WO2020250913A1

WO2020250913A1 - 腎間質細胞の製造方法

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Publication number: WO2020250913A1
Application number: PCT/JP2020/022769
Authority: WO
Inventors: 真池谷; 大介上谷
Original assignee: 国立大学法人京都大学; 武田薬品工業株式会社
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2020-12-17
Also published as: EP3985104A1; US20220313733A1; JPWO2020250913A1; TW202113062A; EP3985104A4

Abstract

腎間質細胞を供給するための技術として、血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程（３）を含む、腎間質細胞の製造方法を提供する。この製造方法は、神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）と、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、およびレチノイン酸および／またはその誘導体を含む培地で多能性幹細胞を培養し神経堤細胞を誘導する工程（１）をさらに含むことができる。

Description

腎間質細胞の製造方法

　本発明は、腎間質細胞の製造のための方法および培地ならびに腎間質細胞を用いた腎臓オルガノイドの製造方法に関する。

［発明の背景］
　慢性腎臓病および急性腎疾患などによって引き起こされる腎線維化は、著しい腎機能の低下を伴い、患者に透析導入あるいは腎移植の必要をもたらす。近年、エリスロポエチン（EPO）産生細胞および線維芽細胞等の腎間質細胞（Renal stromal cell: RSC）が、腎線維化に関与していることが明らかになっている。腎間質細胞を用いた試験系は、腎線維化の機序を解明し、予防法および治療法を確立するために有用と考えられる。

　非特許文献１には、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell: iPSC）からEPO産生細胞を誘導したことが記載されている。この誘導方法はactivin A、CHIR99021（GSK3β阻害剤）およびY-27632（ROCK阻害剤）を含む培地でiPSCを培養する工程等を含む。非特許文献１に記載される方法で得られるEPO産生細胞は、肝細胞系列（Hepatic lineage）であり、腎間質細胞とは異なる。
　また、非特許文献２は、iPSCから腎前駆細胞（Renal progenitors）を誘導したことを記載している。この誘導方法は、activin AおよびCHIR99021（GSK3β阻害剤）を含む培地でiPSCを培養する工程等を含む。
　iPSC等の多能性幹細胞から腎間質細胞をin vitroで誘導するための技術はいまだ報告されていない。

"Human pluripotent stem cell-derived erythropoietin-producing cells ameliorate renal anemia in mice", Science Translational Medicine, 2017, Vol. 9, Issue 409, eaaj2300 "Cell Therapy Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Renal Progenitors Ameliorates Acute Kidney Injury in Mice", STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE 2015;4:980-992 "Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease", Nature, 2016, 531, 105-109 "Derivation of mesenchymal stromal cells from pluripotent stem cells through a neural crest lineage using small molecule compounds with defined media", PLoS One, 2014, 9, 12 "A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells", Scientific Reports, 2014, 4, 3594 "Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells", Nature Protocols volume 2016, 11, 1681-1692 "Making a Kidney Organoid Using the Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells", Methods in Molecular Biology, 2017, 1597, 195-206

　腎間質細胞を用いた試験系の構築等のため、腎間質細胞を供給するための技術が求められている。

　上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］～［３１］を提供する。
［１］　血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程（３）を含む、腎間質細胞の製造方法。
［２］　前記培地が、さらに塩基性線維芽細胞成長因子および／または線維芽細胞成長因子９を含む、［１］の製造方法。
［３］　神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）をさらに含む、［１］または［２］の製造方法。
［４］　ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ならびにレチノイン酸および／またはその誘導体を含む培地で多能性幹細胞を培養し神経堤細胞を誘導する工程（１）をさらに含む、［１］－［３］のいずれかの製造方法。
［４ａ］　前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、［４］の製造方法。
［４ｂ］　ＧＳＫ３β阻害剤が、CHIR98014（N6-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1H-imidazol-1-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]-3-nitro-2,6-Pyridinediamine）である、［４］または［４ａ］の製造方法。
［４ｃ］　ＴＧＦβ阻害剤が、SB431542（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide）である、［４］－［４ｂ］のいずれかの製造方法。
［５］　前記神経堤細胞が、後脳神経堤細胞である、［３］－［４ｃ］のいずれかの製造方法。
［６］　前記腎間質細胞が、低酸素条件下でエリスロポエチンを産生する、［１］－［５］のいずれかの製造方法。
［７］　前記血小板由来成長因子受容体アゴニストが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、［１］－［６］のいずれかの製造方法。

［８］　血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む、腎間質細胞製造用培地。
［９］　塩基性線維芽細胞成長因子および／または線維芽細胞成長因子９をさらに含む、［８］の培地。
［１０］　前記血小板由来成長因子受容体アゴニストが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、［８］または［９］の培地。

［１１］　腎間質細胞または腎間質前駆細胞と、中間中胚葉と、を共培養する工程を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。
［１２］　腎間質細胞または腎間質前駆細胞が、血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程（３）を含む、腎間質細胞の製造方法で得られるもの、または、神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）で得られるものである、［１１］の製造方法。

［１３］　腎線維症の予防または治療のための物質のスクリーニング方法であって、
［１］－［７］のいずれの製造方法により得られた腎間質細胞を、該細胞の線維化を誘導する物質の存在下で培養し、線維化腎間質細胞を含む細胞集団を提供する手順と、
被験物質の存在下および非存在下で前記細胞集団を培養する手順と、
各前記細胞集団における細胞の線維化の程度を測定する手順と、
前記被験物質の存在下で培養した細胞集団において、前記被験物質の非存在下で培養した細胞集団に比して細胞の線維化の程度を低下させた被験物質を選択する手順と、
を含む、方法。
［１３ａ］　線維化を誘導する物質が、ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）である、［１３］の方法。

［１４］　腎線維症のバイオマーカーを決定する方法であって、
［１］－［７］のいずれかの製造方法により得られた腎間質細胞を、該細胞の線維化を誘導する物質の存在下で培養し、線維化腎間質細胞を含む細胞集団を提供する手順と、
前記細胞集団の培養液中に含まれる物質を同定する工程と、
同定された物質と、腎線維症に罹患した哺乳動物の体液中に含まれる物質と、を比較して、一致する物質を特定する手順と、
を含む、方法。
［１４ａ］　線維化を誘導する物質が、ＴＧＦβである、［１４］の方法。

［１５］　腎間質前駆細胞を含有してなる、腎障害の予防または治療のための医薬の製造方法であって、神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）を含む、製造方法。
［１６］　腎間質細胞を含有してなる、腎障害の予防または治療のための医薬の製造方法であって、血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程（３）を含む、製造方法。
［１７］　ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ならびにレチノイン酸および／またはその誘導体を含む培地で多能性幹細胞を培養し神経堤細胞を誘導する工程（１）をさらに含む、［１５］または［１６］の製造方法。
［１８］　多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞を含む医薬。
［１８ａ］　腎障害の予防または治療のための、［１８］の医薬。
［１９］　多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞を含む、腎障害の予防剤または治療剤。
［２０］　多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞を対象に投与する手順を含む、腎障害の予防または治療方法。
［２１］　腎障害の予防または治療に使用するための、多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞。
［２２］　腎障害の予防または治療のための医薬の製造のための、多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞の使用。

［２３］　血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して得られる腎間質細胞。
［２３ａ］　前記血小板由来成長因子受容体アゴニストが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、［２３］の腎間質細胞。
［２３ｂ］　前記培地が、さらに塩基性線維芽細胞成長因子および／または線維芽細胞成長因子９を含む、［２３］または［２３ａ］の腎間質細胞。
［２３ｃ］　CD73およびPDGFRβを発現し、低酸素条件下でエリスロポエチンを産生する、［２３］－［２３ｂ］のいずれかの腎間質細胞。
［２３ｄ］　DesminおよびVimentinをさらに発現する、［２３ｃ］の腎間質細胞。
［２４］　StemPro（登録商標）MSC SFM Xenofreeを含む培地で神経堤細胞を培養して得られる腎間質前駆細胞。
［２４ａ］　FOXD1、CD73およびPDGFRβを発現し、エリスロポエチンを産生しない、［２４］の腎間質前駆細胞。
［２５］　［２３］－［２４ａ］のいずれかの腎間質細胞および／または腎間質前駆細胞を含む、腎臓オルガノイド。
［２６］　血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む、腎間質細胞分化誘導剤。
［２６ａ］　前記血小板由来成長因子受容体アゴニストが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、［２６］の腎間質細胞分化誘導剤。
［２７］　人工多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞。
［２８］　神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）を含む、腎間質前駆細胞の製造方法。
［２９］　人工多能性幹細胞由来腎間質細胞。
［３０］　STEMdiff APEL2培地（STEMCELL Technologies、ST-05275）を含む、腎間質細胞分化誘導剤。
［３１］　STEMdiff APEL2培地（STEMCELL Technologies、ST-05275）で腎間質前駆細胞を培養する工程を含む、腎間質細胞の製造方法。

［定義］
　本発明において、「血小板由来成長因子受容体アゴニスト」とは、血小板由来成長因子受容体（Platelet derived growth factor receptor (PDGFR)）に結合し、該受容体のリン酸化を起点としたシグナル伝達を媒介し得る物質を意味する。
　「血小板由来成長因子受容体（Platelet derived growth factor receptor (PDGFR)」には、PDGFRαおよびPDGFRβの二種類のサブタイプが存在する。PDGFRは、血小板由来成長因子（Platelet derived growth factor (PDGF)）等のリガンドとの結合によって二量体を形成し、該二量体には、PDGFR-αα、PDGFR-αβ、PDGFR-ββの三種類の組み合わせが存在する。リガンドがPDGFRに結合することによりPDGFRのチロシン残基が自己リン酸化を受け、SH2ドメインを有するシグナル伝達分子（PLC-γ、Grb2、PI3Kなど）との結合部位となり、下流へシグナルが伝達される。
　血小板由来成長因子受容体アゴニストは、抗体、ペプチド、低分子化合物等であってよく、好ましくはPDGFである。

「腎間質細胞（Renal Stromal Cell: RSC）」とは、CD73陽性かつPDFGRβ陽性の細胞であり、エリスロポエチン（以下、本明細書において「EPO」と称する。特に断りのない限り「EPO」はエリスロポエチンタンパク質を意味する。）を産生することができる。

　腎間質細胞の「線維化」とは、αSMA陽性ではなかった腎間質細胞が、αSMA陽性の細胞となることを意味する。また、腎間質細胞がαSMA陽性となることは、それらが筋線維芽細胞（myofibroblast）に分化することを意味する。当該分化は、腎間質細胞のTGFβ1刺激により誘導することができる。当該分化は、細胞の肥大化を伴う場合がある。筋線維芽細胞は、αSMA陽性である。

　「腎間質前駆細胞（Renal Stromal Precursor: RSP）」とは、FOXD1陽性、CD73陽性かつPDGFRβ陽性の細胞であり、EPOを産生しない。

