA和AP染色的特异性(图6)。hESC-NC中NC标志物P-75(～30％)和巢蛋白(～90％)的表达与hESC-DP培养物中的表达(p-75为～40％，巢蛋白为～90％)相似且显示与hDP细胞中的表达(P-75为～20％，巢蛋白为～90％)接近的样式。构成对比，hESC-NC细胞呈Versican(<1％)，SMA(<3％)阴性且完全缺乏AP活性，而大多数hESC-DP表达Versican(～70％)，SMA(～70％)且显示高水平的AP活性，与在人DP细胞中找到的相似，人DP细胞对Versican，SMA和AP呈接近100％阳性。总体细胞形态和标志物的亚细胞定位在hESC-DP和人DP细胞培养物之间是相似的。为了定量评估DP标志物在hESC-NC分化成hESC-DP期间的表达动力学，使用Q-PCR分析。所有测试的人DP标志物(p-75，微管连接蛋白-1，Versican，SMA，和波形蛋白)的表达水平在hESC-NC分化期间逐渐升高，而且在两周后与在人DP细胞培养物中找到的相当或更高(图1E)。总之，这些结果提示hESC-DP培养物内人DP样细胞的存在。
移植后hESC-DP的毛发诱导特性
调查hESC-DP细胞是否胜任在无胸腺nu/nu(裸)小鼠中在移植后诱导毛囊形成。使用先前用于证明小鼠皮肤衍生真皮前体的毛发诱导潜力的细胞移植补片(patch)法[27]。简言之，组合感兴趣细胞与自新生动物分离的小鼠表皮细胞(角质形成细胞)并作为浓稠细胞悬浮液皮下移植入裸小鼠。因为裸小鼠具有BALB/c(白化)遗传背景，所以新形成的和预先存在的毛发是通过使用来自深色毛发的C57BL/6小鼠的表皮细胞进行移植可区分的。作为每个移植物形成的毛发数目测量毛发诱导能力。补片法不容许新形成的毛发进入皮肤表面，这在形态发生的晚期阶段扰乱毛囊形态。因此，在移植后14天(此时毛囊形成，但是尚未发育完全)进行分析。单独移植表皮细胞导致最小限度的毛发诱导，有可能是由于内源DP细胞的存在(图2A，2B)。用作阳性对照的小鼠真皮细胞(mDC)诱导强健的毛发生长(P＝0.0282)，效率与先前对相同移植模型报告的相似[27](图2A，2B)。如预期的，与阴性对照(单独的角质形成细胞)相比，自成年头皮分离的培养的人DP细胞不诱导显著数目的毛发(图2A，2B)。确实，已经显示人DP细胞有助于单一毛发的转物种再形成[14]，但是尚未报告人DP细胞在小鼠模型中强健的毛发诱导能力[18]。构成对比，观察到hESC-DP的显著的(P＝0.0002)毛发诱导，与mDC的相似(图2A，2B)。
为了监测hESC朝向DP样细胞分化期间毛发诱导特性的动力学，移植hESC-DP和数种相关细胞群，即，使hESC在DP培养基中分化两周，跳过NC诱导(hESC)，hESC-NC和部分分化的hESC-DP的中间步骤(分化7天)(图2C)。令人惊讶的是，移植在血清条件中分化的hESC以及hESC-NC导致与阴性对照相比对毛发生长的显著抑制(图2C)。因此，hESC-NC分化成hESC-DP细胞导致毛发诱导能力升高接近100倍(图2C)。部分分化的hESC-NC移植物中形成的毛发的数目与阴性对照相比没有显著差异(图2C)。
这些结果提示本文中描述的hESC-DP细胞具有强健的毛发诱导能力，与新生小鼠真皮细胞的相似的，而且hESC-NC顺着分化规程获得这种能力。
hESC-DP将重新形成的毛囊掺入DP
移植的hESC-DP可能募集/活化内源小鼠DP细胞，或直接介导观察到的毛囊形成的诱导。为了解决这个问题，改造hESC-DP以表达GFP并分析原位新形成的毛囊(图3)。使用补片法在裸鼠的皮肤下移植后14天观察到重新毛发形成，其可以通过毛干的黑色色素沉着来确定。hESC-DP移植物的立体镜观察提示新形成的毛发的大多数DP和真皮囊是由GFP阳性细胞构成的(图3A)。自hESC-DP移植物分离的全封固毛发的共焦显微镜检查显示新诱导的毛发内GFP阳性DP细胞的存在(图3C，3D，3E)。这些毛发的GFP阳性DP对特定标志物(即Versican(图3C)和AP(图3D))的染色呈阳性。在GFP阳性DP以外，还观察到外和内根鞘区域中GFP阳性细胞的存在(图3E)。还观察到毛发基质中的GFP阳性细胞的胞质中黑色素颗粒的存在(图3F)。这些数据提示所移植的hESC-DP能获得DP细胞的毛发诱导功能。
hIPSC-DP的衍生和表征
在人ESC的H9系以外，还使用三种先前表征的自正常人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞(hIPSC)系[30]。遵循先前描述的方案生成hIPSC-NC细胞并分析神经上皮标志物Sox2，Sox9和巢蛋白的存在。自所有三种系获得的hIPSC-NC显示相似的表达样式。只有约50％的hIPSC-NC细胞表达Sox2和Sox9，另外，巢蛋白染色揭示与hESC-NC细胞相比时的形态学差异(图8A，图1D)。
使用上文所述方案使hIPSC-NC细胞分化以获得hIPSC-DP。DP标志物SMA，p-75和巢蛋白的免疫染色以及Versican，微管连接蛋白-1，p-75，波形蛋白和SMA的Q-PCR分析显示只有一种hIPSC系(BJ16)在与hESC-DP细胞相比时产生具有一些DP标志物表达的细胞(图8B)。图8C显示hIPSC-DP中相对于hESC-NC细胞的基因表达水平。
