JP2013116854A - エリスロポエチンの製造方法およびエリスロポエチン産生細胞の単離方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】より天然の状態に近いEPOを効率よく製造する方法を提供すること、およびEPO産生細胞を効率よく単離する方法を提供すること。
【解決手段】神経堤由来細胞を培地中で培養してエリスロポエチンを産生させ、培地からエリスロポエチンを回収することを含む、エリスロポエチンの製造方法、および腎臓組織からエリスロポエチン産生細胞を単離する方法であって、腎臓組織に含まれる細胞群から神経堤由来細胞特異的表面抗原を利用してエリスロポエチン産生細胞を単離することを含む方法。
【選択図】図６
【解決手段】神経堤由来細胞を培地中で培養してエリスロポエチンを産生させ、培地からエリスロポエチンを回収することを含む、エリスロポエチンの製造方法、および腎臓組織からエリスロポエチン産生細胞を単離する方法であって、腎臓組織に含まれる細胞群から神経堤由来細胞特異的表面抗原を利用してエリスロポエチン産生細胞を単離することを含む方法。
【選択図】図６
Description
本発明は、エリスロポエチンの製造方法、エリスロポエチン産生細胞の単離方法および該エリスロポエチン産生細胞を用いた医薬に関する。
エリスロポエチン(EPO)は赤血球産生に不可欠のホルモンである。EPOは主に腎臓で産生され、その産生は慢性腎疾患の患者で顕著に減少する。すなわち、腎不全に陥ると腎臓からのEPO産生が低下し、腎性貧血に陥る。近年では、その治療に組換えEPOが用いられており、その医療費は年間1400億円にも達する。しかしながら、組換えEPOはヒト由来ではない細胞を用いて合成されたものであり、調製に手間と費用がかかり、修飾もヒトとは異なるため、内因性EPOよりも活性や安定性が低く、繰り返し投与することが必要である。医療現場での投与は週一回の皮下注射であり、その血中濃度の推移は内因性EPOの日内変動や低酸素や炎症といった分泌刺激に対する応答を欠いている。
EPOの生理学的役割は詳細に解析されているが、腎におけるEPO産生細胞の性質はいまだに明らかになっていない。in situ hybridizationにより、EPOとecto-5'-nucleotidaseが腎臓皮質の尿細管周囲に共局在することが示されている（非特許文献１）。また、EPOプロモーターの制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウスを用いた解析結果に基づき、EPOは主に腎臓の皮質深部と髄質外部表面の神経系の特徴を有する間質“線維芽細胞様”細胞において産生されるとした報告もあるが（非特許文献２）、EPO産生細胞の大部分はそれでは説明できない。
また、EPO産生細胞は幹細胞から発生するという考えにもとづいて多くの研究が行われており、非特許文献３ではラットの胃の小網上で間葉系幹細胞を培養することでEPO産生細胞を誘導する方法が開示されている。一方、ES細胞やiPS細胞などを腎臓方向に誘導し、EPO産生細胞を作製することが試みられているが、未だに成功していない。
また、抗EPO抗体を用いてマウス腎臓よりEPO産生細胞を単離したと報告する非特許文献４が存在する。この文献では、腎皮質をミンチして得られた細胞を全部培養皿にまいた後で抗EPO抗体を用いてEPO産生細胞を得たと記載されているものの、この手法でEPO産生細胞が濃縮される根拠は全くない。そもそも、EPOは産生中は細胞内に存在する蛋白質であることから、フローサイトメトリーで検出するためには細胞膜に穴をあけて抗体が細胞内に届く状態にする必要があり、その時点で細胞は死ぬので、抗EPO抗体を用いたソーティングによって細胞を取得し、培養するのは不可能である。そして、この論文では用いた抗EPO抗体の評価もなされておらず、論文に記載された結果については非常に信憑性に乏しい。実際のところ、これまでに、EPO産生細胞を効率よく単離することは達成されておらず、EPO産生細胞の性質や挙動は未だに十分明らかにはなっていない。
また、EPO産生細胞は幹細胞から発生するという考えにもとづいて多くの研究が行われており、非特許文献３ではラットの胃の小網上で間葉系幹細胞を培養することでEPO産生細胞を誘導する方法が開示されている。一方、ES細胞やiPS細胞などを腎臓方向に誘導し、EPO産生細胞を作製することが試みられているが、未だに成功していない。
また、抗EPO抗体を用いてマウス腎臓よりEPO産生細胞を単離したと報告する非特許文献４が存在する。この文献では、腎皮質をミンチして得られた細胞を全部培養皿にまいた後で抗EPO抗体を用いてEPO産生細胞を得たと記載されているものの、この手法でEPO産生細胞が濃縮される根拠は全くない。そもそも、EPOは産生中は細胞内に存在する蛋白質であることから、フローサイトメトリーで検出するためには細胞膜に穴をあけて抗体が細胞内に届く状態にする必要があり、その時点で細胞は死ぬので、抗EPO抗体を用いたソーティングによって細胞を取得し、培養するのは不可能である。そして、この論文では用いた抗EPO抗体の評価もなされておらず、論文に記載された結果については非常に信憑性に乏しい。実際のところ、これまでに、EPO産生細胞を効率よく単離することは達成されておらず、EPO産生細胞の性質や挙動は未だに十分明らかにはなっていない。