　「神経堤細胞（Neural Crest Cell: NCC）」とは、発生初期において神経板から神経管が形成される際に神経外胚葉と表皮外胚葉の間から発生する細胞であり、神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞および色素細胞などの多くの種類の細胞へ分化する多能性（multipotency）と自己増殖能とを有する。神経堤細胞は、SOX10陽性である。

　「後脳神経堤細胞（hindbrain NCC: hNCC）」とは、後方化されたNCCであり、神経堤細胞マーカーであるSOX10陽性、NGFR陽性、HOXB4陽性、エリスロポエチン（EPO）陽性である。
　「後方化」とは、発生期における体軸の頭尾（Anterior-Posterior Axis）を、より尾側（Posterior）にすることであり、本発明においては、多能性幹細胞から分化する中脳神経堤細胞（midbrain NCC）を後脳神経堤細胞（hindbrain NCC）に誘導することをいう。

　「中間中胚葉（intermediate mesoderm）」とは、個体の発生において、中胚葉から発生する胚の一種であり、前腎、中腎、中腎管、後腎、副腎皮質および生殖腺へ分化し得る細胞であり、OSR1（odd-skipped related 1）陽性である。

　「腎臓オルガノイド」とは、生体内の腎臓組織を構成する、少なくとも1種以上の細胞集団を含む3次元構造体である。

　「TGFβ阻害剤」とは、TGFβ（トランスフォーミング増殖因子β）に対する阻害活性を有する物質である。TGFβは2種類のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ型受容体に結合するサイトカインであり、Smad（R-Smad）の活性化を主としたシグナル伝達を介して細胞増殖、細胞分化および細胞死などを制御する。TGFβ阻害活性を有する物質としては、TGFβとその受容体の結合を阻害する物質、または、TGFβが受容体に結合後の下流シグナルを阻害する物質が挙げられる。当該下流シグナルとしては、TGFβII型受容体によるTGFβI型受容体のリン酸化、リン酸化TGFβI型受容体によるSmadのリン酸化などが例示される。本発明で用いられる「TGFβ阻害剤」はTGFβ阻害活性を有すれば特に限定されない。

　「GSK3β阻害剤」とは、GSK3β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β）に対する阻害活性を有する物質である。GSK3（グリコーゲンシンターゼキナーゼ3）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。GSK3にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「GSK3β阻害剤」は、GSK3β阻害活性を有すれば特に限定されず、GSK3β阻害活性と合わせてGSK3α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。

　「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、増殖させ（成長させ）、かつ／または分化させることを指す。「培養する」とは、組織外または体外で、例えば、細胞培養ディッシュまたはフラスコ中で細胞を維持し、増殖させ（成長させ）、かつ／または分化させることを意味する。
　「細胞集団」とは、同じ種類または異なる種類の２以上細胞を意味する。「細胞集団（population）」は、同じ種類または異なる種類の細胞の一塊（mass）をも意味する。

　「接着培養」とは、細胞を容器に付着させた状態、例えば適切な培地の存在下で細胞を滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュまたはフラスコに付着させた状態、で培養することを意味する。
　「浮遊培養」とは、細胞を容器に付着させずに適切な培地中に分散させた状態で培養することを意味する。
　「維持培養（Sustain）」とは、所望の細胞集団をそれらの数を維持しながら培養することを意味する。細胞数の維持は、細胞が増殖することなく生存することにより達せられるものであっても、細胞の増殖による増数と死滅による減数とが拮抗することによって達せされるものであってもよい。細胞数の維持は、細胞の数が完全に同一に維持される必要はなく、本発明の目的に照らして細胞の数が実質的に同一に維持されればよい。
　「拡大培養（Expand)」とは、所望の細胞集団を増殖させ、細胞数を増加させることを目的として培養することを意味する。細胞数の増加は、細胞の増殖による増数が死滅による減数を超えることによって達成されるものであればよく、細胞集団の全て細胞が増殖することを要さない。細胞数の増加は、拡大培養の開始前に比して1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍以上でありうる。

　「多能性（pluripotency）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（pluripotency）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（totipotency）」とは区別される。

　「多能性（multipotency）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はmultipotentだが、pluripotentではない。ENPは、神経細胞およびグリア細胞へ分化する多能性（multipotency）を有する。

　「マーカー」とは、「マーカータンパク質」または「マーカー遺伝子」であって、所定の細胞型において細胞表面、細胞質内および／または核内等に特異的に発現されるタンパク質またはその遺伝子を意味する。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、特に細胞表面陽性選択マーカーによれば、生存細胞の濃縮、単離、および／または検出が実施可能となる。
　マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーなどを利用して行うことができる。マーカータンパク質に特異的な抗体としては、マーカータンパク質における特定のアミノ酸配列またはマーカータンパク質に結合した特定の糖鎖等に結合する抗体を用いることができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないマーカータンパク質（例えば転写因子またはそのサブユニットなど）の場合は、当該マーカータンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするマーカータンパク質を検出できる（例えば、非特許文献４）。この方法は、適当な細胞表面マーカーが認められない場合に好ましく用いられ得る。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法および／または核酸検出方法、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップおよびRNAseq等を利用して行うことができる。

　「発現（expression）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
　「陽性（positive）」または「発現する」とは、タンパク質または遺伝子が当該分野で公知の手法による検出可能量で発現していることを意味する。タンパク質の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質（例えば転写因子またはそのサブユニットなど）の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。遺伝子の検出は、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップおよびRNAseq等の核酸増幅方法および／または核酸検出方法を利用して行うことができる。
　「陰性（negative）」または「発現されない」とは、タンパク質または遺伝子の発現量が、上記のような公知手法の全てあるいはいずれかによる検出下限値未満であることを意味する。タンパク質または遺伝子の発現の検出下限値は、各手法により異なりえる。

　「エリスロポエチン（Erythropoietin）」（以下、本明細書において、「EPO」と称することがある。また、「EPO」は、特に断りのない限り、エリスロポエチンタンパク質を意味する。）は、赤血球の産生を促進する造血因子の一つであり、165アミノ酸から構成される。分子量は約34000である。EPOは、胎児および新生児期においては肝臓細胞から分泌されるが、妊娠後期から成人期には腎間質細胞から分泌される（非特許文献１）。
　「CD73」は、5’-nucleotidase (5’-NT)とも称され、NT5E遺伝子によってコードされる膜タンパク質である。70kDaのサブユニットが二量体を形成してGPIにアンカーされ、細胞表面に存在している。CD73は主に間葉系幹細胞に発現しており、T細胞やB細胞などの免疫系の細胞や、上皮細胞および内皮細胞の一部にも発現が認められる。5'-ヌクレオチダーゼの酵素活性を有し、プリンおよびピリミジンのリボ・デオキシリボヌクレオシド一リン酸の対応するヌクレオシドへの脱リン酸化を触媒する。
　「デスミン（Desmin）」は、細胞質内のタンパク質性の線維系の一つである中間径フィラメントクラスIIIに属するタンパク質である。筋細胞等において構造的完全性と生存に必須の因子である。
　「ビメチン（Vimentin）」は、細胞質内のタンパク質性の線維系の一つである中間径フィラメントクラスIIIに属するタンパク質であり、線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、骨・軟骨細胞、神経鞘細胞などの間葉系細胞で発現する。
　「Forkhead box D: FOXD1」は、リプログラミング制御因子の一つであり、リプログラミングが進んだ細胞において発現が上昇する時期特異的なマーカーである。多能性幹細胞では発現していない。
　「SOX10」は、全ての神経堤細胞で発現が認められる。一方、SOX10は、腎間質前駆細胞および腎間質細胞では発現されない。
　「神経成長因子受容体（Nerve growth factor receptor : NGFR）」は、神経成長因子（Nerve growth factor : NGF）が結合する受容体である。
　「HOXB4」は、Antpホメオボックスタンパク質一つであり、ホメオボックスB遺伝子クラスター内のHOXB4遺伝子によってコードされる。HOXB4タンパク質はホメオボックスDNA結合領域を有し、個体発生時に特異的な転写因子として機能する。
　「Neural EGFL Like 2 : NELL2」は、epidermal growth factor（EGF）様リピートを有するプロテインキナーゼC結合タンパクであり、生体内においては中枢神経における発現が高く、腎間質細胞を含む種々の間質細胞の細胞質内にも発現する。
　「Paired box protein-7 : PAX7」は、神経堤の発生と分化に必要な転写因子であり、同じく神経堤の発生と分化に必要なPAX3とヘテロダイマーを形成してDNAに結合する。生体では筋衛星細胞や腎間質細胞にも発現する。
　「Nik Related Kinase : NRK」は、Serine/Threonine kinaseの一つであり、TNF-JNK signaling pathwayのリン酸化に機能する。遺伝子はX染色体に存在し、生体では精巣や卵巣などの生殖器や腎間質細胞にも発現する。

　「～を含む（comprise(s)またはcomprising）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。

　「約」または「およそ」とは、基準値に対してプラスまたはマイナスそれぞれ30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%または1%まで変動する値を示す。好ましくは、「約」または「およそ」という用語は、基準値に対してプラスまたはマイナスそれぞれ15%、10%、5%、または1%の範囲を示す。