通过补片移植进一步表征BJ16 IPSC-DP细胞。这种细胞群与阴性对照相比时不诱导显著数目的毛发。然而，移植GFP阳性BJ16 IPSC-DP细胞导致形成毛发及GFP阳性真皮乳头和真皮囊，虽然频率比hESC-DP细胞的情况低得多(50个中1根毛发)。在切片中确认了这些毛发的DP内GFP阳性细胞的存在(图3B)。
值得注意的是，只在hESC-DP和hIPSC-DP细胞情况中观察到所移植的细胞整合入新形成的毛发的乳头和囊区域。虽然所移植的改造成表达GFP的人DP细胞存在于真皮中，但是这些细胞在邻近毛囊的DP中没有找到(图7)。这些结果提示虽然人多能细胞衍生的DP样细胞与自成人皮肤分离的DP细胞分享一些特定标志物的表达，但是它们的毛发诱导能力更高且能应用于毛发减少疾病的基于细胞的治疗。
BMP信号传导在hESC-DP衍生中的作用
不知道发育期间自迁移NC生成DP所涉及的机制。然而，知道用于自NC细胞诱导DP分化的胎牛血清含有骨形态发生蛋白(BMP)[31]，它们是胚胎发育期间的中胚层规范[32,33]和在体外自hESC诱导中胚层[34]所必需的。发现BMP信号传导是小鼠背部皮肤DP中维持毛囊诱导潜力的一种机制[9]。使用充分研究的选择性BMP抑制剂dorsomorphin调查BMP信号传导是否在自hESC-NC细胞衍生hESC-DP细胞中发挥作用[35]。与阳性对照相比，NC至DP转变期间添加dorsomorphin导致细胞形态的明显变化，特别是，hESC-DP细胞具有特征性的成纤维细胞样伸长的形态，而用dorsomorphin处理的细胞是六边形的且展现它们胞质中多个颗粒的存在(图4A)。而且，在裸小鼠皮肤下移植的用dorsomorphin处理的细胞不能诱导毛发形成，提示DP特性的丧失(图4A)。用dorsomorphin处理的细胞的Q-PCR分析揭示抑制BMP信号传导导致编码DP特异性标志物Versican(P＝0.0002)，Corin(P＝0.0022)，微管连接蛋白-1(P＝0.0008)和波形蛋白(P＝0.0001)的mRNA的水平显著降低，但是泛NC标志物p-75(无变化)或平滑肌标志物SMA(显著升高)不然(图4B)。然而，使用BMP作为唯一分化剂不能自hESC-NC培养物衍生DP细胞，提示头部DP细胞命运获取涉及其它信号传导途径。这些结果指示BMP信号传导对于自hESC-NC细胞生成和/或维持毛发诱导性hESC-DP是必要但非充分的。
结果提示在含有血清的培养基中培养的hESC衍生的NC细胞逐渐获得人DP细胞的标志物且产生具有毛发诱导潜力的粘附细胞群。hESC-DP与人DP细胞相比强健的毛发诱导能力可能反映前者与胚胎或新生真皮乳头前体细胞群(已知它们经由不同机制诱导毛囊形成)一个主要类似之处[36]。
hESC-DP培养物很可能是异质的。这些培养物显示的平均毛发诱导能力与新生小鼠真皮细胞的相似。前瞻性纯化的原代小鼠DP细胞显示出在毛发诱导方面比小鼠真皮制备物效率高约5倍[27]。因此，有可能的是hESC-DP培养物包含毛发诱导性DP样细胞的一个子群，其具有甚至比上文报告的平均值更高的毛发诱导能力。另外，在移植GFP阳性hESC-DP时，观察到毛囊的其它隔室(即外根鞘，内根鞘和毛发基质)中GFP阳性细胞的存在。因为已知在发育期间黑色素细胞源自迁移NC，所以很可能的是在hESC-DP培养物内一些hESC-NC细胞产生黑色素细胞前体。类似地，有可能的是一些hESC-NC能够产生新形成的毛发的角质形成细胞，因为在须的凸起中啮齿动物NC细胞能产生表皮干细胞[37]。这些数据提示hESC-DP是NC衍生细胞的混合群，其含有具有毛发诱导特性的DP样细胞，而且还可能含有形成黑色素细胞和角质形成细胞的细胞。
结果提示hESC分化成NC谱系的中间步骤看来是至关重要的，跳过NC诱导导致完全丧失毛发诱导活性。将hESC引导至NC细胞可能将间充质细胞类型的种类限制至皮肤中在发育上规定在NC细胞下游的子集(例如发育期间的头部DP，黑色素细胞，头部凸起)。因此，使用相对常见的间充质富集条件诸如含有血清的培养基中的分化和选择粘附细胞类型，hESC-DP样细胞变成突出富集毛发诱导性DP样细胞。
不同iPSC系可具有可变的倾向朝向DP样细胞分化。hiPSC-DP细胞在使用补片法移植时不能诱导毛囊形成且具有低频率的新形成的毛囊掺入DP。这可能是已知影响IPSC分化的表观遗传记忆现象的结果[38,39,40]。用于这项实验的IPSC系衍生自BJ成纤维细胞[30]。它们的中胚层起源可引起分化第一步(即诱导外胚层神经嵴细胞)困难。确实，只有一些hIPSC-NC细胞表达神经上皮标志物Sox2和Sox9(图8A，8B)。然而，多种hiPCS和hESC系的全局比较提示，在比较充分大数目的hiPSC系与hESC系时，观察到它们的分化潜力的主要交叠[41]。因此，虽然绝对效率可以在不同hESC和hiPSC系之间变化，但是应当有可能自多种hiPSC衍生具有毛发诱导特性的细胞[42]。