神経堤は脊椎動物の発生段階において神経管の背側領域に由来する一過的な組織である（非特許文献５）。神経堤由来細胞は神経管から剥離され、様々な方向に遊走し、末梢神経系や頭部顔面骨格を含む幅広い種類の細胞に分化する。神経堤細胞は副腎髄質のクロム親和性細胞や副腎外のパラガングリアの主細胞や甲状腺内分泌細胞などの内分泌細胞にも分化する（非特許文献６）。分化途中の腎臓の間質ストローマ細胞も神経堤由来であるという仮説が提唱されており、初期の移植実験により、ウズラの神経堤のニワトリ胚への移植により、ウズラ神経堤細胞がニワトリ胚の腎臓間質に見出されたという報告がある（非特許文献７，８）。さらに、発生途中にある腎臓の間質細胞が神経堤マーカーであるジシアルガングリオシドGD3や神経フィラメント軽鎖および中鎖タンパク質を発現するという報告もある（非特許文献９，１０）。しかしながら、成体腎において神経堤由来細胞が存在し、生理学的に機能しているという報告はない。
J Histochem Cytochem 41, 335-41 (1993)
Blood 111, 5223-32 (2008)
Transplantation 85(11), 1654-1658 (2008)
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Cell 54, 235-45 (1988)
Int J Dev Biol 38, 77-84 (1994)
本発明は、より天然の状態に近いEPOを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。本発明はまた、EPO産生細胞を効率よく単離する方法を提供すること、および得られたEPO産生細胞を用いた医薬を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、腎臓の神経堤由来細胞がEPOを産生することを見出し、神経堤細胞をその表面抗原を利用して単離するか、iPS細胞などから誘導し、適当な条件で培養を行うことによりEPOを効率よく生産できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）神経堤由来細胞を培地中で培養してエリスロポエチンを産生させ、培地からエリスロポエチンを回収することを含む、エリスロポエチンの製造方法。
（２）神経堤由来細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである、（１）に記載の方法。（３）腎臓組織からエリスロポエチン産生細胞を単離する方法であって、腎臓組織に含まれる細胞群から神経堤由来細胞特異的表面抗原を利用してエリスロポエチン産生細胞を単離することを含む方法。
（４）神経堤由来細胞特異的表面抗原が、p75、PDGFR（platelet-derived growth factor
receptor）α及びPDGFRβからなる群より選択される一種類以上である、（３）に記載の方法。
（５）エリスロポエチン産生神経堤細胞の培養方法であって、PDGF、NGF、HGF、Tsukushi、Activin、Follistatin、BMP-7、LIF、EGF family ligands、エストロゲン、アンドロゲン、BDNF、GDNF、レチノイン酸、bFGF、jagged-1、TGFα、およびアンジオテンシンIIからなる群より選択される一種類以上の因子を含む培地で培養することを特徴とする方法。（６）神経堤由来細胞からなる細胞を含む、腎疾患治療用移植材料。
（７）PDGF、NGF、HGF、Tsukushi、Activin、Follistatin、BMP-7、LIF、EGF family ligands、エストロゲン、アンドロゲン、BDNF、GDNF、レチノイン酸、bFGF、jagged-1、TGFα、およびアンジオテンシンIIからなる群より選択される一種類以上の因子を含む、エリスロポエチン産生細胞増殖促進剤。
（１）神経堤由来細胞を培地中で培養してエリスロポエチンを産生させ、培地からエリスロポエチンを回収することを含む、エリスロポエチンの製造方法。
（２）神経堤由来細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである、（１）に記載の方法。（３）腎臓組織からエリスロポエチン産生細胞を単離する方法であって、腎臓組織に含まれる細胞群から神経堤由来細胞特異的表面抗原を利用してエリスロポエチン産生細胞を単離することを含む方法。
（４）神経堤由来細胞特異的表面抗原が、p75、PDGFR（platelet-derived growth factor
receptor）α及びPDGFRβからなる群より選択される一種類以上である、（３）に記載の方法。
（５）エリスロポエチン産生神経堤細胞の培養方法であって、PDGF、NGF、HGF、Tsukushi、Activin、Follistatin、BMP-7、LIF、EGF family ligands、エストロゲン、アンドロゲン、BDNF、GDNF、レチノイン酸、bFGF、jagged-1、TGFα、およびアンジオテンシンIIからなる群より選択される一種類以上の因子を含む培地で培養することを特徴とする方法。（６）神経堤由来細胞からなる細胞を含む、腎疾患治療用移植材料。
