KR20230026952A - 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 제조방법 - Google Patents

전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제조하는 방법 및 상기 제조방법을 통해 제조된 상피 오가노이드에 관한 것이다. 본 발명의 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드는 Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin, Involucrin, Sox9, CD34, p75 및 Itga6에서 선택되는 피부 조직 내 주요한 세포 특이적 유전자 마커의 발현이 증가하여 피부 세포 간 상호작용 또는 세포와 기질 간 상호작용을 모사하는데 우수하다. 따라서, 본 발명의 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드는 피부 질환 모델링, 신약 및 치료제 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 제조방법{METHOD FOR MANUFACTURING PLURIPOTENT STEM CELL-DERIVED EPIDERMAL ORGANOIDS}
본 발명은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제조하는 방법 및 상기 제조방법을 통해 제조된 상피 오가노이드에 관한 것이다.
전분화능 줄기세포(PSCs, pluripotent stem cells)는 개체를 이루고 있는 모든 종류의 세포나 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미하며, 무한대로 자가 재생산(self-renewal)이 가능하다. 또한, 전분화능 줄기세포는 체내 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있다.
이러한 전분화능 줄기세포로는 대표적으로 배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포가 있다. 배반포로부터 분리한 전분화능 줄기세포인 배아줄기세포는 미분화 상태로의 보관이 용이하고 자가복제능력이 뛰어나 손상된 세포나 조직 등을 대체시켜 치료하는 난치병 연구 분야에서 주목받고 있다. 또한, 환자 맞춤형 전분화능 줄기세포인 유도만능 줄기세포(iPSC, induced pluripotent stem cell)는 리프로그래밍 기술을 통해서 생산이 가능하여 재생의료 산업 및 광범위한 연구 분야에서 주목받고 있다.
기존의 재생의료 산업에서는 주로 피부 모델과 관련된 연구가 활발히 이루어 졌으며, 각질형성세포(keratinocytes) 또는 진피섬유아세포(dermal fibroblasts) 등을 이용한 피부 모델이 주로 연구되었다(Kuhbacher et al., J Infect Dis, 2017 June 1, 215(11), 1742-1752). 하지만, 각질형성세포 또는 진피섬유아세포를 이용하여 2D 배양방법으로 배양한 피부 모델의 경우 세포 수급 제한 및 품질관리가 어려워 생산성이 낮으며, 세포 간 상호작용 또는 세포와 기질 간 상호작용과 같은 생체 내 조건을 모사하는데 한계가 있다.
한편, 피부조직의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위해서는 모낭 줄기세포와 상피 줄기세포간 상호작용이 중요하며, 이들 줄기세포는 상처 치유, 재생, 모(毛) 성장 등과 관련된 피부 기능과 관련되어 있다. 그러나, 종래 사용되던 피부 모델은 피부 상피 및 모낭 등의 실제 피부조직에 구비된 부속 기관 등을 구현하지 못하는 단점이 존재하였다.
이러한 기존의 피부 모델의 한계를 극복하기 위해, 최근 전분화능 줄기세포를 이용하여 다능성을 지닌 피부 조직의 줄기세포, 전구세포 또는 분화세포를 제조하는 방법에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Kim et al., Stem Cell Research & Therapy, 2018, 9:217). 이러한 연구의 일환으로, 유도 만능 줄기세포를 각질형성세포와 진피 섬유아세포로 분화시킨 뒤 공동배양 및 배양체(embryoid bodies) 형성이후 면역 결핍 마우스에 배양체를 이식하여 성숙시키는 방법 등이 개발되었고, 최근 생체외 환경에서 자가조직화 방법으로 피부조직을 구현하는 방법도 보고되었다. 그러나, 이들 방법에 의하여 형성된 피부조직을 균일하게 분화시키기 어렵고, 피부 조직 구현에 소요되는 기간이 장기간이며, 계대배양이 힘들고, 피부 상피를 구현하기 어려운 단점을 갖는 것으로 알려져 있다.
따라서, 여전히 실제 피부 조직과 모낭 및 상피의 기능 및/또는 구조가 유사한 피부 모델로서 분자유전학적 상호작용 및/또는 세포생물학적 상호작용 기전 연구에 적합한 모델 및/또는 동물실험 대체 모델에 대한 기술적 요구에 따라 기존 기술과 차별화된 피부 모델 및 이의 제조방법에 관한 연구가 필요한 실정이다.
(비특허문헌 1) Kuhbacher et al., J Infect Dis, 2017 June 1, 215(11), 1742-1752
(비특허문헌 2) Kim et al., Stem Cell Research & Therapy, 2018, 9:217
본 발명자들은 인체의 피부를 대체할 수 있는 피부 모델에 대해 연구한 결과, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 제조방법 및 증식방법을 개발하였으며, 이를 이용하여 제조한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드가 종래 사용되던 각질형성세포 유래 오가노이드와 비교하여 더 개선된 특징들, 구체적으로 상피세포와 같은 피부 조직 내 주요 세포 특이적 유전자 마커가 유사하게 발현되고, 상피 줄기세포 콜로니 수, 상피 줄기세포 콜로니 특이적 유전자 마커 및 모낭 줄기세포 특이적 마커 발현이 증가되며, 여러 계대배양을 거치더라도 상기 특성을 유지한다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, i) 전분화능 줄기세포를 분화배지에서 배양하여 상피 전구세포로 분화시키는 단계; 및 ii) 상기 분화시킨 상피 전구세포를 성숙화 배지 1에서 배양하고 이어서 그 배양한 세포를 성숙화 배지 2에서 배양하여 세포를 안정적으로 증식하고 성숙시키는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 제조방법으로 제조된 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin, Involucrin, Sox9, CD34, p75 및 Itga6에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은, 상기 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서 유래한 것을 특징으로 하는 생체외 피부 질환을 모사하는 피부 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)과 1:5 내지 1:15 비율로 혼합하여 증식용 배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는 상피 오가노이드의 증식방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은, 상기 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에 피부 질환 치료 후보 약물을 접촉시키는 단계; 및 상기 피부 질환 치료 후보 약물이 처리된 오가노이드의 유전적 변이를, 상기 피부 질환 치료 약물이 처리되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 생체 외에서 피부 질환 치료 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드는 Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin, Involucrin, Sox9, CD34, p75 및 Itga6 등의 피부 조직 내 주요한 세포 특이적 유전자 마커를 발현하여 피부 세포 간 상호작용 또는 세포와 기질 간 상호작용을 모사하는데 우수하다.
따라서, 본 발명의 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드는 피부재생, 피부암, 건선, 지루성피부염, 과다색소침착 등 다양한 피부 질환을 모사할 수 있어 피부 질환 모델링, 신약 및 치료제 개발, 피부 독성 시험 평가 등에 유용하게 사용될 수 있으며, 피부 질환 및 피부 재생 의학 분야에서 세포 치료제의 공급원으로도 사용될 수 있다.
도 1은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 제조과정 및 증식배양 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 제조방법에 따라 배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포가 상피 오가노이드로 분화 유도되는 과정을 명시야 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 2b는 순차적으로 전분화능 줄기세포(검은색), 배양 8일차 스페로이드(분홍색) 및 배양 15일차 상피 오가노이드(적색)에서 qPCR로 측정한 p63, Sox9, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin 및 Itga6 유전자 발현량을 도시한 것이다(***: p-value<0.001).
도 3a는 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 H&E 염색으로 관찰한 이미지이다.
도 3b는 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 면역염색으로 관찰한 이미지이다.
도 4a는 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 본 발명의 증식배양 방법에 따라 계대배양시 증식하는 과정을 명시야 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 4b는 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 계대배양시 배양일자별 흡광도를 도시한 것이다(**: p-value<0.01, ***: p-value<0.001).
도 5a는 동결보존 및 해동 후, 다시 계대배양한 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 분화 양상을 명시야 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5b는 동결보존 및 해동 후, 20번 계대배양한 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 및 30번 계대배양한 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 면역염색으로 관찰한 이미지이다.
도 5c는 동결보존 및 해동 후, 10번 계대배양, 20번 계대배양 또는 30번 계대 배양한 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서의 Krt5, Krt14, △Np63, Sox9, Involucrin 및 Krt1 단백질 발현량을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a은 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 이용하여 제조한 표피 모델을 H&E 염색으로 관찰한 이미지이다.
도 6b는 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 이용하여 제조한 피부 표피 모델을 면역염색으로 관찰한 이미지이다.
도 7a는 각질형성세포 유래 상피 오가노이드와 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 분화 양상을 명시야 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 7b는 각질형성세포 유래 상피 오가노이드(Ker-EpiO)와 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드(iPS-EpiO)에서의 배양일자별 흡광도를 도시한 것이다.
도 7c는 2D 배양법으로 배양한 각질형성세포 유래 상피 오가노이드를 면역염색으로 관찰한 이미지이다.
도 7d는 20번 계대배양한 각질형성세포 유래 상피 오가노이드(p.20) 및 30번 계대배양한 각질형성세포 유래 상피 오가노이드(p.30)를 면역염색으로 관찰한 이미지이다.
도 8a는 각질형성세포 유래 상피 오가노이드(Ker-EpiO)와 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드(즉, iPS-EpiO)에서 나타나는 Itga6 및 Sca1이 모두 양성인 상피 줄기세포군 분포를 FACS로 분석한 결과를 도시한 것이다(***: p-value<0.001).
도 8b는 각질형성세포 유래 상피 오가노이드와 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서의 오가노이드 세포 수가 2500, 5000 또는 10000개인 경우 형성되는 상피 줄기세포 콜로니 차이를 나타낸 도면이다.
도 9는 2D 배양방법과 3D 배양방법에 따른 상피 오가노이드의 E-cadherin, Krt10, p75, Involucrin,Krt15, CD34, p63 및 Sox9의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 통해 측정한 결과이다(1 및 3: 각질형성세포 유래 상피 오가노이드, 2 및 4: 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드).