最近，显示SKP在毛发诱导方面是高度有力的[27]，但是衰老过程中SKP的逐渐丧失可能妨碍分离自体SKP用于老年人的毛发再生疗法[43]。自hESC衍生毛发诱导性DP样细胞代表通向用于毛发减少的人的基于细胞的治疗的开发的第一步。
材料和方法
hESC培养：如先前所述在经过辐射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上维持H9hESC系[24]。自hESC生成NC细胞：先前描述了分化方案[24,25]。ESC-DP的生成：将第一次传代的NC细胞用下述组成的DP培养基培养3天：DMEM/F-12Glutamax(Gibco 10829-018)，10％FBS(Gibco#10437)，1mM L-谷氨酰胺(Gibco 25030-081)，1X抗生素/抗真菌剂(OmegaScientific AA-40)。之后，将它们用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco 25200)解离成单细胞悬浮液并以密度100x103个细胞/mm2涂布到未包被的培养皿上。次日通过更换培养基去除24小时后未能附着的漂浮细胞。让附着的细胞在未包被的培养皿上生长，隔天更换培养基；每4-5天对培养物传代。
免疫组织化学和FACS分析：将细胞培养物用含4％PFA的PBS于室温固定10分钟；将组织样品于4℃固定过夜。固定后，将细胞在PBS中清洗3次5分钟，并在OCT中包埋组织样品用于冷冻切片或用于毛发解剖和全封固制备物。染色前将细胞和切片在含4％BSA或10％山羊血清及0.05％-0.3％Triton X 100(Sigma T8787)的PBS中封闭1小时。于4℃应用一抗过夜。然后将细胞或切片在PBS中清洗3次，每次15分钟。在黑暗中于室温应用二抗(在PBS中1:500稀释)1小时。将细胞在PBS中清洗3次，每次10分钟。用Hoechst或Dapi标记核。对于FACS分析，用Accutase解离感兴趣细胞并在3％BSA/PBS中重悬浮20分钟以封闭非特异性结合。然后将细胞与一抗一起在冰上温育30分钟。然后在3ml PBS中清洗细胞，在含适宜二抗(1:1000)的3％BSA/PBS中重悬浮30分钟并用3ml PBS清洗，之后在1％BSA/PBS中重悬浮并与碘化丙啶(PI)一起温育。依照荧光分选细胞(FACSVantageSE DiVa，BD Biosciences，SanJose)并用FlowJo软件分析数据。使用下述抗体：小鼠单克隆CD47(R&D)，小鼠单克隆CD184(eBioscience)，小鼠单克隆CD44(Novus)，山羊多克隆Foxd3(Santa Cruz)，家兔多克隆GFP(Invitrogen)，小鼠单克隆ITGA4(R&D)，小鼠单克隆巢蛋白(Chemicon)，小鼠单克隆OCT3/4(Santa Cruz)，家兔多克隆P-75(Chemicon)，小鼠单克隆SMA(Chemicon)，家兔多克隆Sox2(Abcam)，家兔多克隆Sox9(Millipore)，家兔多克隆Sox10(Abcam)，小鼠单克隆SSEA4(R&D)，小鼠单克隆Versican(Seikagaku Corporation)。
Q-PCR：使用RNeasy试剂盒提取总RNA并依照制造商的建议使用Quantitect试剂盒(Qiagen)逆转录1μg总RNA以生成cDNA。依照制造商的推荐用SyberGreen master混合物(Invitrogen)实施Q-PCR。对于Q-PCR，使用18S表达水平进行标准化并使用标准曲线方法分析数据。如下实施Q-PCR：初始变性：95℃10分钟；40个循环的变性：95℃30秒，退火：56℃1分钟，延伸：72℃30秒；和一个最终循环的变性：95℃1分钟，退火：65℃30秒和最终变性：95℃30秒。表1中汇总实时Q-PCR引物。
表1
引物 序列 SEQ ID NO:
18S正向 AGTCCCTGCCCTTTGTACACA SEQ ID NO:01
18S反向 CGATCCGAGGGCCTCACTA SEQ ID NO:02
Corin正向 AACCCAGTGGACATATCTGTGGCT SEQ ID NO:03
Corin反向 TGTTGATGCCAAGCACCACTTTCC SEQ ID NO:04
微管连接蛋白正向 TGTGAAGTCGAGGCCTCATGACAA SEQ ID NO:05
微管连接蛋白反向 TCTTGGAGACGATGGCCTTGTTGA SEQ ID NO:06
P-75正向 TTCAAGGGCTTACACGTGGAGGAA SEQ ID NO:07
P-75反向 AATTCCTTCTTGCCGCATTCCCAC SEQ ID NO:08
Versican正向 TGAGCATGACTTCCGTTGGACTGA SEQ ID NO:09
Versican反向 CCACTGGCCATTCTCATGCCAAAT SEQ ID NO:10
波形蛋白正向 AGAACCTGCAGGAGGCAGAAGAAT SEQ ID NO:11
波形蛋白反向 TTCCATTTCACGCATCTGGCGTTC SEQ ID NO:12