（７）PDGF、NGF、HGF、Tsukushi、Activin、Follistatin、BMP-7、LIF、EGF family ligands、エストロゲン、アンドロゲン、BDNF、GDNF、レチノイン酸、bFGF、jagged-1、TGFα、およびアンジオテンシンIIからなる群より選択される一種類以上の因子を含む、エリスロポエチン産生細胞増殖促進剤。
本発明の方法により、従来の組換えEPOでは得られなかった高活性で高安定性のEPOを効率よく製造することができる。特に、iPS細胞から誘導した神経堤細胞を用いると、大量生産も可能である。EPOは慢性腎疾患などの治療に有効である。また、EPOの種々の非造血
系組織における組織保護に関する別の役割も示唆されており、将来、組織障害などにも適用される可能性がある。
さらに、単離されたEPO産生細胞をカプセル化して移植することにより、移植細胞の腫瘍化や免疫応答を回避し、体内の状況に応じたEPOの産生および分泌を達成することも可能である。
系組織における組織保護に関する別の役割も示唆されており、将来、組織障害などにも適用される可能性がある。
さらに、単離されたEPO産生細胞をカプセル化して移植することにより、移植細胞の腫瘍化や免疫応答を回避し、体内の状況に応じたEPOの産生および分泌を達成することも可能である。
本発明のエリスロポエチンの製造方法は、神経堤由来細胞を培地中で培養し、エリスロポエチンを産生させて、培地からエリスロポエチンを回収することを含む。
ここで、神経堤由来細胞は線維芽細胞であることが好ましい。
神経堤(neural crest)とは、脊椎動物の発生における神経管形成時、神経外胚葉と表皮外胚葉との境界に現れる一過的組織のことをいい、ここから脱上皮化して遊走する細胞群のことを神経堤由来細胞neural crest cellsという（J Cell Biochem 107, 1046-52 (2009)）。
ここで、神経堤由来細胞は線維芽細胞であることが好ましい。
神経堤(neural crest)とは、脊椎動物の発生における神経管形成時、神経外胚葉と表皮外胚葉との境界に現れる一過的組織のことをいい、ここから脱上皮化して遊走する細胞群のことを神経堤由来細胞neural crest cellsという（J Cell Biochem 107, 1046-52 (2009)）。
神経堤由来細胞は、神経堤マーカーであるp75（neurotrophin receptor）、PDGFR（platelet-derived growth factor receptor）α、およびPDGFRβなどの細胞表面マーカーの存在により定義付けられる（下記文献参照）。
J Cell Biochem 107, 1046-52 (2009).
Stem Cells Dev. 2009, 18(7):1059-1070
Development 1997 124(14) p2691-2700
J Cell Biochem 107, 1046-52 (2009).
Stem Cells Dev. 2009, 18(7):1059-1070
Development 1997 124(14) p2691-2700
神経堤由来細胞を培養するための培地は、線維芽細胞の培養に通常用いられる培地であればよく、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改
変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地、DMEM/F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。
神経堤由来細胞を培養するための培地には、EPO産生細胞の増殖を促進するための因子を添加することが好ましい。このような成分としては、以下のようなものが挙げられる。これらの因子は１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で加えることが好ましい。
PDGF（platelet-derived growth factor：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB）
NGF（nerve growth factor）
HGF（hepatocyte growth factor）
Tsukushi（Development. 2006 Jan;133(1):75-88）
Activin
Follistatin
BMP（Bone Morphogenetic Protein）-7
LIF（Leukemia Inhibitory Factor）
EGF（Epidermal Growth Factor）family ligands（EGF、amphiregulin、HB-EGF、Nrg-1）
エストロゲン
アンドロゲン
BDNF（Brain-derived neurotrophic factor）
GDNF（Glial cell-line derived neurotrophic factor）
レチノイン酸
bFGF（basic fibroblast growth factor）
jagged-1
TGF（Transforming growth factor）α
アンジオテンシンII
変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地、DMEM/F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。