도 10은 2D 배양 방법으로 얻은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 및 각질형성세포 유래 상피 오가노이드에서의 Krt14, Krt5, Involucrin, Krt15, Nfatc1, CD34, p63 및 Sox9의 발현 수준을 면역염색으로 관찰한 이미지이다.
도 11은 유도만능 줄기세포, 2D 배양 방법으로 얻은 각질형성세포 유래 상피오가노이드 및 2D 배양 방법으로 얻은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서의 Krt5, Krt10, Krt14, Krt15, Filaggrin, Loricrin 및 p63의 발현량을 qPCR로 측정한 결과를 도시한 것이다(1: 유도만능 줄기세포, 2: 2D 각질형성세포 유래 상피 오가노이드, 3: 2D 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드)(***: p-value<0.001).
도 12는 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 UVB 조사량별 형태변화를 명시야 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 13은 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 UVB 조사량별 p53, p21, p16, ki67, delta-Np63, Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Involucrin 및 Loricrin 발현량을 qPCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다(*: p-value<0.05, **: p-value<0.01, ***: p-value<0.001).
도 14는 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 UVB 조사량별 E-cadherin, Krt1, Krt5, Krt10, Involucrin 및 cleaved caspase 3 발현 변화를 면역염색으로 관찰한 이미지이다.
도 15는 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 UVB 조사량별로 △Np63, Krt1, Krt5, phospho-p53(S15), phsopho-gammaH2A.X 및 cleaved caspase 3 발현량을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, i) 전분화능 줄기세포를 분화배지에서 배양하여 상피 전구세포로 분화시키는 단계; 및 ii) 상기 분화시킨 상피 전구세포를 성숙화 배지 1에서 배양하고 이어서 그 배양한 세포를 성숙화 배지 2에서 배양하여 세포를 안정적으로 증식하고 성숙시키는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "전분화능 줄기세포"는 몸을 구성하는 어떠한 형태의 세포로도 유도 분화가 가능한 줄기세포를 의미하며, 유도만능 줄기세포 또는 배아줄기세포를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는, 배아줄기세포(ESC, embryonic stem cell) 또는 유도만능 줄기세포(iPSC, induced pluripotent stem cell)를 사용하였다.
본 발명의 용어 "오가노이드(organoid)"는 줄기세포를 이용해 최소 기능을 할 수 있도록 만든 '미니 유사장기'로서, 3차원 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있는 것이 특징이다. 즉, 오가노이드는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 신경, 장 등의 장기와 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "분화"는 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말하며, 예를 들어, 만능 줄기세포가 외배엽(대뇌 피질, 중뇌, 시상하부 등), 중배엽(난황낭 등) 및 내배엽 세포로 변하는 과정뿐 아니라 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정, 즉 전구세포가 특정 분화 형질을 발현하게 되는 것도 모두 분화에 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "배지"는 in vitro에서 세포의 증식, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당 분야에서 사용되는 세포의 배양 및 분화에 적합한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지의 종류와 배양 조건이 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"은 생물체나 생물체의 일부(기관 조직 세포 등)를 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일을 의미한다. 배양의 외부적인 조건으로는 온도, 습도, 조도, 이산화탄소나 산소의 분압 등이 있으며, 배지의 조성을 달리하여 생물체에 직접적인 영향을 주는 것이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는, 매트리겔을 배양배지로 사용하여 3차원의 성장 환경을 제공하는 3D 배양방법을 이용하여 상피 오가노이드 형성을 유도하였다.
상기 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법은 전분화능 줄기세포인 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 i) 단계는 분화 배양 단계로, 구체적으로는 전분화능 줄기세포인 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포의 BMP, FGF 및 TGF-β 신호 전달 경로를 조절하여 줄기세포에서 외배엽으로 분화시킨 후, 비신경 외배엽(non-neural ectoderm) 내 상피 전구세포로 다시 분화시키는 단계(Differentiation)를 포함할 수 있다.
상기 i) 단계의 분화배지는 GMEM(Glasgow Modified Essential Medium), KSR(knock-out serum replacement), 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 비필수아미노산(NEAA, Non-Essential Amino Acid) 및 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 단일 세포로 분리된 줄기세포인 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포를 상기 분화배지에 분주하여 하루 동안 배양하였다.
상기 i) 단계에서 전분화능 줄기세포가 스페로이드(spheroid)를 형성하면 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)을 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 기존 배지의 절반을 버리고 4% GFR 매트리겔을 포함하는 새로운 분화배지를 처리하여 배양하였다.
상기 i) 단계에서 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)을 처리하는 단계 후, TGF-β(transforming growth factor-beta) 억제제 및 BMP-4(Bone morphogenetic protein-4)를 처리하여 비신경 외배엽으로 분화시킨 후, BMP 억제제(BMP inhibitor) 및 FGF-2를 처리하여 상피 전구세포로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 TGF-β 억제제는 TGF-β의 신호 전달 경로를 차단하여, TGF-β에 의해 유도되는 암 세포의 성장 및 증식을 억제하기 위해 사용한다. 또한, TGF-β 억제제는 암 세포뿐만 아니라 정상 세포의 분화, 성장 및 증식을 조절하는데 사용할 수 있으며, 구체적으로 유도만능 줄기세포를 중간엽줄기세포(MSC, mesenchymal stem cells)로 분화 유도하는데 사용한 바 있다. 상기 TGF-β 억제제로는 A77-01, A83-01, LY3200882, SB431542 및 SB505124 등이 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, SB431542를 포함하는 분화배지를 처리하여 전분화능 줄기세포로부터 외배엽으로의 분화를 유도하였다.
상기 TGF-β 억제제는 1 내지 10 μM, 1 내지 8 μM, 1 내지 6 μM 또는 1 내지 5 μM의 농도로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5 μM의 농도로 처리할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 5 μM의 SB431542를 포함하는 25 ㎕의 분화배지를 처리하여 배양하였다.
상기 BMP-4는 BMP4 유전자에 의해 암호화된 단백질로 TGF-β 단백질 슈퍼패밀리에 속하는 단백질이다. BMP-4는 뼈와 연골 발달, 치아와 사지 발달 등에 관여하며, 중간엽줄기세포(MSC, mesenchymal stem cells)와 같은 줄기세포 분화 유도에 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, BMP-4를 포함하는 분화배지를 처리하여 외배엽으로부터 비신경 외배엽으로의 분화를 유도하였다.
상기 BMP-4는 1 내지 100 ng/㎖, 1 내지 80 ng/㎖, 1 내지 60 ng/㎖ 또는 1 내지 50 ng/㎖의 농도로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50 ng/㎖의 농도로 처리할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 50 ng/㎖의 BMP-4를 포함하는 25 ㎕의 분화배지를 처리하여 배양하였다.
상기 BMP 억제제는 골 형성 단백질(BMP: Bone morphogenetic protein)의 특정 수용체 및 신호 경로를 차단하여, 줄기세포가 연골 조직으로 과도하게 분화하지 않도록 억제하기 위하여 사용된다. 또한, BMP 억제제를 세포에 처리하여 BMP로 유도되는 세포 성장 및 분화를 조절할 수 있으며, 구체적으로 성체줄기세포의 조직 분화를 조절하는데 사용한 바 있다. 상기 BMP 억제제로 DMH-1, DMH-2, K02288, LDN-193189, LDN-212854, LDN-214117 및 ML347 등이 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, BMP 억제제로 LDN-193189를 사용하였다.
상기 BMP 억제제는 1 내지 10 μM, 1 내지 8 μM, 1 내지 7 μM 또는 1 내지 6 μM의 농도로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 6 μM의 농도로 처리할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 6 μM의 LDN-193189를 포함하는 25 ㎕의 분화배지를 처리하여 배양하였다.
상기 FGF-2(basic fibroblast growth factor)는 FGF2 유전자에 의해 암호화된 단백질을 의미하며, 섬유질 성장 인자 수용체(FGFR) 단백질에 결합한다. FGF-2는 인간 배아줄기세포 분화에 있어 중요한 구성 요소이며 특히, 인간 배아줄기세포를 신경계로 분화 유도하는데 사용할 수 있다.
상기 BMP 억제제와 FGF-2를 비신경 외배엽에 함께 처리하여 두개골 신경능선세포(cranial neural crest, CNC-like cell)로 분화 유도할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, BMP 억제제와 FGF-2를 비신경 외배엽에 함께 처리하여 비신경 외배엽 내 상피 전구세포로의 분화를 유도하였다.
상기 FGF-2는 1 내지 200 ng/㎖, 1 내지 180 ng/㎖, 1 내지 160 ng/㎖ 또는 1 내지 150 ng/㎖의 농도로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 150 ng/㎖의 농도로 처리할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 150 ng/㎖의 FGF-2를 포함하는 25 ㎕의 분화배지를 처리하여 배양하였다.
상기 i) 단계의 배양은 2일 내지 16일, 3일 내지 14일, 4일 내지 12일 또는 5일 내지 10일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 5일 내지 10일 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 8일 동안 배양하였다.
상기 ii) 단계는 성숙화 배양 단계로 구체적으로 전구세포를 매트리겔과 혼합하여 트렌스웰에 분주하고 ALI(air-liquid interface) 배양법을 이용하여 성숙화 배지 내에서 상피 오가노이드로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 ALI(air-liquid interface) 배양법은 체외 배양 환경에서 생체 내 액체 및 공기와 상호작용하는 배양 환경을 모사하기 위해 주로 이용한다. 구체적으로 세포층 하단은 액체와 접촉시키고 세포층 상단은 공기에 노출시켜, 체외에서 제조되는 세포, 조직 또는 오가노이드가 실제 체내와 유사한 상호작용을 할 수 있게 하였으며, 트랜스웰을 사용하여 도입할 수 있다.