　本発明により、腎間質細胞を供給するための技術が提供される。

人工多能性幹細胞から誘導した神経堤細胞におけるEPOとSOX10の発現を示す免疫組織化学染色像である。 RA濃度を0μM(-)、1μM(low)および3μM(high)とした場合の、各培養日数における神経堤細胞から培地中へ分泌されたEPOの蓄積量を測定した結果を示すグラフである。縦軸はEPO濃度（mIU/ml）を示す。横軸は培養日数（Day 6-21）を示し、「iPSC」は陰性コントロールとしての人工多能性幹細胞での測定値を示す。後方化した神経堤細胞を低酸素刺激（FG2216またはFG4592）してEPO分泌量を測定した結果を示すグラフである。縦軸はEPO濃度（mIU/ml）を示す。人工多能性幹細胞から誘導した後脳神経堤細胞におけるHOXB4の発現量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、後脳神経堤細胞におけるHOXB4の発現量を、人工多能性幹細胞株（「iPSC」）の発現量を１とした相対値により示す。横軸はレチノイン酸の濃度を示す。 RA濃度を0-10 μMとした場合の、後脳神経堤細胞から培地中へ分泌されたEPOの蓄積量を測定した結果を示すグラフである。縦軸はEPO濃度（mIU/ml）を示す。横軸はレチノイン酸の濃度を示す。「iPSC」は陰性コントロールとしての人工多能性幹細胞での測定値を示す。 EPO-emGFPノックインヒト人工多能性幹細胞株（「iPSC」）、ソートティング前の後脳神経堤細胞（「not sort」）、GFP陰性後脳神経堤細胞（「GFP- sort」）およびGFP陽性後脳神経堤細胞（「GFP+ sort」）における、EPO mRNA発現量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、EPO mRNA発現量を、EPO-emGFPノックインヒト人工多能性幹細胞株（「iPSC」）の発現量を１とした相対値により示す。後脳神経堤細胞（「NCC D18」）、腎間質前駆細胞（「RSP D39」）、腎間質細胞（「APEL D15」）および低酸素刺激した腎間質細胞（「+FG4592」）における、EPO mRNA発現量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、EPO mRNA発現量を、EPO-emGFPノックインヒト人工多能性幹細胞株（「iPSC」）の発現量を１とした相対値により示す。腎間質前駆細胞から誘導した腎間質細胞における低酸素応答性のEPOタンパク質の発現を示す免疫組織化学染色像である。赤色がEPOタンパク質を、青色が細胞核をそれぞれ示す。 bFGF, FGF9およびPDGF-BBの存在下で誘導した腎間質細胞の細胞増殖（Ａ）とEPO分泌量（Ｂ）の測定結果を示すグラフである。低酸素刺激した腎間質細胞の腎間質細胞マーカー（Desmin, Vimentin, CD73, PDGFRβ）の発現量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、mRNA発現量を、人工多能性幹細胞株の発現量を１とした相対値により示す。 TGFβ1刺激により腎間質細胞から分化した筋線維芽細胞におけるαSMAとFOXD1の発現を示す免疫組織化学染色像である。 TGFβ1刺激した腎間質細胞が筋線維芽細胞に分化した割合を示すグラフである。縦軸は、培養細胞の全体面積に対するtdTomato染色細胞の面積の割合（％）を示す。培養4日目（D4）のRSCを9日間TGFβ1（1 ng/ml）で処置した後（D13 TGF）、12日間TGFβ1含有培地（D25 TGF+）または不含有培地（D25 TGF-）でさらに培養した。D13及びD25における培養細胞の全体面積に対するtdTomato染色細胞の面積の割合（％）を示す。「D25 Cont」は陰性コントロール（TGFβ1処置なし）を示す。培養4日目（D4）のRSCを9日間TGFβ1（10 ng/ml）で処置した後（D13 TGF）、12日間TGFβ1含有培地（D25 TGF+）または不含有培地（D25 TGF-）でさらに培養した。D13及びD25における培養細胞の全体面積に対するtdTomato染色細胞の面積の割合（％）を示す。「D25 Cont」は陰性コントロール（TGFβ1処置なし）を示す。培養4日目（D4）のRSCを9日間TGFβ1（10 ng/ml）で処置した後（D13）、2日間TGFβ1不含有培地でさらに培養した（D15)。D15の細胞の培地にSB431542（3, 10, 30 μM）を添加し、さらに9日間培養した（D24）。D15, D17, D20, D22及びD24におけるtdTomato染色細胞の面積を示す。「Cont」は陰性コントロール（SB不添加）を示す。腎臓オルガノイドの顕微鏡像である。人工多能性幹細胞株（「iPSC」）、中間中胚葉（「IM (D7)」）、腎臓オルガノイド（Mini-kidney：「IM+RSP (D25)」）、腎間質前駆細胞を含まない腎臓オルガノイド（「KiO (D25)」）および低酸素条件下における腎臓オルガノイド（Mini-kidney：「IM+RSP (D25) + FG4592」）における、EPO mRNA発現量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、EPO mRNA発現量を、人工多能性幹細胞株の発現量を１とした相対値により示す。人工多能性幹細胞株（「iPSC」）、中間中胚葉（「IM (D7)」）、腎臓オルガノイド（Mini-kidney：「IM+RSP (D25)」）、腎間質前駆細胞を含まない腎臓オルガノイド（「KiO (D25)」）および低酸素条件下における腎臓オルガノイド（Mini-kidney：「IM+RSP (D25) + FG4592」）における、腎間質細胞マーカー（Desmin, Vimentin, CD73, PDGFRβ）の発現量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、mRNA発現量を、人工多能性幹細胞株の発現量を１とした相対値により示す。腎臓オルガノイド（Mini-kidney）における糸球体細胞マーカー（WT1）および尿細管細胞マーカー（LTL）の発現を示す免疫組織化学染色像である。 RSPを含む腎臓オルガノイド（IM+RSP (D25)、右）とRSPを含まない腎臓オルガノイド（KiO (D25)、左）の細胞ポピュレーションを示すT-SNE plotである。 EPO-emGFP/GAPDH-tdTomato (GAPDH-tdT)デュアルノックインヒトiPS細胞株由来RSP細胞塊を免疫不全NOGマウスの腎移植後に摘出した腎臓の実体顕微鏡下における蛍光像である。GAPDH-tdTの蛍光観察結果により、移植した細胞隗から細胞が遊走し、腎内に生着していることが確認された事を示す。細胞塊を腎移植後に摘出した腎臓のRSP（GAPDH-tdTomato陽性細胞）生着部位を含む組織片の蛍光像であり、移植したRSPの一部の細胞でEPO-emGFPの発現による蛍光が検出された事を示す。

［発明の詳細な説明］
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

１．腎間質細胞の製造方法
　本発明に係る腎間質細胞の製造方法は、以下の工程（３）を含み、任意に工程（２）および／または工程（１）を含む。
　工程（３）：血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程。
　工程（２）：神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程。
　工程（１）：ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、およびレチノイン酸および／またはその誘導体を含む培地で多能性幹細胞を培養し神経堤細胞を誘導する工程。

１－１．工程（３）
　本工程では、血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る。血小板由来成長因子受容体アゴニストは、腎間質前駆細胞を腎間質細胞に分化誘導する活性を有し、腎間質細胞誘導剤として機能することが見出された。血小板由来成長因子受容体アゴニストとしては、血小板由来成長因子（PDGF）が好ましい。

　腎間質前駆細胞は、工程（２）で得られたものであってよく、また商業的に入手された細胞であっても、生体内から分離されたex vivo細胞であってもよい。
　人工多能性幹細胞から誘導された腎間質前駆細胞を用いた場合、本工程において人工多能性幹細胞由来腎間質細胞が製造される。

　培地（腎間質細胞製造用培地）は、血小板由来成長因子受容体アゴニストを含み、好ましくはさらに塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）または線維芽細胞成長因子９（FGF9）を含み、より好ましくはbFGFおよびFGF9を含む。
　基礎培地としては、特に限定されないが、例えばSTEMdiff APEL2培地（STEMCELL Technologies、ST-05275）、TeSR1培地ならびにChemically Defined Medium（CDM）培地が好適に用いられる。この他、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM（IMEM）培地、Improved MDM（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地（High glucose、Low glucose）、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地等も用いられ得る。
　CDM培地としては、特に限定されないが、例えば、Iscove’s modified Dulbecco’s medium（GEヘルスケア社製）から調製される培地が使用され得る。
　基礎培地には、Ham’s F-12 nutrient mixture、ヒト血清アルブミン等のアルブミン、polyvinylalcohol(PVA)、Deionized BSA、リノール酸、リノレン酸、コレステロール、インスリン、アポトランスフェリン、セレン、エタノールアミン、モノチオグリセロール、Protein-free hybridoma mixture II (PFHMII)、アスコルビン酸、L-alanyl-L-glutamineおよび／又は抗生物質等の通常の細胞培養に用いられる物質が添加され得る。

　FGFおよびFGF9は、培養する腎間質前駆細胞の由来動物種に応じて適当な由来動物種のものを選択して用いればよく、好ましくは腎間質前駆細胞の由来動物種と同一の動物由来の因子が用いられる。
　PDGFは、線維芽細胞等の間葉系細胞の遊走および増殖等の調節に関与する増殖因子の一つである。PDGFにはPDGF-A、PDGF-B、PDGF-CおよびPDGF-Dの4種類が存在する。このうち、A鎖およびB鎖はジスルフィド結合を形成することによりホモあるいはヘテロ二量体構造をとることから、PDGF-AA、PDGF-ABおよびPDGF-BBの3種類のアイソフォームを有する。C鎖およびD鎖はそれぞれホモ二量体を形成する（PDGF-CCおよびPDGF-DD）。本発明においては、PDGF-BBが好ましい。PDGF-BBとしては特に限定されず、例えば、PEPROTECH社製#100-14B等を用いることができる。
　PDGF、bFGFおよびFGF9としては、全長ペプチドあるいはその受容体結合断片を用いることができる。
　PDGF、bFGFおよびFGF9は、市販のものを入手して用いていることができる。bFGFおよびFGF9としては特に限定されず、例えば、それぞれ富士フイルム和光純薬株式会社製品番号#068-04544および同#AF-100-23等を用いることができる。
　培地中へのPDGFの添加濃度は、用いるPDGFのサブタイプによって適宜調整することができ、例えば、0.05 ng/ml-1μg/mlである。好ましくは0.1-500 ng/ml より好ましくは1-100 ng/mlである。PDGF-BBを用いる場合、例えば0.1 ng/ml -1μg/mlである。好ましくは1-300 ng/ml より好ましくは3-100 ng/ml、特に好ましくは約10 ng/mlである。
　培地中へのbFGFの添加濃度は、例えば0.1 ng/ml-1μg/mlである。好ましくは1-500 ng/ml より好ましくは10-300 ng/ml、特に好ましくは約40 ng/mLである。
　培地中へのFGF9の添加濃度は、例えば0.1 ng/ml-1μg/mlである。好ましくは1-500 ng/ml、より好ましくは10-300 ng/ml、特に好ましくは約200 ng/mLである。

　血小板由来成長因子受容体アゴニストを、腎間質前駆細胞を腎間質細胞に分化させるための誘導剤として用いる場合、該誘導剤は、血小板由来成長因子受容体アゴニストに加えて、bFGF、FGF9、レチノイン酸（RA）等を含んでいてよい。

　本工程の培養期間は、腎間質前駆細胞が腎間質細胞に分化する期間であればよく、特に限定されないが、例えば7-24日間、好ましくは10-20日間、より好ましくは12-18日間、特に好ましくは約15日間である。

　本工程は、接着培養によることが好ましいが、浮遊培養によってもよい。
　接着培養には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、およびOptiCell（製品名）（Nunc社）等の細胞培養シートなどの培養容器が用いられる。
　接着培養に用いる容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていてもよいが、これらの表面処理やコーティングがなされていない容器を用いることがより好ましい。
　浮遊培養では、培地中に細胞を分散させ、撹拌または振盪により培地成分および培地内酸素濃度を均一化しながら細胞凝集塊を形成させる。好適な撹拌速度は、細胞密度と培養容器の大きさに応じて、適宜設定されるが、過度の撹拌または振盪は細胞に対して物理的ストレスを与え、細胞凝集塊形成を阻害する。したがって、培地成分および培地内酸素濃度を均一化でき、かつ、細胞凝集塊形成を阻害しないように撹拌または振盪速度を制御する。撹拌または振盪することなく、静置して浮遊培養を行うこともできる。
　浮遊培養には、Prime surface（製品名、住友ベークライト社）などの低接着コートの容器を用いることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、30-40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。

　腎間質細胞の生成の確認は、例えば、マーカータンパク質やマーカー遺伝子の発現を測定する方法が挙げられる。得られた細胞がEPO遺伝子および／またはタンパク質、CD73およびPDGFRβを発現し、好ましくはさらにDesminおよびVimentinを発現していれば、その細胞が腎間質細胞であると判断できる。
　マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーなどを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法および／または核酸検出方法、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。