神経堤由来細胞を培養するための培地には、EPO産生細胞の増殖を促進するための因子を添加することが好ましい。このような成分としては、以下のようなものが挙げられる。これらの因子は１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で加えることが好ましい。
PDGF（platelet-derived growth factor：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB）
NGF（nerve growth factor）
HGF（hepatocyte growth factor）
Tsukushi（Development. 2006 Jan;133(1):75-88）
Activin
Follistatin
BMP（Bone Morphogenetic Protein）-7
LIF（Leukemia Inhibitory Factor）
EGF（Epidermal Growth Factor）family ligands（EGF、amphiregulin、HB-EGF、Nrg-1）
エストロゲン
アンドロゲン
BDNF（Brain-derived neurotrophic factor）
GDNF（Glial cell-line derived neurotrophic factor）
レチノイン酸
bFGF（basic fibroblast growth factor）
jagged-1
TGF（Transforming growth factor）α
アンジオテンシンII
なお、これらの物質はEPO産生細胞の増殖を促進することができるため、エリスロポエチン産生細胞増殖剤として使用することができる。
培養条件は通常の細胞培養の条件であればよいが、例えば、37℃、5％CO2の条件が挙げられる。
培養により培地中に分泌されたEPOは公知の方法に従って精製することができる。
例えば、欧州特許公開第EP-A 0267678号において、透析後の血清非含有培養中に生成されたEPOの精製について、S-セファロース上でのイオン交換クロマトグラフィー、C8カラム上での分取逆相HPLCおよびゲルろ過クロマトグラフィーが開示されている。
また、組換えEPOの精製工程は、Nobuo, I. ら、J. Biochem.107:352-359(1990)に記されており、同様の方法も利用できる。さらに、抗EPO抗体を用いたアフィニティ精製によりEPOを精製することもできる。
例えば、欧州特許公開第EP-A 0267678号において、透析後の血清非含有培養中に生成されたEPOの精製について、S-セファロース上でのイオン交換クロマトグラフィー、C8カラム上での分取逆相HPLCおよびゲルろ過クロマトグラフィーが開示されている。
また、組換えEPOの精製工程は、Nobuo, I. ら、J. Biochem.107:352-359(1990)に記されており、同様の方法も利用できる。さらに、抗EPO抗体を用いたアフィニティ精製によりEPOを精製することもできる。
神経堤由来細胞は哺乳動物の腎臓や骨髄より単離されたものを培養に使用することができる。
マウス、ラット等の小型哺乳動物やブタやウシなどの大型哺乳動物より腎臓を単離して腎臓の細胞集団を取得し、その中から、フローサイトメトリー等の手法により、上記の神経堤マーカー（細胞表面抗原）特異的抗体を用いてソーティングを行うことにより、神経堤由来細胞を得ることができる。
また、腎生検や手術などで得られたヒト腎組織より神経堤由来細胞を単離して培養に用いることもできる。
マウス、ラット等の小型哺乳動物やブタやウシなどの大型哺乳動物より腎臓を単離して腎臓の細胞集団を取得し、その中から、フローサイトメトリー等の手法により、上記の神経堤マーカー（細胞表面抗原）特異的抗体を用いてソーティングを行うことにより、神経堤由来細胞を得ることができる。
また、腎生検や手術などで得られたヒト腎組織より神経堤由来細胞を単離して培養に用いることもできる。
なお、より効率よく、大量に神経堤由来細胞を得るには、神経堤由来細胞を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）等の多能性幹細胞から誘導して用いること
が好ましい。
iPS細胞の製造方法は以下に示す。
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。
このような体細胞に核初期化因子を導入することにより、iPS細胞を得ることができる。核初期化物質は、WO 2007/069666に記載の遺伝子であってもよい。より詳細には、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc,
N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの組み合わせの中で、Oct3/4, Sox2, Klf4およびc-Mycの4因子並びにOct3/4, Sox2, およびKlf4の3因子が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。上記の各核初期化物質のヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
が好ましい。
iPS細胞の製造方法は以下に示す。