상기 ii) 단계의 배양은 상피 전구세포를 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)과 1:0.5 내지 1:5 비율로 혼합하여 트랜스웰에서 생체 내 피부 상호작용을 모사하는 배양 환경에서 수행될 수 있다. 상기 상피 전구세포와 GFR 매트리겔은 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1 또는 1:0.5의 비율로 혼합할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 상피 전구세포와 GFR 매트리겔을 약 1:1 비율로 혼합하였다.
상기 매트리겔(matrigel)은 세포 배양을 위해 사용되는 기저막 매트릭스의 한 종류로 3D 배양 환경을 제공하기 위하여 주로 사용하며, 구체적으로 배아줄기세포 및 오가노이드의 부착 기질로서 사용한 바 있다. 특히, GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)은 성장인자가 제한된 메트리겔로 세포의 성장, 분화 및 증식을 정교하게 조절하기 위하여 사용한다.
상기 GFR 매트리겔의 농도는 50%에서 100%의 농도로 사용하는 것이 일반적이며, 상피 오가노이드의 성숙화 단계에서는 50% 매트리겔 농도(1:1 혼합 비율)로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 ii) 단계의 성숙화 배지 1은 DMEM/F-12, N2 supplement, Glutamax, FBS(Fetal Bovine Serum) 및 Rho 카이네즈 억제제(Rho kinase inhibitor)를 포함하고, 상기 ii) 단계의 성숙화 배지 2는 FBS 및 Rho 카이네즈 억제제를 포함하지 않으며, DMEM/F-12, N2 supplement 및 Glutamax를 포함할 수 있다. 상기 성숙화 배지 2는 FBS 및 Rho 카이네즈 억제제를 포함하지 않도록 하여, 상피 오가노이드로 성숙화하는 과정 중에 영향을 받지 않게 배지의 조성을 구성하였다.
상기 Rho 카이네즈 억제제(Rho kinase inhibitor)는 Rho 카이네즈 신호 전달 경로 및 이와 관련한 ATP-의존 인산화(ATP-dependent phosphorylation)를 차단하기 위하여 사용한다. 또한, Rho 카이네즈 억제제를 세포에 처리하여 세포사멸을 억제시킬 수 있으며, 구체적으로 유도만능 줄기세포의 생존율을 향상시키기 위해 사용한 바 있다. 상기 Rho 카이네즈 억제제로 AT-13148, GSK-576371, H-1152, Ibuprofen, LX-7101, Verosudil, Y-27632, Y-30141, Y-33075 및 Y-39983 등이 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, Y-27632를 사용하였다.
상기 FBS는 세포 사멸을 막고, 세포 증식을 돕기 위해 사용할 수 있다.
상기 ii) 단계의 성숙화 배지 1은 상피 전구세포가 분주된 트랜스웰의 상단 및 하단 레이어에 추가할 수 있으며, 성숙화 배지 2는 상피 전구세포가 분주된 트랜스웰의 하단 레이어에만 추가할 수 있다.
상기 ii) 단계의 성숙화 배지 1에서의 배양은 1일 내지 6일, 1일 내지 5일, 1일 내지 4일, 1일 내지 3일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 1일 내지 3일 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 ii) 단계의 성숙화 배지 2에서의 배양은 3일 내지 15일, 4일 내지 14일, 5일 내지 13일, 6일 내지 12일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 6일 내지 12일 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 성숙화 배지 1에서 2일 동안, 성숙화 배지 2에서 8일 동안 배양하였다.
본 발명의 다른 측면은 상기 제조방법으로 제조된 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin, Involucrin, Sox9, CD34, p75 및 Itga6에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 것인 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제공한다.
Krt1은 모낭간 상피세포 관련 유전자로서, 상피세포 분화 마커이자 표피조직 특이적 마커로 알려져 있다. Krt1 유전자의 염기서열 및 Krt1 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Krt1 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 3848를 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Krt1 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: P04264를 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Krt5는 기저상피세포 관련 유전자로서, 상피세포 관련 마커이자 표피조직 특이적 마커로 알려져 있다. Krt5 유전자의 염기서열 및 Krt5 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Krt5 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 3852를 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Krt5 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: P13647을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Krt10은 모낭간 상피세포 관련 유전자로서, 상피세포 분화 마커이자 표피조직 특이적 마커로 알려져 있다. Krt10 유전자의 염기서열 및 Krt10 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Krt10 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 3858을 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Krt10 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: P13645을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Krt14는 상피세포 관련 유전자로서, 상피세포 관련 마커이자 표피조직 특이적 마커로 알려져 있다. Krt14 유전자의 염기서열 및 Krt14 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Krt14 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 3861을 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Krt14 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: P02533을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Filaggrin은 케라틴 섬유에 결합하는 필라멘트 관련 유전자로서, 표피조직 특이적 마커로 알려져 있다. Filaggrin 유전자의 염기서열 및 Filaggrin 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Filaggrin 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 2312를 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Filaggrin 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: O75370을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Loricrin은 각질화된 상피세포 관련 유전자이면서 각질화된 상피세포 형성에 관여하는 마커로서 표피조직 특이적 마커로 알려져 있다. Loricrin 유전자의 염기서열 및 Loricrin 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Loricrin 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 4014를 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Loricrin 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: p23490을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Involucrin은 각질세포 보호 단백질 유전자로서, 각질화된 상피세포 형성에 관여하는 마커이자 표피조직 특이적 마커로 알려져 있다. Involucrin 유전자의 염기서열 및 Involucrin 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Involucrin 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 3713을 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Involucrin 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: P07476을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Sox9은 상피 줄기세포 유전자로서 상피조직 관련 대표적인 유전자 마커로 알려져 있다. Sox9 유전자의 염기서열 및 Sox9 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Sox9 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 6662를 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Sox9 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: p48436을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
CD34는 상피 줄기세포 유전자로서 상피조직 관련 대표적인 유전자 마커로 알려져 있다. CD34 유전자의 염기서열 및 CD34 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 CD34 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 947을 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 CD34 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: p28906을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
p75는 각질세포 관련 유전자 마커로 알려져 있다. p75 유전자의 염기서열 및 p75 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 p75 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 4803을 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 p75 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: Q6LBF2을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
Itga6은 줄기세포 관련 유전자 마커로 알려져 있다. Itga6 유전자의 염기서열 및 Itga6 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI, UniProt와 같은 공지된 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 Itga6 유전자의 염기서열 정보는 NCBI Gene ID: 3655을 통해 NCBI에서 수득할 수 있으며, 인간 Itga6 단백질의 아미노산 서열은 UniProt ID: P23229을 통해 UniProt에서 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드가 2D 배양한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에 비해 Involucrin, Krt10, p75, p63, CD34, Sox9 및 Krt15 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)과 1:5 내지 1:15 비율로 혼합하여 증식용 배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는 상피 오가노이드의 증식방법을 제공한다. 상기 상피 오가노이드와 GFR 매트리겔은 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5의 비율로 혼합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 상피 오가노이드와 GFR 매트리겔을 약 1:9 비율로 혼합하였다.
이때, 상기 GFR 매트리겔의 농도는 50%에서 100%의 농도로 사용하는 것이 일반적이며, 상피 오가노이드의 성숙화 단계에서는 90% 매트리겔 농도(1:9 혼합 비율)로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 상피 오가노이드를 해리하여 상피 전구세포를 다량 확보할 수 있으며, 확보된 상피 전구세포를 증식용 배지에서 계대배양하여 상피 오가노이드로 분화 할 수 있다.
상기 계대배양은 2일차까지는 Rho 카이네즈 억제제(Rho kinase inhibitor) 존재하에 증식용 배지에서 배양하며, 이후부터는 Rho 카이네즈 억제제가 존재하지 않는 증식용 배지에서 배양하고, 상기 증식용 배지는 DMEM/F12, Hepes, 페니실린/스트렙토마이신, Glutamax, B27 supplement, N-Acetylcysteine-1, Noggin, Rspondin-1, acidic FGF1, Heparin 및 Forskolin를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM/F-12, Hepes, Glutamax, B27 supplement, N-Acetylcysteine-1, Heparin, Noggin, R-spondin 1, acidic FGF1 및 Forskolin를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 계대배양 2일차까지는 DMEM/F12, 10 mM의 Hepes, 페니실린/스트렙토마이신, Glutamax, B27 supplement, 1 mM의 N-Acetylcysteine-1, 100 ng/㎖의 Noggin, 200 ng/㎖의 Rspondin-1, 100 ng/㎖의 acidic FGF1, 0.2% Heparin, 10 ng/㎖의 Forskolin를 포함하며, Rho 카이네즈 억제제(Rho kinase inhibitor)인 10 μM의 Y-27632가 존재하는 증식용 배지에서 배양하였으며, 이후부터는 Rho 카이네즈 억제제(Rho kinase inhibitor)인 10 μM의 Y-27632가 존재하지 않는 증식용 배지에서 배양하였다.
상기 상피 오가노이드는 동결보존이 가능하고, 해동 후 계대배양시 동결 전과 동일하게 Krt5, Krt1, Krt14, Sox9 및 Involucrin에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 Krt5 유전자는 기저 상피세포 관련 유전자이고, Krt1 유전자는 모낭간 상피세포 관련 유전자이며, Krt14 유전자는 상피세포 관련 유전자이고, Sox9 유전자는 상피 줄기세포 관련 유전자이며, Involucrin 유전자는 각질화된 상피세포 관련 유전자로서 이들 유전자는 상피세포를 유지하기 위해 필요한 유전자이다. 따라서, 상피 오가노이드를 동결 후 해동하였을 때, 동결 전과 동일하게 Krt5, Krt1, Krt14, Sox9 및 Involucrin에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 유지됨을 확인함으로써 그 성질을 유지하는 것을 확인할 수 있다.