　本工程で得られる腎間質細胞は、特に低酸素条件下でEPOを産生する機能（低酸素応答性）を備える。低酸素応答性は、HIFシグナルを活性化させる化合物を細胞に処置し、EPO のmRNAレベルまたはタンパク質レベルでの発現上昇を検出することにより確認できる。HIFシグナルを活性化させる化合物としては、例えばFG-2216（Selleck、#18382）およびFG-4592（Selleck、#S1007）を用いることができる。
　低酸素応答性は、対象とする細胞を低酸素濃度の条件下で培養することによっても確認することができる。低酸素濃度の条件における、酸素濃度は、生体内環境において生じ得る低酸素状態における酸素濃度とすることができる。酸素濃度としては、例えば、20％以下とすることができ、20~10％、10~5%、5~1%とすることができる。
　腎線維症はEPO産生能を有する腎間質細胞の線維化によるとの報告があることから、EPO産生能を有する腎間質細胞は、腎線維症治療薬開発のための生体を模した腎線維化モデル構築のための材料として有用である。また、EPO産生能を有する腎間質細胞は、特に腎性貧血の治療や予防を目的とした腎障害に対する細胞医療にも用いられ得る。

　本発明は、本工程により得られる腎間質細胞を含む凍結ストックをも提供する。
　凍結ストックは、得られた腎間質細胞を遠心分離により培地から分離し、凍結保存液中に懸濁して凍結することにより製造できる。凍結保存液には、従来細胞の凍結保存に用いられている試薬を用いればよい。例えば、Cryostem Freezing Medium（商品名）およびCELLBANKER（登録商標）などが市販されている。
　凍結ストックは、例えば、腎間質細胞を構成要素とする組織モデル（腎臓オルガノイド）の作製のために利用され得る。

１－２．工程（２）
　本工程では、神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する。
　本発明は、神経提細胞から腎間質前駆細胞を製造する方法を提供する。

　神経堤細胞は、工程（１）で得られたものであってよく、また商業的に入手された細胞であっても、生体内から分離されたex vivo細胞であってもよい。
　市販の神経堤細胞としては、例えば、ヒト毛包外毛根鞘細胞（コスモ・バイオ社製）、O9-1 Mouse Cranial Neural Crest Cell Line（メルクミリポア社製）等が挙げられる。
　また、神経堤細胞は、受精後30日前後のヒト胚の神経管、胎生9日目前後のマウス胚の神経管、ヒト、ブタおよびげっ歯類の成体の皮膚等に存在していることが報告されている（Betters et al., Developmental biology, 2010, 344(2):578-592、Jiang et al., Development, 2000, 127(8):1607-1616、Dupin et al., Developmental biology, 2012, 366(1):83-95、Nagoshi et al., Cell Stem Cell 2, April 2008, 392-403）。このような神経堤細胞を公知の方法（例えば、Motohashi et al., Biology open, 2016, 5:311-322、Pfaltzgraffet al., Journal of Visualized Experiments, 2012, 64:4134）を用いて採取し、適宜後方化したうえで本工程に供することも可能である。
　神経堤細胞には、後脳神経堤細胞（hindbrain NCC：hNCC）を用いることが好ましい。
　人工多能性幹細胞から誘導された神経堤細胞を用いた場合、本工程において人工多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞が製造される。

　神経堤細胞を間葉系間質細胞誘導用培地で培養することにより、腎間質前駆細胞が得られる。間葉系間質細胞誘導用培地には、例えば、StemPro MSC xenofree培地（ThermoFisher:、A1067501）を使用できる。
　本工程の培養期間は、神経提細胞が腎間質前駆細胞に分化する期間であればよく、特に限定されないが、例えば10-90日間、好ましくは20-50日間、より好ましくは30-40日間、特に好ましくは30-35日間である。

　本工程は、接着培養によることが好ましいが、浮遊培養によってもよい。
　接着培養には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、およびOptiCell（製品名）（Nunc社）等の細胞培養シートなどの培養容器が用いられる。
　接着培養に用いる容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていてもよいが、これらの表面処理やコーティングがなされていない容器を用いることがより好ましい。
　浮遊培養では、培地中に細胞を分散させ、撹拌または振盪により培地成分および培地内酸素濃度を均一化しながら細胞凝集塊を形成させる。好適な撹拌速度は、細胞密度と培養容器の大きさに応じて、適宜設定されるが、過度の撹拌または振盪は細胞に対して物理的ストレスを与え、細胞凝集塊形成を阻害する。したがって、培地成分および培地内酸素濃度を均一化でき、かつ、細胞凝集塊形成を阻害しないように撹拌または振盪速度を制御する。撹拌または振盪することなく、静置して浮遊培養を行うこともできる。
　浮遊培養には、Prime surface（製品名、住友ベークライト社）などの低接着コートの容器を用いることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、30-40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。
　以下、本明細書において、細胞凝集塊を単に「細胞塊」と記載することがある。

　腎間質前駆細胞の生成の確認は、例えば、細胞の腎間質細胞へ分化誘導能を確認することによって行い得る。
　また、腎間質前駆細胞の生成の確認は、例えば、マーカータンパク質やマーカー遺伝子の発現を測定する方法が挙げられる。得られた細胞がFOXD1、CD73およびPDGFRβを発現し、エリスロポエチンを発現していなければ、その細胞が腎間質前駆細胞であると判断できる。

　本発明は、本工程により得られる腎間質前駆細胞を含む凍結ストックをも提供する。
　凍結ストックは、得られた腎間質前駆細胞を遠心分離により培地から分離し、凍結保存液中に懸濁して凍結することにより製造できる。凍結保存液には、従来細胞の凍結保存に用いられている試薬を用いればよい。例えば、Cryostem Freezing Medium（商品名）およびCELLBANKER（登録商標）などが市販されている。
　凍結ストックは、例えば、腎間質前駆細胞から腎間質細胞を得るための出発材料として利用され得る。また、凍結ストックは、腎間質前駆細胞を構成要素とする組織モデル（腎臓オルガノイド）の作製のために利用され得る。

１－３．工程（１）
　本工程は、GSK3β阻害剤、TGFβ阻害剤、およびレチノイン酸および／またはその誘導体を含む培地で多能性幹細胞（特に、人工多能性幹細胞）を培養し神経堤細胞（好ましくは、後脳神経堤細胞）を誘導する。
　多能性幹細胞から各種神経堤細胞への分化誘導は、文献公知（例えば、非特許文献３、４）の方法に従って行うことができる。ヒト人工多能性幹細胞から神経堤細胞を分化誘導する場合、人工多能性幹細胞をディッシュ等に播種して接着培養した後、TGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む培地で接着培養し、その後レチノイン酸および／またはその誘導体をさらに加えた培地で接着培養することで神経堤細胞を分化させる。

　本発明において使用可能な「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、生体の種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力を有する幹細胞を指す。それには、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ESC）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞、精子幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞（本明細書中、「iPSC」と称することもある）などが挙げられる。また、本発明において使用可能な「多能性幹細胞（multipotent stem cell）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を有する幹細胞を指す。本発明において使用可能な「多能性幹細胞（multipotent stem cell）」としては、例えば、歯髄幹細胞、口腔粘膜由来幹細胞、毛包幹細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の体性幹細胞などが挙げられる。好ましい多能性幹細胞（pluripotent stem cell）は、ESCおよびiPSCである。

　「ESC」としては、マウスESCであれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスESC株が利用可能であり、ヒトESCであれば、ウィスコンシン大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医療研究センターおよびCellartis社などが樹立した各種ヒトESC株が利用可能である。たとえば、ヒトESC株としては、ESI Bio社が分譲するCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WiCell Researchが分譲するH1株、H9株等、理研が分譲するKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。

　「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPSC（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPSC（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPSC（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66）等も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性幹細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、Ff- I14s04株、QHJ I14s04株等が挙げられ、1231A3株が好ましい。

　培地は、GSK3β阻害剤、TGFβ阻害剤、およびレチノイン酸および／またはその誘導体を含む。レチノイン酸の誘導体としては、レチノール、レチナール、レチノイン、イソレチノイン、アリトレチノイン、エトレチナート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレンが用いられ得る。これらは、２以上を組み合わせて用いてもよい。以下、「レチノイン酸および／またはその誘導体」を単に「レチノイン酸等」と称する。
　基礎培地は、特に限定されないが、例えばＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３のＡ液、Ｂ液およびＣ液を混合したもの、TeSR1培地ならびにChemically Defined Medium（CDM）培地が好適に用いられる。この他、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM（IMEM）培地、Improved MDM（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地（High glucose、Low glucose）、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地等も用いられ得る。
　CDM培地としては、特に限定されないが、例えば、Iscove’s modified Dulbecco’s medium（GEヘルスケア社製）から調製される培地を使用できる。
　基礎培地には、アポトランスフェリン、モノチオグリセロール、ウシ血清アルブミン（BSA）、インスリンおよび／または抗生物質等の通常の細胞培養に用いられる物質が添加され得る。

　TGFβ阻害剤としては、SB431542（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide）、A83-01（3-(6-methyl-2-pyridinyl)-n-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1h-pyrazole-1-carbothioamide）、LDN193189（4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline）、Wnt3a/BIO（Wnt Family Member 3A/ (2Z, 3E)-6’-Bromo-3-(hydroxyimino)-[2,3’-biindolinylidene]-2’-one ）、BMP4（Bone morphogenetic protein 4）、GW788388（4-[4-[3-(2-pyridinyl)-1h-pyrazol-4-yl]-2-pyridinyl]-n-(tetrahydro-2h-pyran-4-yl)-benzamide）、SM16（4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-bicyclo[2.2.2]octane-1-carboxamide）、IN-1130（3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]-benzamide）、GW6604（2-Phenyl-4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridine）およびSB505124（2-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1h-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine）等が挙げられる。これらは、２以上を組み合わせて用いてもよい。

　培地中へのTGFβ阻害剤の添加濃度は、添加するTGFβ阻害剤の種類によって適宜調整されるが、例えば0.1-50μM、好ましくは1-20μMである。
　SB431542（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide）を用いる場合、添加濃度は、例えば1-100μM、好ましくは5-20μM、特に好ましくは約10μMとできる。

　GSK3β阻害剤としては、CHIR98014（N6-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]-3-nitro-2,6-pyridinediamine）、CHIR99021（6-{2-[4-(2,4-Dichloro-phenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-pyrimidin-2-ylamino]-ethylamino}-nicotinonitrile）、CP21R7（CP21R7）、LY2090314（3-[9-Fluoro-1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)pyrrolo[3,2,1-jk][1,4]benzodiazepin-7-yl]-4-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-1h-pyrrole-2,5-dione）、TDZD-8（2-methyl-4-(phenylmethyl)-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione）、SB216763（3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione）、TWS-119（3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol）、ケンパウロン（Kenpaullone）、1-アザケンパウロン（Azakenpaullone）、SB415286（[3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1Hpyrrole-2,5-dione]）およびAR-AO144-18（1-[(4-methoxyphenyl)methyl]-3-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea）、CT99021、CT20026、BIO（(2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-オキシム）、BIO-アセトキシム、ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム複合体、OTDZT、アルファ-4-ジブロモアセトフェノン、リチウム等が挙げられる。これらは、２以上を組み合わせて用いてもよい。
　GSK3β阻害剤はこれらに限定されるものではなく、GSK3βのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、GSK3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK3β変異体等もGSK3β阻害剤として使用することができ、これらは商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