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。
このような体細胞に核初期化因子を導入することにより、iPS細胞を得ることができる。核初期化物質は、WO 2007/069666に記載の遺伝子であってもよい。より詳細には、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc,
N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの組み合わせの中で、Oct3/4, Sox2, Klf4およびc-Mycの4因子並びにOct3/4, Sox2, およびKlf4の3因子が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。上記の各核初期化物質のヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
iPS細胞からの神経堤細胞の誘導は以下の文献に記載されている。
Nat Biotechnol 27, 275-80 (2009)
すなわち、得られたiPS細胞をNogginおよびSB431542の存在下で培養することにより、神経堤由来細胞が誘導される。ただし、iPS細胞からの神経堤由来細胞の誘導方法はこれに限定されない。
Nat Biotechnol 27, 275-80 (2009)
すなわち、得られたiPS細胞をNogginおよびSB431542の存在下で培養することにより、神経堤由来細胞が誘導される。ただし、iPS細胞からの神経堤由来細胞の誘導方法はこれに限定されない。
なお、神経堤由来細胞を生体適合性ポリマーに封入してカプセル化し、腎不全、腎性貧血などの腎疾患患者に移植すれば、腎疾患患者のEPO産生を補うための治療に有用である。
移植部位は治療効果を達成できる部位であれば特に制限されないが、移植の容易性から、皮下移植が好ましい。
移植部位は治療効果を達成できる部位であれば特に制限されないが、移植の容易性から、皮下移植が好ましい。
細胞のカプセル化法は、当該分野で公知であり、そして以下の参考文献に開示される。
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：１９９−２０５（１９９９），
Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ Ｒｅｖ．４２：２９−６４（２０００）、
米国特許第５，７６２，９５９号，
米国特許第５，５５０，１７８号
米国特許第５，５７８，３１４号
ＷＯ ９１／０７９５１号
米国特許第４，３５３，８８８号。
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：１９９−２０５（１９９９），
Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ Ｒｅｖ．４２：２９−６４（２０００）、
米国特許第５，７６２，９５９号，
米国特許第５，５５０，１７８号
米国特許第５，５７８，３１４号
ＷＯ ９１／０７９５１号
米国特許第４，３５３，８８８号。
細胞のカプセル化法として、さらに、アクリル系ポリマー同士のイオン間相互作用によって形成されるマイクロカプセル（特公平５−３４９４６号公報）、コラーゲンゲル包括カプセル（特開昭６３−３７８６号公報）、カチオン性多糖を用いたポリイオン性マイクロ封入（特開昭６０−７５３２６号公報）、アガロース分解物を用いたカプセル（特開昭６２−２１５５３０号公報）なども提案されている。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
＜P0-Cre/Floxed-EGFP マウスおよびP0-Cre/R26Rマウスの腎間質に存在する神経堤系統線維芽細胞＞
腎臓における神経堤由来細胞の分布を調べるため、P0-Cre/Floxed-EGFP マウス（Stem Cells. 2006 Dec;24(12):2714-22）およびP0-Cre/R26Rマウス（Circ Res. 2006 Jun 23;98(12):1547-54）の腎臓の組織学的分析を行った。これらのマウスは、P0プロモーターの制御下でCreを発現するマウスをCAG-CATloxP/loxP-EGFPマウスまたはR26Rマウス（ROSA領域にlacZカセットが組み込まれたマウス）に掛け合わせることにより得られたものである。なお、P0（Protein 0）は胚芽期早期の移動性神経堤細胞およびSchwann細胞において発現している。これらトランスジェニックマウスにおいては、移動性神経堤細胞におけるP0プロモーターの活性化がCreによる組み換えを促進し、それにより、インジケーター遺伝子の発現による神経堤細胞のタグ付けが可能となる。
腎臓における神経堤由来細胞の分布を調べるため、P0-Cre/Floxed-EGFP マウス（Stem Cells. 2006 Dec;24(12):2714-22）およびP0-Cre/R26Rマウス（Circ Res. 2006 Jun 23;98(12):1547-54）の腎臓の組織学的分析を行った。これらのマウスは、P0プロモーターの制御下でCreを発現するマウスをCAG-CATloxP/loxP-EGFPマウスまたはR26Rマウス（ROSA領域にlacZカセットが組み込まれたマウス）に掛け合わせることにより得られたものである。なお、P0（Protein 0）は胚芽期早期の移動性神経堤細胞およびSchwann細胞において発現している。これらトランスジェニックマウスにおいては、移動性神経堤細胞におけるP0プロモーターの活性化がCreによる組み換えを促進し、それにより、インジケーター遺伝子の発現による神経堤細胞のタグ付けが可能となる。