细胞：获得不同传代次数时的ESC-DP细胞。用0.1％胰蛋白酶-EDTA(Gibco 25200)将细胞解离成单细胞悬浮液并通过系列离心用PBS清洗3次(1200RPM，5分钟)。最后，以浓度5x106每100μl在DP培养基中重悬浮细胞并保持在冰上直至移植。
自p0-p2 BL6小鼠皮肤获得小鼠表皮和真皮细胞。分离背部皮肤并放置在冰上，在含抗生素/抗真菌剂(最终1X；Omega Scientific AA-40)的PBS中摇动清洗5次5分钟并在含0.01％分散酶(Sigma)的PBS中于40℃温育过夜。用镊子分离皮肤的表皮层，在PBS中清洗5分钟并在0.1％胰蛋白酶-EDTA溶液中于37℃温育8分钟。用剪子将皮肤的真皮层均质化并用0.1％胰蛋白酶-EDTA溶液于37℃消化45分钟。通过添加DP培养基来封闭酶活性并用移液器将表皮或真皮剧烈吹打10分钟。用细胞滤网(BD Falcon 9261365)分离细胞悬浮液并通过离心在PBS中清洗3次(1200RPM，5分钟)。以5x106个细胞每100μl在DP培养基中重悬浮细胞并保持在冰上直至移植。
人真皮乳头细胞：这项研究中人组织衍生样品的使用限于使用来自2项整容医学规程的皮肤废组织。在含抗生素/抗真菌剂(最终1X；Omega Scientific AA-40)的PBS中摇动清洗皮肤15次5分钟。然后用解剖刀分离含有毛囊的脂肪并在含0.2％分散酶(Sigma)的DMEM/F12中于40℃温育过夜。用镊子自脂肪分离毛囊并在含0.1％I型胶原酶(Sigma)的DMEM/F12中温育5-7小时。然后通过用移液器剧烈吹打10分钟自剩余囊解离DP。在毛囊落到底部后DP停留在上清液中并通过以1000RPM离心5分钟来分离。
细胞移植：先前详细描述了细胞移植的方法[27]。简言之，组合感兴趣细胞(ESC-NC，早期ESC-DP，ESC-DP，rDP p2)的100μl悬浮液(5x105个细胞)与表皮细胞的100μl悬浮液(5x105个细胞)并通过皮下注射移植给免疫缺陷小鼠(品系Athymic Nu/Nu)。14-21天后对小鼠处以安乐死并分析移植物。对于阴性对照，移植单独的表皮细胞。
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通过援引明确将每一篇下述参考文献完整收入本文。
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本文中使用的，术语“包含”与“包括”，“含有”，或“特征在于”同义，而且是内含式的或开放式的且不排除另外的，未述及的要素或方法步骤。
上文描述公开本发明的数种方法和材料。本发明容易进行方法和材料的更改以及制作方法和设备的改变。考虑本公开文本或本文中公开的发明的实践后，此类更改对本领域技术人员会变得显而易见。因此，本发明意图并不限于本文中公开的具体实施方案，而是意图涵盖落在本发明的真正范围和精神内的所有更改和备选。
通过援引将本文中引用的所有参考文献(包括但不限于已出版的和未出版的申请，专利，和文献参考文献)完整收入本文且由此构成此说明书的一部分。在通过援引收录的出版物和专利或专利申请与本说明书中含有的公开内容矛盾的情况下，本说明书意图取代和/或优先于任何此类矛盾材料。
序列表
<110> A·V·特尔斯基克
<120> 调控毛发生长的方法和组合物
<130> BURNHAM.036WO
<150> 62022639
<151> 2014-07-09
<160> 12
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
agtccctgcc ctttgtacac a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
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<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
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<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
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<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
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<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 10
ccactggcca ttctcatgcc aaat 24
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 11