　培地中へのGSK3β阻害剤の添加濃度は、添加するGSK3β阻害剤の種類によって適宜調整されるが、例えば0.1-10μM、好ましくは0.5-2μMである。
　CHIR99021を用いる場合、添加濃度は、例えば0.1-10μM、好ましくは0.5-2μM、特に好ましくは約1μMとできる。

　培地中へのレチノイン酸および／またはその誘導体の添加濃度は、添加する化合物の種類によって適宜調整されるが、例えば0.001-50μM、好ましくは0.1-10μMである。
　レチノイン酸を用いて後脳神経堤細胞（hNCC）を誘導する場合、添加濃度は、例えば0.1-10μM、好ましくは1-5μM、特に好ましくは約3μMとできる。

　TGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む培地での培養期間は、例えば0-24日間、特には約18日間である。レチノイン酸等をさらに加えた培地での培養期間は、例えば3-24日間、特には約12日間である。

　本工程で得られた神経堤細胞は、例えば磁気活性セルソーティング（FACS）又は磁気細胞ソーティング（MACS）等の公知の手段により分離できる。神経堤細胞を含む細胞集団から所定の表面マーカー（例えば、CD271, CD49D, HNK-1）の発現陽性細胞を分離することにより、細胞集団において神経堤細胞を富化できる。
　本工程は、得られた神経堤細胞および／または富化された神経堤細胞は、工程（２）に供する前に、一定期間維持培養および／または拡大培養を行ってもよい（以下、本明細書において、「工程（１Ｂ）」と称することがある。）。

１－４．工程（１Ｂ）
　神経堤細胞は、GSK3β阻害剤、TGFβ阻害剤、EGFおよびbFGFを含む培地中で浮遊培養することによって維持および拡大できる。
　基礎培地は、特に限定されないが、例えばStemFit AK03のA液およびB液を混合したもの、TeSR1培地ならびにChemically Defined Medium（CDM）培地が好適に用いられる。この他、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM（IMEM）培地、Improved MDM（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地（High glucose、Low glucose）、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地等も用いられ得る。
　CDM培地としては、特に限定されないが、例えば、Iscove’s modified Dulbecco’s medium（GEヘルスケア社製）から調製される培地を使用できる。
　基礎培地には、アポトランスフェリン、モノチオグリセロール、ウシ血清アルブミン（BSA）、インスリンおよび／または抗生物質等の通常の細胞培養に用いられる物質が添加され得る。
　培地中へのTGFβ阻害剤の添加濃度は、添加するTGFβ阻害剤の種類によって適宜調整されるが、例えば0.1-50μM、好ましくは1-20μMである。
　SB431542（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide）を用いる場合、添加濃度は、例えば1-100μM、好ましくは5-20μM、特に好ましくは約10μMとできる。

　培地中へのGSK3β阻害剤の添加濃度は、添加するGSK3β阻害剤の種類によって適宜調整されるが、例えば0.1-10μM、好ましくは0.5-5μMである。
　CHIR99021を用いる場合、添加濃度は、例えば0.1-10μM、好ましくは0.5-5μM、特に好ましくは約3μMとできる。
　bFGFの添加濃度は、特に限定されないが、例えば10-200 ng/ml、好ましくは20-40 ng/mlとされる。
　EGFの添加濃度は、特に限定されないが、例えば5-100 ng/ml、好ましくは20-40 ng/mlとされる。

　浮遊培養では、神経堤細胞を培地中に分散させ、撹拌または振盪により培地成分および培地内酸素濃度を均一化しながら細胞凝集塊を形成させる。好適な撹拌速度は、細胞密度と培養容器の大きさに応じて、適宜設定されるが、過度の撹拌または振盪は細胞に対して物理的ストレスを与え、細胞凝集塊形成を阻害する。したがって、培地成分および培地内酸素濃度を均一化でき、かつ、細胞凝集塊形成を阻害しないように撹拌または振盪速度を制御する。撹拌または振盪することなく、静置して浮遊培養を行うこともできる。
　培養温度は、特に限定されないが、30-40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。
　本工程における培養期間は、細胞隗が形成され期間であればよく、適宜調整される。好ましくは24時間-7日間、さらに好ましくは3-5日間、特に好ましくは約3日間である。
　この間、適宜細胞の継代が行われてもよい。継代は、例えば播種後5-8日毎に行われる。継代間隔は、細胞凝集塊の拡大に十分な期間であって、かつ細胞凝集塊が大きくなりすぎて酸素や栄養素が細胞凝集塊内部の細胞に到達し難くなると考えられる期間よりも短い期間で行われることが好ましい。

２．腎臓オルガノイドの製造方法
　本発明に係る腎臓オルガノイドの製造方法は、腎間質細胞または腎間質前駆細胞と、中間中胚葉とを共培養する工程を含む。

　腎間質細胞は、工程（３）で得られたものとでき、また商業的に入手された細胞であっても、生体内から分離されたex vivo細胞であってもよい。
　腎間質前駆細胞は、工程（２）で得られたものとでき、また商業的に入手された細胞であっても、生体内から分離されたex vivo細胞であってもよい。

　中間中胚葉は、多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞）から誘導したものであってよい。
　多能性幹細胞からの中間中胚葉の誘導、および中間中胚葉と腎間質細胞または腎間質前駆細胞とからの腎臓オルガノイドの誘導は、文献公知の手法（非特許文献６および非特許文献７）に基づいて行うことができる。

　具体的には、まず、ヒト人工多能性幹細胞を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養した後、FGF9およびヘパリンを含む培地で培養することにより中間中胚葉を得る。

　培地中へのGSK3β阻害剤の添加濃度は、例えば0.1-10μM、好ましくは1-10μM、より好ましくは3-9μM、特に好ましくは約8μMである。
　培地中へのFGF9の添加濃度は、例えば0.1 ng/ml-1μg/ml、好ましくは1-500 ng/ml、より好ましくは10-300 ng/ml、特に好ましくは約200 ng/mlである。
　培地中へのヘパリンの添加濃度は、例えば0.01-100μg/ml、好ましくは0.1-10μg/ml、特に好ましくは約1μg/mlである。

　GSK3β阻害剤を含む培地での培養期間は、例えば2-6日間、特には約4日間である。
　FGF9およびヘパリンを含む培地での培養期間は、例えば2-6日間、特には約3日間である。

　次に、中間中胚葉を分散させて腎間質細胞または腎間質前駆細胞と混合し、細胞隗（ペレット）を作成する。
　中間中胚葉から分散させた細胞と腎間質細胞または腎間質前駆細胞との混合比率は、前者１に対して後者を例えば1-0.002、好ましくは0.02-0.6、さらに好ましくは0.2-0.4である。

　細胞隗（ペレット）を、GSK3β阻害剤およびヘパリンを含む培地で処理した後、FGF9およびヘパリンを含む培地で培養し、さらにヘパリンを含む培地で培養することにより腎臓オルガノイドを得る。

　培地中へのGSK3β阻害剤の添加濃度は、例えば0.1-10μM、好ましくは1-10μM、より好ましくは3-7μM、特に好ましくは約5μMである。
　培地中へのFGF9の添加濃度は、例えば0.1 ng/ml-1μg/ml、好ましくは1-500 ng/ml、より好ましくは10-300 ng/ml、特に好ましくは約200 ng/mlである。
　培地中へのヘパリンの添加濃度は、例えば0.01-100μg/ml、好ましくは0.1-10μg/ml、特に好ましくは約1μg/mlである。

　GSK3β阻害剤およびヘパリンを含む培地での処理時間は、例えば0.5-2時間、特には約1時間である。
　FGF9およびヘパリンを含む培地での培養期間は、例えば3-7日間、特には約5日間である。
　ヘパリンを含む培地での培養期間は、例えば7-30日間、特には約21日間である。

　基礎培地としては、特に限定されないが、例えばSTEMdiff APEL2培地（STEMCELL Technologies、ST-05275）、TeSR1培地ならびにChemically Defined Medium（CDM）培地が好適に用いられる。この他、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM（IMEM）培地、Improved MDM（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地（High glucose、Low glucose）、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地等も用いられ得る。
　CDM培地としては、特に限定されないが、例えば、Iscove’s modified Dulbecco’s medium（GEヘルスケア社製）から調製される培地が使用され得る。
　基礎培地には、Ham’s F-12 nutrient mixture、ヒト血清アルブミン等のアルブミン、polyvinylalcohol(PVA)、Deionized BSA、リノール酸、リノレン酸、コレステロール、インスリン、アポトランスフェリン、セレン、エタノールアミン、モノチオグリセロール、Protein-free hybridoma mixture II (PFHMII)、アスコルビン酸、L-alanyl-L-glutamineおよび／又は抗生物質等の通常の細胞培養に用いられる物質が添加され得る。

　中間中胚葉および腎臓オルガノイドの生成の確認は、例えば、マーカータンパク質やマーカー遺伝子の発現を測定する方法が挙げられる。
　得られた細胞隗がOSR1を発現していれば、その細胞隗が中間中胚葉であると判断できる。
　得られた細胞隗が低酸素条件下でのEPO産生能を有し、腎間質、糸球体および尿細管のマーカーを発現していれば、腎臓オルガノイドであると判断できる。腎間質細胞マーカーとしては、FOXD1、PDGFRβ、CD73がある。糸球体マーカーとしては、WT1、NPHS1がある。尿細管マーカーとしては、LTL、CUBN、E-cadherinがある。
　また、中間中胚葉の生成の確認は、例えば、細胞の糸球体や尿細管へ分化誘導能を確認することによっても行い得る。

３．応用
　本発明に係る製造方法により得られる腎間質細胞および腎間質前駆細胞ならびに腎臓オルガノイドは、腎疾患の病態解析に用いられ得るものであり、また腎疾患の創薬スクリーニングや腎毒性の評価試験などにも適用され得る。

３－１．腎線維症の予防または治療のための物質のスクリーニング方法
　本発明は、以下の手順を含む、腎線維症の予防または治療のための物質のスクリーニング方法も提供する。
　（１）上述の製造方法により得られた腎間質細胞を、該細胞の線維化を誘導する物質の存在下で培養し、線維化腎間質細胞を含む細胞集団を提供する手順。
　（２Ａ）被験物質の存在下および非存在下で前記細胞集団を培養する手順。
　（３Ａ）各前記細胞集団における細胞の線維化の程度を測定する手順。
　（４Ａ）前記被験物質の存在下で培養した細胞集団において、前記被験物質の非存在下で培養した細胞集団に比して細胞の線維化の程度を低下させた被験物質を選択する手順。