腎臓の免疫染色は次のようにして行った。単離された腎臓を４％パラホルムアルデヒドで固定化し、Cryomold（商標）に包埋し、６μｍの切片にスライスした。1次抗体には、抗EGFP抗体 (Molecular Probe), 抗p75抗体 (Advanced Targeting Systems), 抗TH抗体 (Chemicon), 抗Cre抗体 (Novagen) および 抗P0抗体 (Aves)を用いた。2次抗体はAlexa 488 または Alexa 568 (Molecular Probes)で蛍光標識したものを用いた。
P0-Cre/Floxed-EGFP マウス（８週齢）の腎臓におけるEGFP免疫染色を行った結果、皮質深部と髄質外部において数多くのEGFP陽性細胞の存在が明らかとなった（図１A、B）。一方、コントロールのfloxed-EGFPを持たないP0-Creマウスの腎臓のEGFP染色ではEGFP陽性細胞は検出されなかった（図１C）。
P0-Cre/R26R マウスの腎臓のLacZ染色はP0-Cre/Floxed-EGFP マウスの結果とほとんど同じであった。
これらの細胞は間質、すなわち、尿細管と栄養尿細管周囲毛細血管（PTC）の間のスペースに存在し、様々な方向に伸びる突起を有する独特の星型形状を示した。これらの観察結果から、神経堤由来細胞は腎臓間質に遊走し、そこで生き延びていることが示唆された。
P0-Cre/R26R マウスの腎臓のLacZ染色はP0-Cre/Floxed-EGFP マウスの結果とほとんど同じであった。
これらの細胞は間質、すなわち、尿細管と栄養尿細管周囲毛細血管（PTC）の間のスペースに存在し、様々な方向に伸びる突起を有する独特の星型形状を示した。これらの観察結果から、神経堤由来細胞は腎臓間質に遊走し、そこで生き延びていることが示唆された。
また、P0-Cre/Floxed-EGFP マウス（８週齢）の腎臓をEGFPと線維芽細胞マーカーであるCD73/5'NT (ecto-5'-nucleotidase) またはPDGF receptorβ（PDGFRβ）で2重染色した結果、EGFP陽性細胞はこれらのマーカーを発現していた(図２Ａおよび２Ｂ)。これらのよく知られたマーカーに加えて、新生児の腎臓の線維芽細胞は成人の病態腎における筋線維芽細胞のマーカーであるαSMAを発現していると報告されている（Am J Pathol 173, 1617-27 (2008)）。EGFPとαSMAで2重染色を行った結果、新生児の腎臓のEGFP陽性細胞のほとんどが、αSMA (図２Ｃ)を発現しており、P0-Cre/Floxed-EGFPマウスの腎臓におけるEGFP陽性細胞は線維芽細胞であることが示唆された。
さらに、P0-Cre/R26Rマウス（８週齢）やP0-Cre/Floxed-EGFP マウス（８週齢）の腎臓において染色を行った結果、これらのEGFP陽性線維芽細胞やLacZ陽性線維芽細胞が神経堤マーカーであるp75 やPDGFRαを発現し、かつ神経堤幹細胞由来の線維芽細胞のマーカーであるThy1も発現することが確認された(図３A〜D)。これらのことから、すべてではないにしろ、腎臓の皮質深部と髄質外部に存在する多くの線維芽細胞が神経堤由来であり、神経堤マーカーを依然として発現していることがわかった。
＜神経堤由来細胞は胎児の腎および精巣に遊走する＞
上記のとおり、神経堤由来細胞は成体及び新生児の腎臓間質において線維芽細胞に分化する。神経堤細胞の腎臓への遊走経路を調べるために、P0-Cre/R26Rマウス胚の腎形成が始まる胎生11.5日から新生児期まで連続して組織学的解析を行った。LacZ+ 細胞は胎生12.5日までほとんど観察されなかったが、胎生13.5日からLacZ+ 細胞が後腎臓、特に嚢沿いと尿管の周囲の門において数多く観察され、ここが遊走経路と予想された(図４ＡおよびＢ)。嚢沿いのLacZ+ 細胞はSix2+後腎間葉細胞を避けて皮質に遊走しているように思われた (図４Ｃ)。
上記のとおり、神経堤由来細胞は成体及び新生児の腎臓間質において線維芽細胞に分化する。神経堤細胞の腎臓への遊走経路を調べるために、P0-Cre/R26Rマウス胚の腎形成が始まる胎生11.5日から新生児期まで連続して組織学的解析を行った。LacZ+ 細胞は胎生12.5日までほとんど観察されなかったが、胎生13.5日からLacZ+ 細胞が後腎臓、特に嚢沿いと尿管の周囲の門において数多く観察され、ここが遊走経路と予想された(図４ＡおよびＢ)。嚢沿いのLacZ+ 細胞はSix2+後腎間葉細胞を避けて皮質に遊走しているように思われた (図４Ｃ)。
次に、神経堤由来細胞の後腎への遊走を誘導するシグナル経路を解析した。LacZ+ 細胞は神経堤マーカーである p75 と PDGFRaを発現していた(図４ＤおよびＥ)。PDGFRaを発現する神経堤細胞はリガンドであるPDGF-AとPDGF-Cを発現する器官に向かって遊走する（Genes Dev 22, 1276-312 (2008)）。Li らはPDGF-A とPDGF-C が初期腎上皮凝集体および後腎間質において強く発現していることを報告している（Nat Cell Biol 2, 302-9 (2000)）。