또한, Krt1은 모낭 상피 세포를 지원하는 역할을 하는 모낭간 상피세포 관련 유전자로서, 상피 오가노이드를 동결 후 해동하여 여러 차례 계대배양하더라도, 동결 전과 동일하게 Krt1 유전자의 발현을 유지하는 것을 확인함으로써 그 성질을 유지하는 것을 확인할 수 있다. 나아가, 이러한 효과는 상피세포 관련 유전자인 Krt14, 상피 줄기세포 관련 유전자인 p63과 sox9에 대해서도 동일하게 관찰되었다.
본 발명의 일 실시예에서는, 해동 후 계대배양한 상피 오가노이드에서 Krt5 유전자, Krt1 유전자, Krt14 유전자, p63 유전자 및 sox9 유전자 발현을 측정하였으며, 상기 상피 오가노이드가 해동 후에도 Krt5를 동일하게 발현하며 그 성질은 유지한다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 상피 오가노이드는 상술한 제조방법으로 제조된 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드이거나, 또는 Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin, Involucrin, Sox9, CD34, p75 및 Itga6에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서 유래한 것을 특징으로 하는 생체외 피부 질환을 모사하는 피부 모델로서 사용될 수 있다. 상기 피부 모델은 자외선과 같은 광자극을 이용하여 피부 노화 모델, 피부 손상 모델, 일광화상 모델 등 다양한 피부 질환을 모사하는 피부 모델로서 사용될 수 있다. 이러한 피부 모델은 피부 질환과 관련하여 동물실험을 대체하는 대체 모델로서 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 피부 질환은 아토피성 피부염, 건선, 습진, 여드름, 단순 태선(Lichen simplex), 일광화상(sunburn), 소양증(pruritus), 지루성 피부염 (seborrheic dermatitis), 다리어병(Darier disease), 헤일리-헤일리병(Hailey-Hailey disease), 비후성 반흔(hypertrophic scars), 원판상 홍반성 낭창(discoid lupus erythematosus), 화농피부증(pyodermias)과 같은 염증성 각화 장애 (Inflamed Keratinization Disorders), 장미증, 홍조, 탈모 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 상술한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에 피부 질환 치료 후보 약물을 접촉시키는 단계; 및 상기 피부 질환 치료 후보 약물이 처리된 오가노이드의 유전적 변이를, 상기 피부 질환 치료 약물이 처리되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 생체 외에서 피부 질환 치료 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 치료 후보 약물을 접촉시키기 전에 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에 자외선, 화학물질, 물리적 자극 등을 이용하여 피부 질환, 노화, 피부 손상 등을 유발하여 스크리닝 대상 약물의 치료 대상 질환/증상을 모사할 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 전분화능 줄기세포로부터 상피 오가노이드의 제조
하기 실시예 1.1. 내지 1.2.의 방법에 따라 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제조하였으며, 실시예 2의 방법에 따라 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 증식 배양하였다.
구체적으로, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드는 i) 전분화능 줄기세포인 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포의 BMP, FGF 및 TGF-β 신호 전달 경로를 조절하여 줄기세포에서 외배엽으로 분화시킨 후, 비신경 외배엽(non-neural ectoderm) 내 상피 전구세포로 분화시키는 단계(DIFF, Differentiation); ii) 상기 전구세포를 매트리겔을 사용하여 트렌스웰에 분주하고 ALI(air-liquid interface) 배양법을 이용하여 성숙화 배지 내에서 상피 오가노이드로 분화시키는 단계(MAT, Maturation); 및 iii) 상기 오가노이드 해리하여 상피 전구세포를 확보하고 이를 계대배양하여 증식용 배지 내에서 증식시키는 단계(Maintenance)를 거쳐 제조 및 증식 배양하였다(도 1).
실시예 1. 상피 오가노이드로의 분화 및 성숙화
실시예 1.1. 전분화능 줄기세포로부터 상피 전구세포로의 분화(Differentiation)
준비한 전분화능 줄기세포 즉, 배아줄기세포(ESC, embryonic stem cell)(ATCC, USA) 또는 유도만능 줄기세포(iPSC, induced pluripotent stem cell)(Jungwoon Lee et al., J. Clin. Med, 2018, 7(12), 488)를 외배엽으로 분화시킨 후, 비신경 외배엽 내 상피 전구세포로 분화시켰다. 상피 전구세포로의 분화 배양은 8일 동안 수행되었으며 구체적으로는 하기의 방법에 따라 배양되었다.
먼저, 준비한 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포를 사이토카인(cytokine)의 일종인 백혈병 억제 인자(LIF, leukemia inhibitory factor)를 포함한 혈청/LIF 배지에서 배양하여 미분화상태를 유지하였다. 이때, 혈청/LIF 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 페니실린/스트렙토마이신, Glutamax, 비필수아미노산(NEAA, Non-Essential Amino Acid), 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 15% 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum) 및 103 U/㎖의 백혈병 억제 인자를 포함하였다.
혈청/LIF 배지에서 배양된 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포를 각각 단일 세포로 분리한 후, 초-저-부착 96 웰 U-바닥 플레이트(ultra-low-attachment 96 well U-bottom plates, Corning)에 각 웰당 3×103 세포수가 되도록 세포를 분주하고 하루 동안 배양하였다. 이때, 분화배지는 GMEM(Glasgow Modified Essential Medium)(Gibco), 1.5% KSR(knock-out serum replacement)(Gibco), 피루브산나트륨(sodium pyruvate)(Gibco), 비필수아미노산(Gibco) 및 베타-메르캅토에탄올(Gibco)을 포함하였다.
배양 2일차, 세포가 스페로이드(spheroid)를 형성하는 것을 관찰한 후, 배지의 절반을 버리고 4% GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)(Corning)을 포함하는 새로운 배지를 각 웰에 추가로 처리하여 배양하였다.
배양 3일차, TGF-β 억제제(transforming growth factor-beta inhibitor)인 5 μM의 SB431542(Stemgent) 및 50 ng/㎖의 BMP-4(Bone morphogenetic protein-4) (Peprotech)를 포함하는 25 ㎕의 분화배지를 각 웰에 처리하여 배양하여 전분화능 줄기세포로부터 비신경 외배엽으로의 분화를 유도하였다. 이때, SB431542는 전분화능 줄기세포로부터 외배엽으로의 분화를 유도하기 위해 사용하였으며, BMP-4는 외배엽으로부터 비신경 외배엽으로의 분화를 유도하기 위해 사용하였다.
배양 4일차, BMP 억제제(BMP inhibitor)인 6 μM의 LDN-193189(Stemgent) 및 150 ng/㎖의 FGF-2(Peprotech)를 포함하는 25 ㎕의 분화배지를 각 웰에 처리하여 8일차까지 더 배양하였다. 이때, LDN-193189와 FGF-2를 함께 처리하여, 비신경 외배엽으로부터 비신경 외배엽 내 상피 전구세포로의 분화를 유도하였다.
실시예 1.2. 상피 전구세포로부터 상피 오가노이드로의 성숙화(Maturation)
상기 실시예 1.1.의 방법에 따라 8일차까지 배양한 상피 전구세포의 8 개의 스페로이드를 모아서 trypLE express(Gibco)로 처리한 후, 37℃에서 15분 동안 반응시켜 단일 세포로 해리하였다. 이후, 해리된 단일 세포 1×105 개를 40 ㎕의 advanced DMEM/F-12 배지에 재현탁한 후, 50% GFR 매트리겔과 1:1 비율로 혼합하였다.
상기 세포 혼합물을 0.4 ㎛ 기공을 가지는 6.5 ㎜ 트랜스웰(trans well)에 분주하고 37℃에서 15분 동안 배양하여 응고시켰다.
상기 상피 전구세포가 분주된 트랜스웰의 상단 및 하단 레이어에 성숙화 배지 1을 추가하여 2일 동안 배양하였으며, 이후, 트렌스웰의 하단 레이어에만 성숙화 배지 2를 추가하여 8일 동안 배양하였다. 상기 성숙화 배양은 ALI 배양법을 이용하여 총 10일 동안 수행하였으며, 상피 전구세포로부터 상피 오가노이드로의 분화를 유도하였다.
구체적으로, DMEM/F-12(Gibco), 5% 소태아혈청, N2 보충제(N2 supplement)(Gibco), Glutamax(Gibco) 및 10 μM의 Y-27632(R&D)를 포함하는 성숙화 배지 1을 트렌스웰의 상단 및 하단 레이어에 추가하여 2일 동안 일차적으로 성숙화 배양하였다. 이후, DMEM/F-12(Gibco), N2 보충제(Gibco) 및 Glutamax(Gibco)를 포함하는 성숙화 배지 2를 트렌스웰의 하단 레이어에만 추가하여 8일 동안 성숙화 배양하였다.
성숙화 배지 1은 스페로이드로부터 해리된 단일 세포의 사멸을 줄이고 증식을 돕기 위해 5% 소태아혈청 및 10 μM의 Y-27632를 포함하였으나, 성숙화 배지 2는 상피 오가노이드가 성숙화하는 과정 중에 상기 조성물의 영향을 받지 않게 하기 위해 5% 소태아혈청 및 10 μM의 Y-27632를 포함하지 않도록 하였다. 상기 실시예 1.1 및 1.2의 방법에 따라 배양된 배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 명시야 현미경으로 관찰하였으며 그 결과를 도 2a에 나타내었다. 또한, 배양 0일차 세포, 배양 8일차 스페로이드 및 배양 15일차에 형성된 상피 오가노이드에서의 상피 조직 유전자 마커의 발현 변화를 확인하기 위하여 qPCR을 실시하였다.