　手順（１）では、上述の腎間質細胞の製造方法の工程（３）で得られた腎間質細胞を、培地中に線維化誘導物質を添加してさらに培養することにより、線維化腎間質細胞を含む細胞集団を得ることができる。
　スクリーニングに用いる腎間質細胞の細胞集団の細胞密度は特に限定されず、接着培養による場合には例えば、5,000~500,000細胞／cm²、好ましくは10,000~200,000細胞／cm²、より好ましくは20,000~100,000細胞／cm²、特に好ましくは50,000細胞／cm²とすることができる。浮遊培養による場合には例えば、5~500細胞／μL、好ましくは20~200細胞／μL、特に好ましくは50~100細胞／μLとすることができる。
　腎間質細胞の線維化を誘導する物質（線維化誘導物質）は、例えばTGFβファミリーであってよく、好ましくはTGFβであり、そのうち特に好ましいアイソフォームはTGFβ1である。
　線維化誘導物質の濃度および培養期間は、用いる物質に応じて適宜設定され得るが、例えばTGFβ1が用いられる場合、濃度は0.1~100 ng/ml、好ましくは1~30 ng/ml、特に好ましくは約10 ng/mlであり、培養期間は2~20日間、好ましくは4~14日間、特に好ましくは約9日である。
　なお、本発明において、TGFβ1は、1 ng/ml以下の濃度での線維化誘導後に培地中から除去すると、線維化した腎間質細胞が線維化していない状態に戻ることが明らかとなった。10 ng/ml以上の濃度のTGFβ1で線維化を誘導することで、TGFβ1の培地中からの除去後も腎間質細胞の線維化を維持できるので、持続する線維化状態を改善する物質のスクリーニングを行うことが可能となる。

　手順（２Ａ）で用いられる被験物質およびその濃度は、適宜選択され得る。本手順では、腎間質細胞の線維化の程度を低下させることが公知である物質を陽性コントロールとして用いることができる。陽性コントロールには、例えばTGFレセプター阻害剤（SB431542等）が用いられる。

　手順（３Ａ）での細胞の線維化の程度の測定は、例えば、2次元または3次元の一定の領域における、線維化した細胞が占める面積または体積の割合を決定することにより行うことができる。
　被験物質の存在下で培養した細胞集団において、被験物質の非存在下で培養した細胞集団に比して細胞の線維化の程度が抑制される場合、当該被検物質は腎線維化を改善するために有用である可能性がある。
　線維化した細胞の割合の決定は、例えば、ハウスキーピング（House keeping）遺伝子（例えば、GAPDH）のプロモーターの制御下にレポータータンパク（例えば、tdTomato）を発現させて細胞全体を蛍光ラベルし、蛍光の検出により細胞の面積または体積を測定することにより行うことができる。腎臓の間質にある線維芽細胞は線維化によって増殖が促進され、一つ一つの細胞の面積および体積も肥大化することが知られている。腎間質細胞の線維化の程度も、細胞の面積または体積の増加に基づいて測定できる。
　蛍光ラベルした細胞の面積および体積の測定は、公知の方法により行うことができる。例えば、蛍光撮影した当該細胞の画像を8 bitに変換し、2値化することにより細胞面積を測定できる。蛍光撮影した画像の解析には、例えば、画像解析ソフトウェアImage J（NIH）等を用いることができる。測定対象とする一定の面積におけるレポータータンパク陽性細胞の面積の割合を決定することにより線維化の程度を評価することができる。
　線維化の程度は、例えば、腎間質細胞をウェル内に一定数播種し、被験物質を添加して培養した後、当該ウェル内の細胞面積を、被験物質を添加していないウェル内の細胞面積と比較することにより測定できる。例えば、被験物質を添加したウェルの細胞面積が、被験物質を添加していないウェルの細胞面積に比べて小さければ、当該被験物質が線維化の程度を低下させたと評価できる。また、被験物質を添加したウェルの細胞面積が、被験物質を添加していないウェルの細胞面積に比べて大きければ、当該被験物質が線維化の程度を上昇させたと評価できる。細胞面積の縮小率および増大率は、「（被験物質存在下における細胞面積）／（被験物質非存在下における細胞面積）×100（％）」で算出される。
　また、αSMAに対する抗体を用いて免疫染色を行い、細胞集団におけるαSMA陽性細胞の割合を決定することによっても、細胞の線維化の程度を測定できる。αSMA陽性細胞の割合は公知の方法により行うことができる。

３－２．腎線維症のバイオマーカーの決定方法
　本発明は、以下の手順を含む、腎線維症のバイオマーカーを決定する方法をも提供する。
　（１）上述の製造方法により得られた腎間質細胞を、該細胞の線維化を誘導する物質の存在下で培養し、線維化腎間質細胞を含む細胞集団を提供する手順。
　（２Ｂ）前記細胞集団の培養液に含まれる物質を同定する手順。
　（３Ｂ）同定された物質と、腎線維症に罹患した哺乳動物の体液中に含まれる物質と、を比較して、一致する物質を特定する手順。

　手順（１）は、前項のスクリーニング方法の手順（１）と同様である。

　手順（２Ｂ）における培養液に含まれる物質の同定は、例えば上清のタンパク成分をアセトン沈殿等により回収し、トリプシン等のプロテアーゼで処理して得たペプチド断片のアミノ酸配列を決定することにより行うことができる。ペプチド断片のアミノ酸配列は、液体クロマトグラフィー質量分析法によって決定できる。上清のタンパク成分は、アセトン沈殿前に、主要タンパク成分（アルブミン、IgG、IgA等）を除去しておくことが好ましい。

　手順（３Ｂ）のための、腎線維症に罹患した哺乳動物（疾患個体）の体液中に含まれる物質に係る情報は、日本腎臓学会（JSN）と日本医療情報学会（JAMI）が提供する包括的慢性腎臓病データベース（J-CKD-DB）等のデータベースから入手することができる。体液としては、尿、血液、血清、血漿、唾液、汗、リンパ液、組織液、細胞外液、細胞内液等を用いることができる。また、当該情報は、疾患個体の尿、バイオプシー（生体組織採取検査）、血液、血清または血漿等のプロテオーム解析によって入手してもよい。
　線維化腎間質細胞の培養液中に分泌され、かつ、疾患個体の体液中にも含まれている物質は、腎線維症のバイオマーカーとして利用できる可能性がある。

３－３．医薬
　さらに、本発明に係る製造方法により得られる腎間質細胞および腎間質前駆細胞ならびに腎臓オルガノイドは、腎疾患の予防または治療のための細胞製剤となり得る。
　すなわち、本発明は、多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞および／または腎臓オルガノイドを含む医薬とその製造方法をも提供する。
　本発明に係る医薬の製造方法は、本発明に係る腎間質細胞の製造方法の工程（１）－（３）を含み得る。

　腎疾患としては、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎性貧血などが挙げられる。

　医薬が含有する腎間質細胞、腎間質前駆細胞または腎臓オルガノイドは、例えば培養中の細胞を剥離して回収された細胞であっても、凍結保存液中に凍結された細胞であってもよい。

　医薬は、用途や形態に応じて、常法に従って、薬学的に許容される担体や添加物等のその他の成分を含有させてもよい。担体や添加物としては、例えば、等張化剤、増粘剤、糖類、糖アルコール類、防腐剤（保存剤）、殺菌剤又は抗菌剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、キレート剤、油性基剤、ゲル基剤、界面活性剤、懸濁化剤、流動化剤、分散剤、緩衝剤、抗酸化剤等が挙げられる。

　医薬により、該医薬の治療有効量を対象に投与することを含む、腎疾患の予防または治療方法が提供される。
　治療有効量とは、医薬を患者に投与した場合に、投与していない対照と比較して上記疾患に対して治療効果を得ることができる量である。具体的な治療有効量としては、医薬の投与形態、投与方法、使用目的および患者の年齢、体重、症状等によって適宜設定され得る。ヒト（例えば成人）の１回の治療あたりの有効量は、例えば細胞数で200,000～1,00,000,000個／kg体重である。これらの細胞は単一細胞の状態に分散されていてもよいし、複数の細胞が集まった細胞塊（sphere）になっていてもよいし、これらが混合されたものであってもよい。

　医薬の投与方法としては、例えば、腹腔内注射、開腹による腎への直接注射、細胞を含有するシート状のデバイスを腎臓周囲に付着させるなどが挙げられる。

　本発明は、上述の製造方法で得られる、腎間質細胞、腎間質前駆細胞または腎臓オルガノイドを含む凍結ストックをも提供する。

　凍結ストックは、得られた腎間質細胞、腎間質前駆細胞または腎臓オルガノイドを遠心分離により培地から分離し、凍結保存液中に懸濁して凍結することにより製造できる。凍結保存液には、従来細胞の凍結保存に用いられている試薬を用いればよい。例えば、Cryostem Freezing Medium（商品名）およびStemcell Banker GMP Grade（日本全薬工業株式会社）などが市販されている。

　腎間質前駆細胞の凍結ストックは、腎間質前駆細胞を分化させて腎間質細胞および腎臓オルガノイドを得るための出発材料として利用され得る。また、腎間質細胞および腎臓オルガノイドの凍結ストックは、腎間質細胞および腎臓オルガノイドを構成要素とする組織モデルの作製のために利用され得る。

［実施例１：iPSCのhNCCへの誘導］
実施例１－１：人工多能性幹細胞（iPSC）からの神経堤細胞（NCC）の誘導
　ヒトiPSCからのNCCの誘導は、非特許文献４に記載の方法に従ってxeno-freeの条件下で行った。
　ヒトiPSCには、1231A3株（非特許文献５参照）を用いた。
　Laminin-511（iMatrix-511 Silk、株式会社ニッピ、#387-10131）をコート（0.5 g/cm²）した10 cmディッシュにヒトiPSCを2×10⁵ cells/dishで播種し、10μM Y-27632（富士フイルム和光純薬株式会社、#034-24024）を添加したStemFit AK03N (A+B+C)培地（味の素株式会社）で24時間予備培養した。
　培地を、Y-27632を含まない培地に交換し、4日間ヒトiPSCを培養してコロニーを形成させた（Day -4～0）。
　コロニーを形成したヒトiPSCを、10μM SB431542（富士フイルム和光純薬株式会社、#035-24294）と1μM CHIR99021（Axon Medchem、#1386）を添加したStemFit AK03N (A+B)培地で10日間培養（Day 0～10）し、SOX10陽性のNCCを得た。

実施例１－２：レチノイン酸（RA）によるNCCの後方化（hNCCの誘導）
　実施例１－１の培養におけるDay 6より、NCCの後方化を目的として1μM RAを培地に添加して、１４日目まで培養を行った（Day 0-14）。Day 14おいて、エリスロポエチン（EPO）の発現をmRNAレベルおよびタンパク質レベルで確認した。
　mRNAレベルおよびタンパク質レベルの双方においてEPOの発現が確認された。EPOとSOX10の免疫組織化学的染色像を図１に示す。