したがって、PDGFRaを発現する神経堤細胞はPDGFRシグナルを介して腎臓に遊走することが考えられた。この仮説を検証するために、野生型マウスの胎生12.5日の後腎を、PDGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤の非存在下および存在下、胎生8.5日のP0-Cre/R26Rマウスの神経管と共培養した。神経堤細胞は神経管から伸長し、後腎に向かって遊走したが、この遊走は、PDGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤によって抑制された。このことから、神経堤由来細胞の遊走へのPDGFRシグナルの関与が示された(データは示さず)。
神経堤細胞の腎臓への進入もまたPDGFRシグナルによることを検証するため、神経堤細胞が嚢と尿管の周囲に現れる胎生12.5日のP0-Cre/R26R マウスの後腎を、PDGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤の非存在下および存在下培養した。その結果、PDGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤の存在下では、LacZ+ 細胞は外皮質の表面にとどまっており、腎臓には進入しなかった (データは示さず)。これらの結果から、神経堤細胞はPDGFRシグナルを介して腎臓に遊走し、進入することが考えられた。
神経堤細胞の腎臓への進入もまたPDGFRシグナルによることを検証するため、神経堤細胞が嚢と尿管の周囲に現れる胎生12.5日のP0-Cre/R26R マウスの後腎を、PDGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤の非存在下および存在下培養した。その結果、PDGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤の存在下では、LacZ+ 細胞は外皮質の表面にとどまっており、腎臓には進入しなかった (データは示さず)。これらの結果から、神経堤細胞はPDGFRシグナルを介して腎臓に遊走し、進入することが考えられた。
＜神経堤由来線維芽細胞はEPOを産生する＞
次に、腎に存在する神経堤由来線維芽細胞がEPOを産生しているかについて調べた。まず、P0-Cre/R26R マウスとEPO-EGFPマウス（180kbのマウスEpo遺伝子のプロモーターの制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウス）を交配させた。得られたマウスを用いて解析した結果、貧血誘導後の腎臓において、EGFPの蛍光が検出され、EPO産生細胞の存在が明らかとなった。P0-Cre/R26R/EPO-EGFPマウスの腎臓を解析したところ、約70%のEGFP+細胞はLacZ陽性であり(図５A-C)、神経堤由来細胞がEPO産生線維芽細胞に分化することが示された。
次に、腎に存在する神経堤由来線維芽細胞がEPOを産生しているかについて調べた。まず、P0-Cre/R26R マウスとEPO-EGFPマウス（180kbのマウスEpo遺伝子のプロモーターの制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウス）を交配させた。得られたマウスを用いて解析した結果、貧血誘導後の腎臓において、EGFPの蛍光が検出され、EPO産生細胞の存在が明らかとなった。P0-Cre/R26R/EPO-EGFPマウスの腎臓を解析したところ、約70%のEGFP+細胞はLacZ陽性であり(図５A-C)、神経堤由来細胞がEPO産生線維芽細胞に分化することが示された。
この実験結果を確認するため、P0-Cre/Floxed-EGFP マウスの腎を回収し、EGFP+ 細胞をFACS Ariaでソーティングした。具体的には、マウスに麻酔をかけ、生理食塩水で還流した後、腎臓を摘出し、剃刀で細かくし、コラゲナーゼ処理した。得られた細胞懸濁物をCellStrainer（商標）で処理してカスを除いた後、抗EGFP抗体に反応する細胞を取得した。
得られた細胞からRNAを抽出し、それを用いてRT-PCRを行った結果、EGFP+ 細胞においてEPOとp75の高発現が確認できたが、EGFP-細胞ではこれらの発現が見られなかった(図６Ａ)。
また、同様に、抗p75抗体を用いて、P0-Cre/Floxed-EGFP マウスの腎からp75+ 細胞をソーティングし、得られたp75+ 細胞においてEPOとEGFPの発現を調べたところ、p75+ 細胞ではEPOとEGFPの高発現が見られ、p75- 細胞ではこれらの発現が見られなかった(図６Ｂ)。これらの結果から、EPO産生細胞が神経堤由来であることが示された。
なお、RT-PCRのプライマーはPrimer Express software (Applied Biosystems)を用いて設
計し、50℃ 2分、95℃10分の後、（95℃15秒→60℃1分）を４０サイクル行った。
得られた細胞からRNAを抽出し、それを用いてRT-PCRを行った結果、EGFP+ 細胞においてEPOとp75の高発現が確認できたが、EGFP-細胞ではこれらの発現が見られなかった(図６Ａ)。