agaacctgca ggaggcagaa gaat 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 12
ttccatttca cgcatctggc gttc 24

Claims (59)

1.一种用于在受试者中诱导毛发生长的方法，其包括：
对该受试者施用一群诱导的真皮乳头细胞。
2.权利要求1的方法，其进一步包括获得该群诱导的真皮乳头细胞。
3.权利要求1-2任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞包含选自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌动蛋白，碱性磷酸酶，和波形蛋白组成的组的标志物。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞是自一群诱导的神经嵴细胞生成的。
5.权利要求4的方法，其包括选择粘附细胞。
6.权利要求4-5任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞包含选自由Sox10，Foxd3，整联蛋白α4，纤连蛋白的关联受体，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白组成的组的标志物。
7.权利要求4-6任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞缺乏选自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌动蛋白，和碱性磷酸酶组成的组的标志物。
8.权利要求4-7任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞是自一群干细胞生成的。
9.权利要求8的方法，其包括在条件下培养该群干细胞以形成该干细胞的簇。
10.权利要求9的方法，其包括悬浮培养该簇以形成球体。
11.权利要求10的方法，其包括在基质的表面上涂布该球体，其中该表面是用纤连蛋白或聚鸟氨酸包被的。
12.权利要求8的方法，其中该群干细胞包含选自由胚胎干细胞和诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
13.权利要求12的方法，其中该诱导的多能干细胞是自选自由成纤维细胞，肾上皮细胞，和血细胞组成的组的来源生成的。
14.权利要求12的方法，其中该群干细胞包含选自由H9细胞和自人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞是自供体受试者获得的。
16.权利要求15的方法，其中该供体受试者和该受试者是相同的。
17.权利要求15的方法，其中该供体受试者和该受试者是不同的。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中该施用包含皮下移植。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中该施用是对该受试者的皮肤的如下部位，在一群受试者中的该部位处包含毛发。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中该施用是对该受试者的皮肤的选自由头皮，面部，上唇，颏部，眉部，睑部，臂部，腿部，背部，躯干，和腹部组成的组的部位。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中该施用是对该受试者的皮肤包含瘢痕组织的部位。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中该受试者具有脱发。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中该受试者是哺乳动物。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中该受试者是人。
25.一种用于筛选调控毛发生长的药剂的方法，其包括：
使一群诱导的真皮乳头细胞接触测试药剂；并
测量对该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的影响。
26.权利要求25的方法，其中该影响包括该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的速率与不接触该测试药剂的一群诱导的真皮乳头细胞相比升高。
27.权利要求25的方法，其中该影响包括该群诱导的真皮乳头细胞中毛发生长的速率与不接触该测试药剂的一群诱导的真皮乳头细胞相比降低。
28.权利要求25-27任一项的方法，其中该影响包括受试者的皮肤选自由头皮，面部，上唇，颏部，眉部，睑部，臂部，腿部，背部，躯干，和腹部组成的组的特定部位特征性的毛发的生长。
29.权利要求25-28任一项的方法，其中该受试者是哺乳动物。
30.权利要求25-29任一项的方法，其中该受试者是人。