実施例１－３：分化誘導期間の検討
　培地に添加するRA濃度を0、1又は3μMとしたことを除いて実施例１－１および１－２と同様の方法により、神経堤細胞への誘導と後方化を行った。各RA濃度（0、1又は3μM）の条件下で誘導期間における培地中へのEPOの分泌量を定量した（EPO ELISA Kit、Sigma、#1693417）。
　分化誘導開始後の培地中へEPOの蓄積量の推移を図２に示す。EPOの培地中への分泌は9日目（Day 9）から確認され、蓄積量は18日目（Day 18）に最大となった。この傾向はRA濃度に依らずに認められたが、EPOの分泌量はRA濃度3μMの条件で最も多かった。

実施例１－４：後方化したNCC（hNCC）の低酸素応答性の確認
　EPO産生細胞は低酸素環境下でHIFシグナルに応答してEPOの産生と分泌を行うことが知られている。HIFシグナルを活性化させる2種類の化合物（FG-2216: Selleck #18382およびFG-4592: Selleck #S1007、各100μM）を用いて、実施例１－３で作製したDay 18におけるhNCCの低酸素応答性を確認した。FG-2216またはFG-4592の添加後１日目の培地中へのEPOの分泌量を定量した結果を図３に示す。低酸素刺激に応答して、培地中へのEPOの分泌が増加した。

実施例１－５：RA濃度の検討
　培地に添加するRA濃度条件を0-10μMの範囲で変更したことおよび培養期間をDay 10からDay 21まで延長したことを除いて実施例１－１および１－２と同様の方法により、iPSCからのNCCの誘導と後方化を行った。後脳のマーカーであるHOXB4の発現をmRNAレベルで確認した。また、培地中へのEPOの分泌量を測定した。
　Day 10におけるHOXB4の発現量の測定結果を図４に示す。RA濃度依存的にHOXB4の発現量が増加した。Day 18におけるEPOの分泌量の測定結果を図５に示す。EPOの分泌量は、RA濃度が3μMの条件において最も多かった。

［実施例２：hNCCのRSPへの誘導］
実施例２－１：EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株の樹立
　EPOプロモーターの制御下でEPOとGFP（emGFP）とをバイシストロニックに発現する、EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株を作製した。
　1231A3株に、EPO遺伝子の終止コドン部位をF2A-emGFPに置換したドナーベクター、ターゲット配列のsgRNA発現プラスミドおよびSpCas9 D10A nickase発現プラスミド（富士フイルム和光純薬株式会社）をNeon Transfection system（Life Technologies）を用いて共導入した。
　Geneticin（Invitrogen: #10131035）を用いた薬剤選択とPCRとによって、目的遺伝子が染色体へ導入されたEPO-emGFP株を選択した。
　さらに、Excision only piggyBAC transposase（Transposagen: #PBx-m）を用いてEPO-emGFP株の薬剤選択部分の配列を除去し、EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株を得た。

実施例２－２：EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株を用いたEPO産生hNCCのソーティング
　実施例２－１で樹立したEPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株を用いて、実施例１に記載の方法によりhNCCを誘導した。Day 18におけるhNCCからセルソーター（BD、FACSAria II）を用いてEPO発現細胞を分離（ソーティング）した。具体的には、シングルセル化したhNCCを2% BSA（SIGMA、A8806-5G）を含むHBSS溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）中に懸濁し、DAPI （Invitrogen: D1306）陰性（生細胞を示す）かつemGFPの蛍光陽性の細胞を分離した。図６に、EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株（誘導前）、ソートティング前のhNCC（図中「not sort」）、GFP陰性hNCC（「GFP- sort」）およびGFP陽性hNCC（「GFP+ sort」）について、EPO mRNA発現量を測定した結果を示す。図中、縦軸は、EPO mRNA発現量を、EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株（誘導前）の発現量を１とした相対値により示す。GFP陽性hNCCにおいてEPO mRNAの高発現が確認された。

実施例２－３：hNCCの腎間質前駆細胞（RSP）への誘導
　実施例２－２で得られたhNCC（GFP陽性細胞）を、PrimeSurfaceプレート96V（住友ベークライト株式会社、MS-9096V）に10,000 cells/wellで播種し、10μM SB431542、3μM CHIR99021, 40 ng/ml bFGF（富士フイルム和光純薬株式会社、#068-04544）、40 ng/ml EGF（富士フイルム和光純薬株式会社、#053-07871）を添加したStemFit AK03N (A+B)培地で3日間浮遊培養した（Day 18-21）。
　得られた細胞隗を、fibronectin（MERCK、FC010-10MG）をコートした6 well plateに1 細胞塊/wellで播種し、StemPro MSC SFM XenoFree培地（ThermoFisher、#A1067501）で34日間培養（Day 21-55）を行い、CD73/PDGFRβ/FOXD1陽性のRSPを得た。

［実施例３：RSPの腎間質細胞（RSC）への誘導］
実施例３－１：RSCへの分化誘導
　実施例２で得られたRSPを、fibronectinをコートした6 well plateに2×10⁵ cells/wellで播種し、STEMdiff APEL2培地（STEMCELL Technologies、ST-05275）で15日間培養してRSCを得た（Day 55-70）。

　得られたRSCについて、低酸素応答性のEPO産生能を確認した。
　EPO産生細胞は低酸素環境下でHIFシグナルに応答してEPOの産生と分泌を行うことが知られている。HIFシグナルを活性化させる化合物（FG-4592、Selleck、#S1007、100μM）をRSCに処置した。
　図７に、Day 18の細胞（hNCC、図中「NCC D18」））、Day 39の細胞（RSP、「RSP D39」）、STEMdiff APEL2培地での培養15日目（Day 70）の細胞（RSC、「APEL2 D15」）および低酸素刺激したRSC（「+FG4592」）についてEPO mRNA発現量を測定した結果を示す。図中、縦軸は、EPO mRNA発現量を、EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株（誘導前）の発現量を１とした相対値により示す。また、低酸素条件下のRSCにおけるEPOの免疫組織化学染色像を図８に示す。低酸素刺激に応答してEPOのmRNAレベルおよびタンパク質レベルでの発現が認められた。

実施例３－２：RSCへの分化にbFGF, FGF9, PDGF-BBが与える影響
　実施例３－１の誘導条件下において、40 ng/ml bFGF、200 ng/ml FGF9（富士フイルム和光純薬株式会社、#AF-100-23）、10 ng/ml PDGF-BB（PEPROTECH、#100-14B）をそれぞれ単独で又は組み合わせで培地に添加した場合に得られる細胞数と培地中へのEPOの分泌量を測定した。培地中のEPOはELISAにより測定した。
　結果を図９に示す。PDGF-BBを添加した場合にはEPO分泌量が増加し、bFGFを添加した場合には細胞の増殖が促進した。さらに、これらの因子をいずれも培地中に含ませることで細胞の増殖とEPO分泌量の増加が認められた。

実施例３－３：腎間質細胞マーカー発現の評価
　実施例３－２で得られたRSCを低酸素刺激（100μM、FG-4592）し、腎間質細胞マーカー（Desmin, Vimentin, CD73, PDGFRβ）の発現をmRNAレベルで確認した。いずれも発現が認められた（図１０参照）。図中、「NHMC」は市販の正常ヒト腎メサンギウム細胞（Normal human mesangial cells）での発現レベル、「Kindey」は市販の腎cDNAライブラリでの発現レベルを示す。

実施例３－４：TGFβ1応答性の評価
　生体内の腎間質細胞はTGFβ1刺激に応答してαSMA陽性の筋線維芽細胞（myofibroblast）への分化と肥大化（いわゆる、線維化（fibrosis））を引き起こすことが知られている。後述の実施例４－２で得られたEPO-emGFP/GAPDH-tdTomato (GAPDH-tdT) デュアルノックインヒトiPS細胞株から、実施例１、実施例２および実施例３－１に記載の方法によりRSCを得た。実施例１記載の方法において、RA濃度は3 μMとした。培養4日目（D4）のRSCをTGFβ1（0.01-10 ng/ml）で9日間処置し（D13）、画像解析ソフトウェアImage J（NIH）を用いてtdTomato陽性細胞の割合を決定することにより線維化の程度を評価した。具体的には、蛍光撮影した画像を8 bitに変換し、2値化を行うことで全体の面積を「細胞の面積」と「その他の面積（細胞が存在しない面積）」に分けた。割合は「細胞の面積」／「全体の面積」で算出した。
　結果を図１１および図１２に示す。TGFβ1刺激により、αSMA陽性の筋線維芽細胞への分化および細胞の肥大化が認められた。また、細胞の肥大化はTGFβ1濃度依存的に引き起こされ、TGFレセプター阻害剤（SB431542）の共処置により抑制された（図１２参照）。

実施例３－５：腎線維症の予防または治療薬のスクリーニング
　実施例３－４にてRSCがTGFβ1に応答して線維化することが示された。さらに、1 ng/mlのTGFβ1により線維化を誘導したRSCは、TGFβ1を培地から除去することにより、線維化していないRSCに戻った（図１３）。これに対し、10 ng/mlのTGFβ1で線維化を誘導したRSCはTGFβ1を培地から除去しても線維化状態が維持された（図１４）。このRSCの繊維化の性質を利用して、持続する線維化状態を改善する化合物スクリーニング系を構築した。

　RSPを3000 cells/wellで384-well plateに播種し、STEMdiff APEL2培地（STEMCELL Technologies、ST-05275）にてRSCへの誘導を開始した。培養4日目（D4）に10 ng/ml TGFβ1を添加して線維化を誘導した。培養期間中は、3日毎にTGFβ1を含む培養液を交換した。培養13日目（D13）に培地からTGFβ1を除去し、さらに2日間培養を続けた（D15）。D15の細胞の培地にTGFレセプター阻害剤であるSB431542（SB）を被験物質として添加し、さらに9日間培養した後（D24）、tdTomato陽性細胞の面積を決定した。
　結果を図１５に示す。SBを不添加群（Cont）ではD15以降線維化の増強がみられた。一方、SB添加群（SB+）では線維化の顕著な抑制が確認できた。本スクリーニング系が、腎線維化を改善する活性を有する化合物のスクリーニングに有用であることが確認できた。

実施例３－６：腎線維症に関するバイオマーカー探索法
　線維化を誘導したRSCの培養上清の成分分析を行うことで、腎線維症に関するバイオマーカーの探索を行った。
　RSPを2×10⁶ cells/ dishで10 cm dishに播種し、STEMdiff APEL2培地（STEMCELL Technologies、ST-05275）にてRSCへの誘導を開始した。培養7日目（D7）に10 ng/ml TGFβ1を添加し、さらに9日間培養を行って線維化を誘導した。
　培養上清を回収し、アルブミン、IgG、IgAを除去した後、アセトン沈殿及びトリプシン消化を行ってペプチド断片を得た。LC/MS分析により、ペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。
　結果、線維化マーカーとして広く知られているFibronectin (FN1)のペプチド断片が検出され、さらにTGFβ1処置を行った細胞の培養上清では無処置の細胞の培養上清に比して約10倍のFN1が検出された。