먼저, 배양 0일차 세포, 배양 8일차 스페로이드 및 배양 15일차에 형성된 상피 오가노이드에 트리졸(Trizol)을 처리하여 RNA를 분리하여 얻은 후, 상기 RNA에 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 상보적 DNA(cDNA, complementary DNA)를 합성하였다. 상기 상보적 DNA, 이를 표적으로 하는 프라이머 세트(타깃 유전자의 코딩 영역(coding region)의 부위 내 150 내지 200 bp 크기로 증폭할 수 있는 특이적 프라이머 서열) 및 SYBR™ 그린 마스터 믹스(Fast SYBRTM Green Master Mix, Thermo)를 혼합하였다. 상기 SYBR™ 그린 마스터 믹스는 DNA 중합효소, dNTP 및 완충액을 포함하며, 프라이머 세트로서 표 1에 기재된 프라이머를 사용하였다. 이후 ABI FAST 7500 기기를 사용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)을 수행하여 상대 정량값을 얻었다.
p63 F TGTACCTGGAAAACAATGCCCA 서열번호 1
R GACGAGGAGCCGTTCTGAATCT 서열번호 2
Sox9 F GCCACGGAACAGACTCACATC 서열번호 3
R GGAGTGGTGGGTGGGGTCG 서열번호 4
Krt5 F CCTGCAGAAGGCCAAGCA 서열번호 5
R TGGTGTTCATGAGCTCCTGGTA 서열번호 6
Krt14 F CTTCAGCAAGACAGAGGAG 서열번호 7
R TCAGAAATCTCACTCTTGCC 서열번호 8
Krt10 F GACAACTGACAATGCCAACG 서열번호 9
R CAGGGTCACCTCATTCTCGT 서열번호 10
Filaggrin F CTGTTCCTGCAATAGGACTGAC 서열번호 11
R TGCTGAAGAAAGGGCAGA 서열번호 12
Loricrin F GTCCCAACAGTATCAGTGCCAG 서열번호 13
R CCTCCGCAGCTAGAGCCTC 서열번호 14
Itga6 F CTGTTCTTGCCGGGATTCTGATGCT 서열번호 15
R GCATGGTATCGGGGAATGCTGTCAT 서열번호 16
GAPDH F AGTGTTTCCTCGTCCCGTAG 서열번호 17
R GCCGTGAGTGGAGTCATACT 서열번호 18
상기 혼합물에 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 표적 유전자의 Ct값을 다른 참조 유전자인 GAPDH와 비교하여 상대 정량값을 얻었으며, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 상기 배양 과정을 통해 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포 모두 안정적으로 상피 오가노이드로 분화되었다는 것을 확인하였다. 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, 전분화능 줄기세포 및 배양 8일차 스페로이드에서는 상피 줄기세포 마커인 p63이 약하게 관찰되었으나, 상피세포 마커(Krt5, Krt10, Krt14), 케라틴 섬유에 결합하는 필라멘트 관련 유전자인 Filaggrin, 및 각질화된 상피세포 형성에 관여하는 마커인 Loricrin이 전혀 발현되지 않는 것으로 나타났다. 반면에, 전분화능 줄기세포 및 배양 8일차 스페로이드와 대비하여 배양 15일차 상피 오가노이드에서 Krt5, Krt10, Krt14, p63, Filaggrin, Sox9, Loricrin 및 Itga6의 증가된 발현이 관찰되어, 상피 오가노이드에서 상피 줄기세포 및 상피 조직 특이적 유전자가 특이적으로 발현되는 것으로 나타났다(도 2b 참조).
실시예 1.3. 분화된 상피 오가노이드의 유전자 발현 확인
상기 실시예 1.1. 및 1.2.의 방법에 따라 배양된 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에 H&E 염색 및 항체를 이용한 면역염색(immuo-staining)을 수행하여 유전자 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 GFR 매트리겔로부터 분리한 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 담가 1시간 동안 고정하였다. 고정한 상피 오가노이드를 30% 수크로스(sucrose)에 담가 2일 동안 보관하여 상피 오가노이드 내의 수분을 제거한 후, OCT 화합물로 동결시켜 동결절편(cryoblock)을 제작하였다. 제작된 동결절편을 마이크로톰(microtome)을 이용하여 10 ㎛의 일정한 두께로 잘라 유전자 발현 확인을 위한 샘플을 준비하였다.
H&E 염색으로 준비한 샘플의 세포질을 염색하여 관찰한 이미지를 도 3a로 나타내었다.
또한, 준비된 샘플을 1시간 동안 4% 소 혈청 알부민(BSA)/PBS로 블록킹(blocking)한 후, 4℃에서 밤새도록 1차 항체와 함께 배양하였다. 샘플을 PBS 중의 0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich; P9416)으로 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 Alexa Fluor® 접합된 2차 항체와 함께 배양하였다. DAPI 시약(Sigma-Aldrich; D5942)을 사용하여 핵을 염색하고, 형광 이미지는 Olympus 현미경 또는 Zeiss 공초점 현미경으로 촬영하였다. 상기 면역염색을 위하여 사용한 항체는 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
항체 Catalog No. 제조사 희석(Dilution)
anti-Krt1 sc-65999 Santa cruz 1:50
anti-Krt5 ab53121 abcam 1:400
anti-Krt10 sc-23877 Santa cruz 1:50
anti-Krt14 ab7800 abcam 1:400
anti-Filaggrin sc-66192 Santa cruz 1:50
anti-Involucrin PRB-140C Biolegend 1:200
anti-Loricrin ab85679 abcam 1:200
anti-△Np63 ab203826 abcam 1:100
anti-Sox9 AB5535 Millipore 1:200
유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서의 Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Involucrin, Loricrin, p63 및 Sox9 발현 수준 및 발현 위치를 면역염색을 통해 확인한 결과를 도 3b에 나타내었다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 가장자리 부분에는 기저 상피세포가 위치하고 가운데 부분에는 각질형성세포가 위치한다는 것을 확인하였다.
또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 가장자리 부분에만 기저 상피세포 관련 유전자인 시토케라틴 Krt5(cytokeratin Krt5)가 발현하고, 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 가운데 부분에는 케라틴 섬유에 결합하는 필라멘트 관련 유전자인 Filggrin, 각질화된 상피세포 형성에 관여하는 마커인 Loricrin 및 Involucrin이 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 2. 상피 오가노이드의 증식(Maintenance)
실시예 2.1. 상피 오가노이드의 계대배양
상기 실시예 1에서 제조한 상피 오가노이드를 7일 마다 계대배양하여 증식시켰다. 구체적으로, 상피 오가노이드를 trypLE(Gibco)로 처리한 후, 37℃에서 15분 동안 반응시켜 상피 오가노이드로 분화 가능한 상피 전구세포를 다량 확보하였다.
확보한 상피 전구세포를 GFR 매트리겔과 1:9 비율로 혼합하였다. 이후, 상기 세포 혼합물을 0.4 ㎛ 기공을 가지는 6.5 ㎜ 트랜스웰에 20 ㎕ 당 2.5×104 세포 밀도로 분주하였다.
상피 전구세포가 분주된 플레이트에 증식용 배지를 추가한 후 배양하여, 다시 상피 오가노이드로의 분화를 유도하였다. 상기 증식용 배지로는 DMEM/F12, 10 mM의 Hepes, 페니실린/스트렙토마이신, Glutamax, B27 보충제(B27 supplement), 1 mM의 N-아세틸시스테인-1(N-Acetylcysteine-1), 100 ng/㎖의 Noggin(R&D), 200 ng/㎖의 Rspondin-1, 100 ng/㎖의 acidic FGF1(peprotech), 0.2% 헤파린(Heparin)(Stemcell Technologies), 10 ng/㎖의 포스콜린(Forskolin)(Tocris) 및 10 μM의 Y-27632(R&D)를 포함하는 EMM 배지를 사용하였으며, 10 μM의 Y-27632는 배양 2일차까지만 배지 내 첨가되도록 하였다. 상기의 방법에 따라 계대배양하여 증식된 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 명시야 현미경으로 관찰하였으며 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 배양 1일차, 배양 2일차, 배양 3일차, 배양 5일차 및 배양 7일차에 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 수행하였고, Colorimetric assay방법으로 흡광도(450nm)를 측정하여 세포 성장률을 분석하였다. 흡광도는 Spectra Max M3 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices)로 측정하였고, 데이터는 세포 수로 정규화하였으며, 배양일자 별 세포 성장률 분석결과를 도 4b에 나타내었다. 그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, 상기 계대배양 과정을 통해 상피 오가노이드가 안정적으로 증식하였다는 것을 확인하였다. 또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, 계대배양 과정을 통해 상피 오가노이드 세포 성장이 지속적으로 이루어지는 것을 확인하였다.
실시예 2.2. 상피 오가노이드의 동결보존 및 해동
상기 실시예 2.1.에서 계대배양하여 증식된 상피 오가노이드(즉, 4 내지 5번 계대배양된 상피 오가노이드)를 매 계대마다 동결보존하였으며, 해동하여 사용하였다.
구체적으로, 계대배양 4일 후, GFR 매트리겔을 제거하여 상피 오가노이드를 분리하였다. 분리한 상피 오가노이드를 90% 소태아혈청 및 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO, Dimethyl Sulfoxide)를 포함한 냉동배지와 함께 냉동 바이알(cryovial)에 넣었으며, 상기 냉동 바이알을 액체 질소 탱크에 넣어 사용 시까지 동결보존하였다.