31.权利要求25-30任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞在体内接触该测试药剂。
32.权利要求25-30任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞在体外接触该测试药剂。
33.权利要求25-32任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞包含选自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌动蛋白，碱性磷酸酶，和波形蛋白组成的组的标志物。
34.权利要求25-33任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞是自一群诱导的神经嵴细胞生成的。
35.权利要求34的方法，其包括选择粘附细胞。
36.权利要求34-35任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞包含选自由Sox10，Foxd3，整联蛋白α4，纤连蛋白的关联受体，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白组成的组的标志物。
37.权利要求34-36任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞缺乏选自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌动蛋白，和碱性磷酸酶组成的组的标志物。
38.权利要求34-37任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞是自一群干细胞生成的。
39.权利要求38的方法，其包括在条件下培养该群干细胞以形成该干细胞的簇。
40.权利要求39的方法，其包括悬浮培养该簇以形成球体。
41.权利要求40的方法，其包括在基质的表面上涂布该球体，其中该表面是用纤连蛋白或聚鸟氨酸包被的。
42.权利要求38-41任一项的方法，其中该群干细胞包含选自由胚胎干细胞和诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
43.权利要求42的方法，其中该诱导的多能干细胞是自选自由成纤维细胞，肾上皮细胞，和血细胞组成的组的来源生成的。
44.权利要求42的方法，其中该群干细胞包含选自由H9细胞和自人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
45.一种用于制备一群诱导的真皮乳头细胞的方法，其包括：自一群诱导的神经嵴细胞生成该群。
46.权利要求45的方法，其包括选择粘附细胞。
47.权利要求45-46任一项的方法，其中该群诱导的真皮乳头细胞包含选自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌动蛋白，碱性磷酸酶，和波形蛋白组成的组的标志物。
48.权利要求45-47任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞包含选自由Sox10，Foxd3，整联蛋白α4，纤连蛋白的关联受体，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白组成的组的标志物。
49.权利要求45-48任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞缺乏选自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌动蛋白，和碱性磷酸酶组成的组的标志物。
50.权利要求45-49任一项的方法，其中该群诱导的神经嵴细胞是自一群干细胞生成的。
51.权利要求50的方法，其包括在条件下培养该群干细胞以形成该干细胞的簇。
52.权利要求51的方法，其包括悬浮培养该簇以形成球体。
53.权利要求52的方法，其包括在基质的表面上涂布该球体，其中该表面是用纤连蛋白或聚鸟氨酸包被的。
54.权利要求50的方法，其中该群干细胞包含选自由胚胎干细胞和诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
55.权利要求54的方法，其中该诱导的多能干细胞是自选自由成纤维细胞，肾上皮细胞，和血细胞组成的组的来源生成的。
56.权利要求50的方法，其中该群干细胞包含选自由H9细胞和自人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞组成的组的细胞。
57.一群诱导的真皮乳头细胞，其是通过权利要求45-56任一项的方法制备的。
58.一群诱导的真皮乳头细胞在受试者中诱导毛发生长的用途。
59.权利要求58的用途，其中该群诱导的真皮乳头细胞是通过权利要求45-56任一项的方法制备的。
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