［実施例４：腎臓オルガノイド（Mini-kidney）の作製］
実施例４－１：iPSCから中間中胚葉（intermediate
mesoderm: IM）への分化誘導
　iPSCのIMへの分化誘導と、IMと実施例２で得られたRSPとからの腎臓オルガノイドの分化誘導は、非特許文献６および非特許文献７を参考にして行った。
　ヒトiPSCには、1231A3株を用いた。
　ヒトiPSCを、Laminin-511をコートした6 well plateに5.76×10⁵ cells/wellで播種し、10μM Y-27632を添加したStemFit AK03N (A+B+C)培地で24時間予備培養した。
　5% PFHM-II（Thermo Fisher、#1204007）を添加したAPEL2培地（以下、「IM誘導基本培地」とも称する）に8μM CHIR99021を加えた培地で4日間培養した。次に、IM誘導基本培地に200 ng/ml FGF9と1μg/ml heparin（富士フイルム和光純薬株式会社、#081-00136）を加えた培地で3日間培養し、IMを得た（Day 7）。

実施例４－２：EPO-emGFP/GAPDH-tdTomato
(GAPDH-tdT)デュアルノックインヒトiPS細胞株の樹立
　実施例２－１で樹立したEPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株にさらにGAPDHプロモーターの制御下で発現するGAPDHとtdTomatoの融合タンパク質（GAPDH-tdT）をノックインした。
　EPO-emGFPノックインヒトiPS細胞株に、GAPDH遺伝子の終止コドン部位をF2A-tdTに置換したドナーベクター、ターゲット配列のsgRNA （Integrated DNA Technologies）およびSpCas9 D10A nickaseタンパク質（Integrated DNA Technologies、#1081062）の複合体をNeon Transfection system（Life Technologies）を用いて共導入した。
　tdTの蛍光により細胞の選別を行い、PCRによって目的遺伝子が染色体に挿入された細胞をEPO-emGFP/GAPDH-tdTデュアルノックインヒトiPS細胞株として得た。

実施例４－３：RSPとIMの共培養
　実施例４－１における7日目のIMをAccutase（Innovative Cell Technologies、AT104）で乖離した。また、実施例４－２で作製したEPO-emGFP/GAPDH-tdTデュアルノックインヒトiPS細胞株から実施例１および実施例２に記載の方法でRSPを誘導した。
　IMとRSP（tdT-labeled）を混合して細胞隗（ペレット）を作成し、トランスウェル（Corning、#3450）上に播種して共培養した。5×10⁵ cells/pelletのIMに対して、1/5量（1×10⁵ cells/pellet）もしくは1/25量（2×10⁴ cells/pellet）のRSPを混合した。
　細胞隗（ペレット）は、5μM CHIR99021と1μg/ml heparinを添加したIM誘導基本培地で1時間処理した後、200 ng/ml FGF9と1μg/ml heparinを添加したIM誘導基本培地で5日間培養した。その後、培地を1μg/ml heparinを添加したIM誘導基本培地に交換し、さらに3週間程度培養を行って腎臓オルガノイド（Mini-kidney）を得た。腎臓オルガノイドの顕微鏡像を図１６に示す。

実施例４－４：Mini-kidneyの低酸素条件下でのEPO産生能の評価
　実施例４－３で得られた、共培養開始から25日目の腎臓オルガノイド（Mini-kidney、IM+RSP (D25)）およびRSPを含まない腎臓オルガノイド（KiO (D25)）よりRNAを抽出し、Ion AmpliSeq^TM Transcriptome Human Gene Expression Kit（ThermoFisher:、#A26326）にてトランスクリプトーム解析用ライブラリを作製した。作製したライブラリをIon 54^TM Chip Kit（ThermoFisher、#A27765）を用いてシークエンス解析（Ion S5 XLシーケンサ、ThermoFisher）することによりEPO mRNAの発現量を定量した。
　結果を図１７に示す。iPS細胞株、IM、およびRSPを含まない腎臓オルガノイド（KiO (D25)）においてはいずれもEPO mRNAの有意な発現がみられなかった。これに対し、Mini-kidney（IM+RSP (D25)）ではEPO mRNAの有意な発現が確認された。また、実施例１－４と同様の方法でMini-kidneyの低酸素応答性を確認したところ、低酸素刺激（100μM FG-4592）によりEPO発現量が増加した（IM+RSP (D25) + FG4592）。

実施例４－５：Mini-kidneyの腎間質細胞マーカーの評価
　実施例４－４で作成したtranscriptome用ライブラリのシークエンス解析により、腎間質細胞マーカー（Desmin, Vimentin, PDGFRβ, CD73）のmRNA発現量を定量した。
　結果を図１８に示す。Mini-kidney（IM+RSP (D25)）においては、いずれの腎間質細胞マーカーも発現が確認された。また、実施例１－４と同様の方法でMini-kidney（IM+RSP (D25)）の低酸素応答性を確認したところ、低酸素刺激（100μM FG-4592）によりDesminおよびCD73の発現量が減少した（IM+RSP (D25) + FG4592）。

実施例４－６：腎臓オルガノイド（Mini-kidney）の糸球体マーカーおよび尿細管マーカーの評価
　糸球体細胞マーカーであるWT1および尿細管細胞マーカーであるLTLの発現を免疫染色により検出した。WT1陽性細胞とLTL陽性細胞が隣り合わせに局在していることが確認された（図１９参照）。

実施例４－７：Mini-kidneyの細胞ポピュレーションの評価
　実施例４－３で得られた、共培養開始から25日目の腎臓オルガノイド（Mini-kidney、IM+RSP (D25)）およびRSPを含まない腎臓オルガノイド（KiO (D25)）を単細胞に乖離した。シングルセル解析プラットフォーム（Chromium Controller: 10X Genomics: #1000202）を利用して、cDNAライブラリの作成、塩基配列の決定およびT-SNE plotの生成を行った。
　T-SNE plotを図２０に示す。RSPを含む腎臓オルガノイド（IM+RSP (D25)、図右）では、RSPを含まない腎臓オルガノイド（KiO (D25)、図左）に比して、RSPのポピュレーションに加えてRSCのポピュレーションも増加しており、IMとの共培養によりRSPからRSCへの分化が促進されていることが示された。なお、RSCのポピュレーションではNELL2, PAX7, NGFRおよびNRKの発現が上昇していることを確認できた。

［実施例５：RSPのin vivo移植実験］
　RSPの生体内での機能を確認するため、免疫不全NOGマウス（In-Vivo Science）の腎皮膜下にRSPを移植した。
　実施例４－２で樹立したEPO-emGFP/GAPDH-tdTomato (GAPDH-tdT)デュアルノックインヒトiPS細胞株を用い、実施例１，２に記載の方法にしたがってRSPを誘導した。RSPを30,000 cells/wellでPrimeSurface 96-well V bottom plate（住友ベークライト #MS-9096V）に播種し、3日間培養することで細胞隗を形成させた。NOGマウスの左腎皮膜下に細胞隗を移植した。35日後に、細胞塊を移植した腎臓を取り出し、実体顕微鏡（Leica, MZ10F）でGAPDH-tdTの蛍光観察を行った。
　結果、移植した細胞隗から細胞が遊走し、腎内に生着していることが確認された（図２１参照）。さらに、蛍光顕微鏡（キーエンス、BZ-700）を用いた蛍光観察により、移植したRSP（GAPDH-tdT陽性細胞）の一部でEPO-emGFPの蛍光を確認した（図２２参照）。

Claims

　血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程（３）を含む、腎間質細胞の製造方法。
　前記培地が、さらに塩基性線維芽細胞成長因子および／または線維芽細胞成長因子９を含む、請求項１記載の製造方法。
　神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）をさらに含む、請求項１または２記載の製造方法。
　ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ならびにレチノイン酸および／またはその誘導体を含む培地で多能性幹細胞を培養し神経堤細胞を誘導する工程（１）をさらに含む、請求項１－３のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記神経堤細胞が、後脳神経堤細胞である、請求項３または４記載の製造方法。
　前記腎間質細胞が、低酸素条件下でエリスロポエチンを産生する、請求項１－５のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記血小板由来成長因子受容体アゴニストが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、請求項１‐６のいずれか一項に記載の製造方法。
　血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む、腎間質細胞製造用培地。
　塩基性線維芽細胞成長因子および／または線維芽細胞成長因子９をさらに含む、請求項８記載の培地。
　前記血小板由来成長因子受容体アゴニストが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、請求項８または９に記載の培地。
　腎間質細胞または腎間質前駆細胞と、中間中胚葉と、を共培養する工程を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。
　腎間質細胞または腎間質前駆細胞が、
血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程（３）を含む、腎間質細胞の製造方法で得られるもの、または
神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）で得られるもの
である、請求項１１記載の製造方法。
　腎線維症の予防または治療のための物質のスクリーニング方法であって、
請求項１－７のいずれか一項に記載の製造方法により得られた腎間質細胞を、該細胞の線維化を誘導する物質の存在下で培養し、線維化腎間質細胞を含む細胞集団を提供する手順と、
被験物質の存在下および非存在下で前記細胞集団を培養する手順と、
各前記細胞集団における細胞の線維化の程度を測定する手順と、
前記被験物質の存在下で培養した細胞集団において、前記被験物質の非存在下で培養した細胞集団に比して細胞の線維化の程度を低下させた被験物質を選択する手順と、
を含む、方法。
　腎線維症のバイオマーカーを決定する方法であって、
請求項１－７のいずれか一項に記載の製造方法により得られた腎間質細胞を、該細胞の線維化を誘導する物質の存在下で培養し、線維化腎間質細胞を含む細胞集団を提供する手順と、
前記細胞集団の培養液に含まれる物質を同定する手順と、
同定された物質と、腎線維症に罹患した哺乳動物の体液中に含まれる物質と、を比較して、一致する物質を特定する手順と、
を含む、方法。
　腎間質前駆細胞を含有してなる、腎障害の予防または治療のための医薬の製造方法であって、神経堤細胞から腎間質前駆細胞を誘導する工程（２）を含む、製造方法。
　腎間質細胞を含有してなる、腎障害の予防または治療のための医薬の製造方法であって、血小板由来成長因子受容体アゴニストを含む培地で腎間質前駆細胞を培養して腎間質細胞を得る工程（３）を含む、製造方法。
　ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ならびにレチノイン酸および／またはその誘導体を含む培地で多能性幹細胞を培養し神経堤細胞を誘導する工程（１）をさらに含む、請求項１５または１６に記載の製造方法。
　多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞を含む医薬。
　多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞を含む、腎障害の予防剤または治療剤。
　多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞を対象に投与する手順を含む、腎障害の予防または治療方法。
　腎障害の予防または治療に使用するための、多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞。
　腎障害の予防または治療のための医薬の製造のための、多能性幹細胞由来腎間質前駆細胞および／または多能性幹細胞由来腎間質細胞の使用。