상기 동결보존한 냉동 바이알을 37℃의 항온수조(water bath)에 넣어 빠르게 해동한 후, 5% 소태아혈청이 포함된 DMEM/F-12 배지를 사용하여 다이메틸 설폭사이드를 완전히 제거하였다. 해동시킨 상피 오가노이드를 GFR 매트리겔과 1:9 비율로 혼합하였다. 이후, 상기 세포 혼합물을 0.4 ㎛ 기공을 가지는 6.5 ㎜ 트랜스웰에 분주하고 37℃에서 15분 동안 배양하여 응고시켰다.
상기의 방법에 따라 동결보존 및 해동시킨 상피 오가노이드에 상기 실시예 2.1.의 증식용 배지를 추가하여 다시 배양한 후, 20번 계대 배양한 상피 오가노이드를 명시야 현미경으로 관찰하여 도 5a에 나타내었다. 또한, 상기의 방법에 따라 동결보존 및 해동시킨 상피 오가노이드에 상기 실시예 2.1.의 증식용 배지를 추가하여 다시 배양한 후, 20번 계대 배양 또는 30번 계대 배양하여 오가노이드를 얻은 뒤, 상기 실시예 1.3.에서 사용한 면역염색과 동일한 방법으로 20번 계대 배양한 상피 오가노이드 및 30번 계대 배양한 오가노이드를 대상으로 E-cadherin, Involucrin, p63, sox9, Krt5, Krt10 및 Krt14 면역염색(immuo-staining)을 수행하였다. anti-Involucrin 항체, anti-sox9 항체, anti-krt5 항체, anti-krt10 항체, 및 anti-krt14 항체로서 표 2에 기재된 항체를 사용하였고, anti-E-cadherin 항체로서 BD사 항체(Catalog # 610181, 1:200 희석)를 사용하였으며, anti-p63 항체로서 CST사 항체(Catolog #4892, 1:100 희석)를 사용하였고, 면역염색 결과를 도 5b에 나타내었다.
또한, 유도 만능 줄기세포, 10번 계대 배양한 상피 오가노이드, 20번 계대 배양한 상피 오가노이드, 및 30번 계대 배양한 오가노이드를 대상으로 Krt1, Krt5, Krt14, △Np63, Sox9, 및 Involucrin 유전자 발현량을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 우선, 각 오가노이드를 trypLE express(Gibco)로 처리한 후, 37℃에서 15분 동안 반응시켜 단일 세포로 해리하였다. 이후, 해리된 각각의 단일 세포 용해물로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 4-20% gradient SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자블로팅(electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고, 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였으며, 이때 Krt1, Krt5, Krt14, △Np63, Sox9, Involucrin 및 β-actin에 대한 1차 항체는 하기 표 3에 기재된 제품을 사용하였다.
항체 Catalog No. 제조사 희석(Dilution)
anti-Krt1 sc-65999 Santa cruz 1:2000
anti-Krt5 ab53121 abcam 1:2000
anti-Krt14 ab7800 abcam 1:1000
anti-Involucrin PRB-140C Biolegend 1:1000
anti-△Np63 ab203826 abcam 1:500
anti-Sox9 AB5535 Millipore 1:1000
aanti-β-actin 3700 CST 1:4000
PBS 및 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, β-actin의 발현과 비교분석하였다. 상기 웨스턴 블랏 측정 결과를 도 5c에 나타내었다.
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 동결보존 및 해동 후, 다시 배양한 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드가 동결 전과 동일한 분화 양상을 나타낸다는 것을 알 수 있으며, 도 5b에 나타난 바와 같이, 20번 계대배양(p.20) 또는 30번 계대배양(p.30)을 하더라도 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 가장자리 부분에서 기저 상피세포 관련 유전자인 시토케라틴 Krt5가 동결 전과 동일하게 발현한다는 것을 확인하였다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 20번 계대배양된 오가노이드 및 30번 계대배양된 오가노이드의 가장자리 부분에서 상피 및 모낭에서의 세포내 접착에 관여하는 E-cadherin이 발현되는 특성이 유지되는 것으로 나타났다. 더욱이, 계대배양 수가 증가하더라도 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 가운데 부분에는 케라틴 섬유에 결합하는 필라멘트 관련 유전자인 Filaggrin, 각질화된 상피세포 형성에 관여하는 마커인 Involucrin이 발현되는 특성이 동일하게 나타난다는 점을 확인하였다.
또한, 도 5c에 나타난 바와 같이, 계대 배양 수와 무관하게 상피 오가노이드의 기저 상피세포 관련 유전자인 Krt5, 모낭간 상피세포 관련 유전자인 Krt1, 상피세포 관련 유전자인 Krt14, 상피 줄기세포 관련 유전자인 Sox9, 각질화된 상피세포 형성에 관여하는 유전자인 Involucrin의 발현량이 일정한 것으로 나타났다.
종합하면, 계대배양된 상피 오가노이드가 동결 보존이 가능하며, 해동 후 계대배양하더라도 상피 오가노이드 특성을 유지한다는 점이 확인되었다.
실시예 3. 재조합 피부 표피 모델의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 상피 오가노이드를 3차원 피부 표피 모델로 제조할 수 있는지를 평가하였다. cell culture insert(24well, 0.4μm pore)를 collagen 1(5μg/cm2)로 실온에서 1시간 동안 코팅하고, 실시예 1에서 제조한 상피 오가노이드를 trypLE(Gibco)를 이용하여 37°C에서 15분간 단일세포화하여 얻은 세포 2.64x105개를 상기 코팅한 insert 위에 분주하였다. 분주된 세포를 5일 동안 배지(1.5mM CaCl2 및 50ug/ml 아스코르브산이 첨가된 EpiLife 배지)에서 배양하고, 14일간 ALI 배양법으로 배양하여 피부 표피 모델을 제조하였다.
제조된 피부 표피 모델이 화학물질 등의 피부 자극 여부를 평가하는데 유용하게 쓰일 수 있는 특성을 구비하는지 여부를 확인하기 위하여 제조된 표피조직 모델을 H&E 염색하여 각질층 및 상피층 형성 여부를 관찰한 결과를 도 6a에 나타내었다.
또한, 제조된 피부 표피 모델을 대상으로 실시예 1.3.에서 사용한 면역염색 방법으로 표피 조직 특이 마커(Krt5, Krt10, Krt1, Krt15, △Np63, Filaggrin, Sox9, Involucrin, Loricrin 및 E-cadherin)에 대한 면역염색을 하였다. DAPI 시약 및 면역염색시 사용한 항체는 실시예 1.3.에서 사용한 DAPI, 상기 표 2에 기재된 항체 및 anti-Krt15 항체(Santa cruz사, Catalog # sc-47697, 1:50 희석)를 사용하였다. 면역염색 결과를 도 6b에 나타내었다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 상피 오가노이드를 이용하여 제조한 3차원 피부 조직 모델은 각질층과 상피층을 구비한 것으로 확인되었다. 또한, 도 6b에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 상피 오가노이드를 이용하여 제조한 3차원 피부 조직 모델은 피부 각질 세포 관련 마커(Filaggrin, Involucrin, Loricrin, Krt10, Krt1) 및 피부 상피 세포 관련 마커(Krt5, Krt15, △Np63, Sox9, E-cadherin)를 모두 발현하는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 특성 확인
실시예 4.1. 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 분화 양상 확인
전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 기능성을 비교 검증하기 위해, 대조군인 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드를 제조하였다. 마우스의 각질형성세포를 분리한 후, 매트리겔에 접종하였으며 이후, 실시예 1.2.와 동일한 배지를 사용하여 배양하고 분화를 유도하였다.
상기 각질형성세포 유래 상피 오가노이드 및 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 구성하는 세포의 분화 양상을 명시야 현미경으로 촬영하여 도 7a에 나타내었다.
도 7a에 나타난 바와 같이, 명시야 현미경 관찰을 통해 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드가 각질형성세포 유래 상피 오가노이드와 유사한 분화 양상의 형태를 나타낸다는 것을 확인하였다.
이를 통해, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드는 기존의 각질형성세포 유래 상피 오가노이드와 유사한 분화 양상을 유지한다는 것을 확인하였다.
실시예 4.2. 면역염색을 통한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 유전자 발현 확인
전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 유전자 발현을 확인하기 위해, 상기 실시예 4.1.과 같은 방법으로 대조군인 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드를 제조하였다.
상기 각질형성세포 유래 상피 오가노이드 및 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 성장 정도를 비교 검증하기 위해, 상기 실시예 2.1.과 같은 방법으로 흡광도(450nm)를 측정하여 세포 성장률을 확인하였으며 이를 도 7b로 나타내었다.
상기 각질형성세포 유래 상피 오가노이드 및 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 유전자 발현을 비교 검증하기 위해, 상기 실시예 1.3.과 같은 방법으로 면역염색을 수행하여 표피 조직 특이 마커(Krt5, Krt10, Krt1, Krt14, △Np63, Filaggrin, Sox9, Involucrin, Loricrin 및 E-cadherin)에 대한 면역염색을 하였다. DAPI 및 면역염색시 사용한 항체는 실시예 1.3.에서 사용한 DAPI와 상기 표 2 및 실시예 2.2.의 면역염색시 사용한 항체를 사용하였다. 면역염색 결과를 도 7c 및 7d로 나타내었다.
도 7b에 나타난 바와 같이, 상기 각질형성세포 유래 상피 오가노이드가 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드와 유사한 세포 성장률을 보이는 것으로 나타났으며, 두 오가노이드의 세포성장률 차이가 통계적으로 유의미하지 않음을 확인하였다.
도 7c에 나타난 바와 같이, 면역염색을 통해 10번 계대배양한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드가 상피세포 관련 유전자인 Krt14, 기저 상피세포 관련 유전자인 Krt5, 모낭간 상피세포 관련 유전자인 Krt10, 케라틴 섬유에 결합하는 필라멘트 관련 유전자인 Filaggrin, 각질세포 보호 단백질인 Involucrin, 각질화된 상피세포 관련 유전자인 Loricin, 및 상피 줄기세포 관련 유전자인 p63 및 Sox9의 발현을 나타낸다는 것을 확인하였다.