また、同様に、抗p75抗体を用いて、P0-Cre/Floxed-EGFP マウスの腎からp75+ 細胞をソーティングし、得られたp75+ 細胞においてEPOとEGFPの発現を調べたところ、p75+ 細胞ではEPOとEGFPの高発現が見られ、p75- 細胞ではこれらの発現が見られなかった(図６Ｂ)。これらの結果から、EPO産生細胞が神経堤由来であることが示された。
なお、RT-PCRのプライマーはPrimer Express software (Applied Biosystems)を用いて設
計し、50℃ 2分、95℃10分の後、（95℃15秒→60℃1分）を４０サイクル行った。
＜神経堤由来細胞を障害するとEPOの産生が低下する＞
生後8日のオスのマウス42 匹を４つのグループに分け、それぞれ、サポリン毒素結合抗p75抗体(p75Ab-saporin, Advanced Targeting Systems)、サポリン毒素結合コントロールIgG (IgG-saporin, Advanced Targeting Systems)、抗体(p75Ab, Advanced Targeting Systems)、コントロールIgG (Santa Cruz)を４μｇ投与した。22日後に一側尿管結紮（unilateral ureteral obstruction; UUO）を行った。UUOの14日後に、マウスから腎臓を取り出し、EPO産生を調べた。その結果、抗p75抗体にサポリン毒素を結合したものを野生型マウスに投与すると、腎におけるEPO産生が著しく低下することがわかった（図７）。このことは、神経堤由来細胞がEPOを産生することを裏付けている。
生後8日のオスのマウス42 匹を４つのグループに分け、それぞれ、サポリン毒素結合抗p75抗体(p75Ab-saporin, Advanced Targeting Systems)、サポリン毒素結合コントロールIgG (IgG-saporin, Advanced Targeting Systems)、抗体(p75Ab, Advanced Targeting Systems)、コントロールIgG (Santa Cruz)を４μｇ投与した。22日後に一側尿管結紮（unilateral ureteral obstruction; UUO）を行った。UUOの14日後に、マウスから腎臓を取り出し、EPO産生を調べた。その結果、抗p75抗体にサポリン毒素を結合したものを野生型マウスに投与すると、腎におけるEPO産生が著しく低下することがわかった（図７）。このことは、神経堤由来細胞がEPOを産生することを裏付けている。
＜HGFやNGFなどのサイトカインはEPO産生神経堤由来細胞の増殖を促進する＞
次に、単離された神経堤由来細胞の増殖に対する各種サイトカインの効果を調べた。具体的には、マウスの腎臓からEGFPを用いて単離された神経堤由来細胞1X105個を2ｍｌのDMEM10%FCS培地（サイトカイン非含有）に懸濁して、37℃、5％CO2の条件で72時間培養して増殖を調べた。結果を図８に示す。その結果、EPO産生細胞をHGFやNGFで刺激すると増殖が促進されることがわかった。
次に、単離された神経堤由来細胞の増殖に対する各種サイトカインの効果を調べた。具体的には、マウスの腎臓からEGFPを用いて単離された神経堤由来細胞1X105個を2ｍｌのDMEM10%FCS培地（サイトカイン非含有）に懸濁して、37℃、5％CO2の条件で72時間培養して増殖を調べた。結果を図８に示す。その結果、EPO産生細胞をHGFやNGFで刺激すると増殖が促進されることがわかった。
Claims (7)
- 神経堤由来細胞を培地中で培養してエリスロポエチンを産生させ、該培地からエリスロポエチンを回収することを含む、エリスロポエチンの製造方法。
- 神経堤由来細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである、請求項１に記載の方法。
- 腎臓組織からエリスロポエチン産生細胞を単離する方法であって、腎臓組織に含まれる細胞群から神経堤由来細胞特異的表面抗原を利用してエリスロポエチン産生細胞を単離することを含む方法。
- 神経堤由来細胞特異的表面抗原が、p75、PDGFR（platelet-derived growth factor receptor）α及びPDGFRβからなる群より選択される一種類以上である、請求項３に記載の方法。
- エリスロポエチン産生神経堤細胞の培養方法であって、PDGF、NGF、HGF、Tsukushi、Activin、Follistatin、BMP-7、LIF、EGF family ligands、エストロゲン、アンドロゲン、BDNF、GDNF、レチノイン酸、bFGF、jagged-1、TGFα、およびアンジオテンシンIIからなる群より選択される一種類以上の因子を含む培地で培養することを特徴とする方法。
- 神経堤由来細胞を含む、腎疾患治療用移植材料。
- PDGF、NGF、HGF、Tsukushi、Activin、Follistatin、BMP-7、LIF、EGF family ligands、エストロゲン、アンドロゲン、BDNF、GDNF、レチノイン酸、bFGF、jagged-1、TGFα、およびアンジオテンシンIIからなる群より選択される一種類以上の因子を含む、エリスロポエチン産生細胞増殖促進剤。
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