반면에, 도 7d에 나타난 바와 같이, 각질형성세포 유래 상피 오가노이드는 상피 줄기세포 관련 유전자인 p63을 발현하지 않았으며, 계대배양수가 증가하면 오가노이드 표면의 상피세포 관련 유전자(E-cahderin), 각질세포 관련 유전자인 Involucrin, 모낭간 상피세포 관련 유전자인 Krt10 발현이 감소하였고, 20번 계대 배양시 관찰되었던 상피 줄기세포 유전자인 sox9 발현이 30번 계대 배양시에는 거의 관찰되지 않았다.
실시예 4.3. 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 상피 줄기세포 콜로니 형성능
전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서의 유전자 발현을 확인하기 위해, 상기 실시예 4.1.과 같은 방법으로 대조군인 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드를 제조하였다. 상기 각질형성세포 유래 상피 오가노이드 및 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서의 상피 줄기세포 콜로니 형성 능력을 비교 검증하기 위해, FACS 분석을 수행하였다.
각 오가노이드에서의 Itga6(integrin alpha 6) 및 Sca1이 모두 양성인 상피 줄기세포 집단을 정량화하기 위하여, 각질형성세포 유래 상피 오가노이드 및 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 각각 37℃에서 15분 동안 TrypLE(Gibco)를 사용하여 단일 세포로 분리한 다음, 30-㎛ 메쉬(Miltenyi Biotech; 130-098-458)를 통해 여과하였다. 단일 세포를 면역 염색 프로토콜에 따라 4% paraformaldehyde로 얼음에서 10분 고정한 후 1% FBS가 포함된 PBS를 이용하여 얼음에서 30분간 차단하였다. 단일 세포를 Itga6 특이적 항체(Invitrogen, 1:100) 및 ScaI 특이적 항체(Invitrogen, 1:100)로 염색한 후 BD Accuri™C6(BD Biosciences)로 분석하였다.
또한, 상기 각질형성세포 유래 상피 오가노이드 및 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서의 상피 줄기세포의 성장율 및 미분화능을 비교하기 위해, Colony formation assay를 수행하였다. 구체적으로, 각질형성세포 유래 상피 오가노이드 또는 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 TrypLE를 이용하여 37°C에서 15분간 단일세포화하였다. Mytomycin C로 세포분열을 정지시킨 NIH3T3 세포 위에 단일세포화된 오가노이드 세포를 각각 2500, 5000, 10000 개를 분주하고 14일간 배양하였다. 14일 배양이 종료된 이후 4% paraformaldehyde로 고정시키고 1% Rhodamin B 용액으로 염색하였다. Colony formation assay 결과를 도 8b에 나타내었다.
도 8a에 나타난 바와 같이, 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서 상피줄기세포 콜로니(즉, Itga6+Sca1+) 형성이 각질형성세포 유래 피부 상피 오가노이드 보다 약 1.5배 더 많은 것으로 확인되었다. 또한, 도 8b에 나타난 바와 같이, 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 상피 줄기세포 콜로니 형성능이 각질형성세포 유래 피부 상피 오가노이드보다 증대된 것으로 확인되었다.
실시예 5. 3D 배양방법을 이용한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 특성 확인
실시예 5.1. 웨스턴 블럿을 통한 3D 배양방법을 이용한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 특성 확인
매트리겔을 이용한 3D 배양방법의 기능성을 비교 검증하기 위해, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 및 기존 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드를 2D 배양방법으로 배양하여 대조군을 제작하였다.
구체적으로, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 및 기존 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드를 trypLE express(Gibco)로 처리한 후, 37℃에서 15분 동안 반응시켜 단일 세포로 해리하였다. 이후, 해리된 각각의 단일 세포 1×106 개를 콜라겐 I(Collagen I)을 처리한 60 ㎜ 배양 접시에 분주하고, 해당 배양 접시에 하이드로코르티손(Hydrocortisone), 트렌스페린(Transferrin), 에피네프린(Epinephrine), GA-1000(Gentamicin, Amphotericin-B), BPE(Barley Polyphenol Extract), 인간 상피세포 생장인자(hEGF, Human Epidermal Growth Factor) 및 인슐린(Insulin)을 포함하는 KBM-Gold keratinocyte 배지(Lonza)를 추가하여 배양하였다.
상기 2D 배양방법에 따라 배양된 상피 오가노이드를 1:3의 비율로 3일 마다 계대배양하였다.
또한, 3D 배양방법으로 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 및 기존 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드를 제작하였다. 구체적으로, 본원 명세서 도 1에 도시된 방법 중 세포 대 매트리겔을 1:5 내지 1:9의 비율로 희석하여 배양하는 방법을 통해 전분화능 줄기세포 및 각질형성 세포를 각각 상피 오가노이드로 분화시켰다.
각 배양방법으로 배양한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 및 기존 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드를 웨스턴블랏(실시예 2.2.에서 사용한 웨스턴블랏과 동일한 방법)을 통해 비교 검증하였다. 이때, involucrin, Sox9, β-actin에 대한 1차 항체는 상기 표 3에 기재된 항체를 사용하였고, Krt10, Krt15, CD34, p63, p75 및 E-cadherin에 대한 1차 항체는 하기 표 4에 기재된 항체를 사용하였다.
항체 Catalog No. 제조사 희석(Dilution)
anti-Krt10 sc-23877 Santa cruz 1:100
anti-Krt15 sc-47697 Santa cruz 1:100
anti-CD34 553731 BD 1:500
anti-p63 4892 CST 1:500
anti-p75 8238 CST 1:1000
anti-E-cadherin 610181 BD 1:1000
상기 웨스턴 블랏 측정 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 2D 배양방법의 경우 매트리겔을 이용한 3D 배양방법에 비해 세포 표면 단백질인 E-cadherin의 발현이 증가되지만, 각질세포 보호 단백질인 Involucrin, 모낭간 상피세포 관련 유전자인 Krt10, 모낭 줄기세포 관련 유전자인 p75, 상피 줄기세포 관련 유전자인 p63, CD34, Sox9 및 Krt15의 발현이 저해되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 기존 2D 배양방법을 통해 얻어진 상피 오가노이드에 비해 매트리겔을 이용한 3D 배양방법을 통해 얻어진 상피 오가노이드가 피부 조직의 주요 세포인 모낭 줄기세포, 상피 줄기세포 관련 특이 마커를 더 잘 발현한다는 것을 확인하였다.
실시예 5.2. 면역염색을 통한 2D 배양방법을 이용한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 특성 확인
2D 배양방법을 이용한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 유전자 발현 확인하기 위해, 상기 실시예 5.1.과 같은 방법으로 배양하여 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 제조하였다.
2D 배양방법으로 배양한 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에 상기 실시예 1.3에 기재된 면역염색 방법으로 하기 표 5에 기재된 항체를 이용하여 CD34, p63, Krt5, Krt15, Krt14, Involucrin, Nftac1 및 Sox9 유전자 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
항체 Catalog No. 제조사 희석(Dilution)
anti-CD34 553731 BD 1:50
anti-p63 4892 CST 1:100
anti-Krt5 ab53121 abcam 1:400
anti-Krt15 sc-47697 santa cruz 1:50
anti-Krt14 ab7800 abcam 1:400
anti-Involucrin PRB-140C Biolegend 1:200
anti-Nfatc1 MA3-024 Thermo 1:100
anti-Sox9 AB5535 Millipore 1:200
도 10에 나타난 바와 같이, 2D 배양방법의 경우 상피세포 관련 유전자인 Krt14, 기저 상피세포 관련 유전자인 Krt5, 각질세포 보호 단백질인 Involucrin은 발현되었으나, 상피 줄기세포 관련 유전자인 Krt15, Nfatc1, CD34, p63 및 Sox9은 거의 발현되지 않는다는 것을 확인하였다.
이를 통해, 기존 2D 배양방법을 통해 얻어진 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서는 피부 조직의 주요 세포인 상피 줄기세포 관련 특이 마커가 잘 발현되지 않는다는 것을 확인하였다.
실시예 5.3. 2D 배양방법을 통해 얻은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 특성
2D 배양방법을 통해 얻은 각질형성세포 유래의 상피 오가노이드 대비, 상기 실시예 5.2.에서 얻은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 유전자 발현 측면에서의 차이를 확인하기 위해, 상기 실시예 1.2.의 qPCR과 동일한 방법으로 qPCR을 실시하되 Krt15에 대한 프라이머로서 하기 표 6에 기재된 프라이머를 사용하고 Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin 및 p63에 대한 프라이머로서 표 1의 프라이머를 사용하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
Krt15 F GTGGTTTTGGTGGAGGCTTT 서열번호 19
R TCTTCACCTCCAGCTCAGTG 서열번호 20
도 11에 나타난 바와 같이, 유도만능 줄기세포에서는 상피세포 관련 유전자 발현이 거의 나타나지 않았다. 또한, 2D 배양을 통해 얻은 각질형성세포 유래 상피 오가노이드와 2D 배양방법을 통해 얻은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드는 유도만능 줄기세포 대비 기저 상피세포 관련 유전자인 Krt5 및 상피세포 관련 유전자인 Krt14 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 반면에, 유도만능 줄기세포 대비 3D 배양방법을 통해 얻은 전분화능 줄기세포 유래 상피오가노이드에서 유전자 발현이 증가하는 것으로 도 2b에서 확인된 유전자(p63, Krt15, Krt10, Filaggrin 및 Loricrin)는 2D 배양방법을 통해 얻은 전분화능 줄기세포 유래 오가노이드에서는 그 유전자 발현이 거의 증가하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 2D 배양방법을 통해 얻은 각질형성세포 유래 상피 오가노이드보다 2D 배양방법을 통해 얻은 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서 상피 줄기세포 관련 유전자인 p63 발현이 더 증가되어 있는 것으로 나타났다.
실시예 6. 유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드의 피부 모델 플랫폼으로서의 효능
유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드가 피부암, 노화 등의 피부건강과 연관된 것으로 알려진 자외선(Ultra Violet B; UVB, 320-280nm)에 반응하는 피부 모델의 플랫폼으로 활용될 수 있는지 확인하기 위하여 피부 모델을 제작하였다.
유도만능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 TrypLE를 이용하여 37°C에서 15분간 단일세포화 하였다. 단일세포화된 오가노이드 세포 1x104개를 90% 매트리겔 10μl에 분주하였으며 37°C에서 30분간 정치한 뒤 7일 동안 배양하여 피부 모델을 제작하였다. UVB 광선을 각각 0, 25, 50, 100, 200 mJ/cm2로 조사하고 24시간 뒤에, 피부모델인 상피 오가노이드의 형태적 변화를 명시야 현미경으로 관찰한 결과를 도 12에 나타내었다.
또한, UVB 광선을 조사하고 24시간 뒤 각 오가노이드를 대상으로 상기 실시예 1.2.의 qPCR과 동일한 방법으로 qPCR을 실시하여 p53, p21, p16, ki67, delta-Np63, Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Involucrin 및 Loricrin 발현량을 측정한 결과를 도 13에 나타내었다. qPCR을 위해 사용한 프라이머는 표 1에 기재된 Krt5, Krt14, Krt10 및 Loricrin에 대한 프라이머와 하기 표 7에 기재된 프라이머이다.
p53 F tgaaccgcccacctatcctt 서열번호 21
R ggcacaaacacgaacctcaa 서열번호 22
p21 F GAGCAAAGTGTGCCGTTGTCTCTT 서열번호 23
R AGAGGAAGTACTGGGCCTCTTGT 서열번호 24
p16 F GCGGACTCCATGCTGCTC 서열번호 25
R CACGACTGGGCGATTGGG 서열번호 26
ki67 F CCAGCTGCCTGTAGTGTCAA 서열번호 27
R TCTTGAGGCTCGCCTTGATG 서열번호 28
delta-Np63 F TGTACCTGGAAAACAATGCCCA 서열번호 29
R GACGAGGAGCCGTTCTGAATCT 서열번호 30
Krt1 F TTGGTAGTATGGGGCCTGTC 서열번호 31
R GCACCTGGTTTTGTTGCTCT 서열번호 32
Involucrin F CCAAACATGAGGAGAAGCGG 서열번호 33
R TGTTGTTGTTCCAGGCACAG 서열번호 34
또한, 표 2에 기재된 3종의 항체(anti-Krt5 항체, anti-Krt10 항체 및 anti-involucrin 항체), anti-Ki67 항체(abcam사, Catalog # ab15580, 1:200 희석), anti-E-cahderin 항체(BD사, Catalog # 610181, 1:200 희석) 및 anti-cleaved caspase 3 항체(CST사, catolog #9664, 1:200 희석)를 사용하여 실시예 1.3.의 면역염색과 동일한 방법으로 면역염색을 실시한 결과를 도 14에 나타내었다.
나아가, UVB 광선 조사 이후 24시간이 지난 시점에, 개별 상피 오가노이드를 대상으로 웨스턴블랏을 실시하였다. 이때, 하기 표 8에 기재된 항체를 사용하여 실시예 2.2.의 웨스턴블랏과 동일한 웨스턴블랏을 수행하고, 웨스턴블랏 측정결과를 도 15에 나타내었다.
항체 Catalog No. 제조사 희석(Dilution)
anti-Krt1 sc-65999 Santa cruz 1:2000
anti-Krt5 ab53121 abcam 1:2000
anti-△Np63 ab203826 abcam 1:500
anti- phospho-p53(S15) 9284 CST 1:500
anti-β-actin 3700 CST 1:4000
anti-gammaH2A.X 9718 CST 1:1000
anti-cleaved caspase 3 9664 CST 1:1000
도 12에 나타난 바와 같이, UVB 조사량이 증가할수록 상피 오가노이드의 크기가 감소하고, 상피 오가노이드 구조 형태를 유지하기 어려운 것으로 확인되었다.
도 13에 나타난 바와 같이, UVB 조사 세기가 증가함에 따라 세포 노화 마커 (p53, p21, p16) 발현이 증가하고 세포 성장 마커(Ki67) 발현은 감소하며, 상피 세포 마커(p63, Krt5, Krt14)의 발현은 감소하지만 상피세포 분화에 관여하는 마커(Krt1 및 Krt10) 및 각질화된 상피세포 형성에 관여하는 마커(Involucrin 및 Loricrin)의 발현은 증가하는 점이 확인되었다.
도 14에 나타난 바와 같이, UVB 조사량이 증가할수록 상피 오가노이드 내부의 각질화된 내부 코어(inner core)가 증가하여 상피세포 분화마커(Krt10) 및 각질화된 상피세포 형성 마커(Involucrin)의 발현 부위가 증가하는 것으로 나타났고, 세포 사멸 마커(cleaved caspase3)의 발현 증가와 세포 성장 마커(ki67)의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
또한, 도 15에 나타난 바와 같이, UVB 조사 세기가 증가할수록 DNA 손상 마커(phospho-p53(S15) 및 phsopho-gammaH2A.X)가 활성화되는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 상피 오가노이드를 이용하여 제조한 피부 모델은 광선 자극에 의한 피부 노화를 모사하는 능력이 우수하여, 광자극에 의한 피부 손상, 피부 노화, 피부암 등의 피부 질환을 치료하거나 이를 개선하는 후보 약물의 스크리닝에 활용가능하다는 점이 확인되었다.

Claims (16)

  1. i) 전분화능 줄기세포를 분화배지에서 배양하여 상피 전구세포로 분화시키는 단계; 및
    ii) 상기 분화시킨 상피 전구세포를 성숙화 배지 1에서 배양하고 이어서 그 배양한 세포를 성숙화 배지 2에서 배양하여 세포를 안정적으로 증식하고 성숙시키는 단계를 포함하는, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포인, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 i) 단계의 분화배지는 GMEM(Glasgow Modified Essential Medium), KSR(knock-out serum replacement), 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 비필수아미노산(NEAA, Non-Essential Amino Acid) 및 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함하는, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 i) 단계에서 전분화능 줄기세포가 스페로이드(spheroid)를 형성하면 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)을 처리하는, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 i) 단계에서 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)을 처리하는 단계 후, TGF-β(transforming growth factor-beta) 억제제 및 BMP-4(Bone morphogenetic protein-4)를 처리하여 비신경 외배엽으로 분화시킨 후,
    BMP 억제제(BMP inhibitor) 및 FGF-2를 처리하여 상피 전구세포로 분화시키는, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 i) 단계의 배양은 5일 내지 10일 동안 수행되는 것인, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 ii) 단계의 배양은 상피 전구세포를 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)과 1:0.5 내지 1:5 비율로 혼합하여 트랜스웰에서 생체 내 피부 상호작용을 모사하는 배양 환경에서 수행되는 것인, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 ii) 단계의 성숙화 배지 1은 DMEM/F-12, N2 supplement, Glutamax, FBS 및 Rho 카이네즈 억제제(Rho kinase inhibitor)를 포함하고,
    상기 ii) 단계의 성숙화 배지 2는 FBS 및 Rho 카이네즈 억제제를 포함하지 않으며, DMEM/F-12, N2 supplement 및 Glutamax를 포함하는 것인, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 ii) 단계의 성숙화 배지 1에서의 배양은 1일 내지 3일 동안 수행되고, 성숙화 배지 2에서의 배양은 6일 내지 12일 동안 수행되는 것인, 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드 제조방법.
  10. 제1항의 제조방법으로 제조된 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드.
  11. Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin, Involucrin, Sox9, CD34, p75 및 Itga6에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드.
  12. 제1항의 제조방법으로 제조된 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드이거나, 또는
    Krt1, Krt5, Krt10, Krt14, Filaggrin, Loricrin, Involucrin, Sox9, CD34, p75 및 Itga6에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에서 유래한 것을 특징으로 하는 생체외 피부 질환을 모사하는 피부 모델.
  13. 제10항 또는 제11항의 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드를 GFR(growth factor reduced) 매트리겔(matrigel)과 1:5 내지 1:15 비율로 혼합하여 증식용 배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는, 상피 오가노이드의 증식방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 계대배양은 2일차까지는 Rho 카이네즈 억제제(Rho kinase inhibitor) 존재하에 증식용 배지에서 배양하며, 이후부터는 Rho 카이네즈 억제제가 존재하지 않는 증식용 배지에서 배양하고, 상기 증식용 배지는 DMEM/F-12, Hepes, Glutamax, B27 supplement, N-Acetylcysteine-1, Heparin, Noggin, R-spondin 1, acidic FGF1 및 Forskolin를 포함하는 것인, 상피 오가노이드의 증식방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 상피 오가노이드는 동결보존이 가능하고, 해동 후 계대배양시 동결 전과 동일하게 Krt5, Krt1, Krt14, Sox9 및 Involucrin에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 유지되는 것을 특징으로 하는 것인, 상피 오가노이드의 증식방법.
  16. 제10항 또는 제11항의 전분화능 줄기세포 유래 상피 오가노이드에 피부 질환 치료 후보 약물을 접촉시키는 단계; 및
    상기 피부 질환 치료 후보 약물이 처리된 오가노이드의 유전적 변이를, 상기 피부 질환 치료 약물이 처리되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 생체 외에서 피부 질환 치료 후보 약물을 스크리닝하는 방법.

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