CN103857787A - 组织和器官的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供重构有成熟功能的组织及器官的手段。组织或器官的制作方法，其特征在于将器官细胞与血管内皮细胞及未分化间叶系细胞共培养，制作器官芽，将其移植进非人动物，其后，从非人动物取出移植的器官芽来源的组织或器官。

Description

组织和器官的制作方法

技术领域

本发明涉及从人工多能性干细胞（iPS细胞）等的未分化细胞制作器官芽、组织、和器官的方法。

背景技术

近年，利用具有向各种各样的功能细胞分化的能力的iPS细胞等的多能性干细胞，通过对创造性新药筛选或再生医疗有益的人功能细胞的分化诱导来开展研发的方法引人关注。至今进行着通过向多能性干细胞的培养系统添加各种各样的诱导因子等，分化诱导各种功能细胞的多种尝试（M.Schuldiner，et al.PNAS，97（21），11307-11312（2000），K.Si-Taiyeb，et al.Hepatology，51（1）：297-305（2010））。但是，在以往的不伴随三维组织结构的重构的分化诱导法中，存在难以诱导功能细胞的终末分化，分化诱导的效率低，再现性也低这样的大问题。

另一方面，对于重度的器官功能衰竭，在临床上进行器官移植或人工器官置换治疗。但是，器官移植存在排斥反应或绝对的供体不足，人工器官仅可短期间代替功能的一部分等（特开平9-56814号公报、特开2004-166717号公报），根本性的问题还是留下来没有解决。对于人组织的人为的制造而言，虽然考查了使用将终末分化的细胞下雹接种到载体（支架材料）的方法等，但对于肝脏等有复杂的高级功能的器官而言，现状是尚不存在已经明确建立的方法（非专利文献1）。即，现状是尚未实现明确建立用由在成体组织见到的多个细胞谱系构成的有秩序的立体结构的人组织－器官的重构法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:特开平9-56814号公报

专利文献2:特开2004-166717号公报

非专利文献

非专利文献1:Uygun，B.E.，et al.Nat Med，16（7），814-820（2010）

发明内容

发明要解决的技术课题

以往、使用多能性干细胞的分化诱导法是，通过组合添加液性因子的或基因导入等各种各样的分化因子来试图诱导细胞分化。但是，这些以往的方法不仅无法诱导终末分化的功能细胞，也未充分实现朝向其前体集团的组织干细胞的初期分化诱导。

另一方面，构成组织或器官的细胞不仅只有功能细胞，还存在血管系细胞或间充质细胞等多种细胞种类，再者，它们依靠取得有秩序的空间配置，通过发生协调性的相互作用而形成组织结构。但是，现状是，作为人组织－器官的重构技术只存在使用支架材料等的载体的方法，存在着接种的功能细胞的植入率极其低，长期培养困难，重构的组织－器官的功能显著未成熟的问题。

本发明旨在解决以上的问题，以提供重构有成熟功能的组织及器官的手段作为目的。

解决课题的技术方案

为了解决这些问题，发明人认为精致地再现化器官发生过程，同时诱导细胞分化和形态形成是必须的。即，开发出用于使用多种细胞，将不同的细胞谱系适宜地在时间空间内再构建成配置为3维组织结构体的新技术是极其重要的。本发明试着通过器官生长中产生的由多种细胞的细胞间相互作用的再现化的方法，开发3维的组织－器官的重构技术。

在生理性的器官生长过程中，通过器官细胞与血管内皮细胞及未分化之间叶系细胞具有密切的细胞间相互作用而进行自律性的组织结构的构建和伴随细胞分化的器官形成。

在本发明中旨在通过人为地再现这样的器官发生的早期过程，进行经由多种细胞谱系的相互作用的初期分化诱导，诱导完成初期分化的器官细胞的组织形成能力，在试管内人为地制作成为组织－器官的基原的器官芽（organ bud）。再者，将在培养系统中诱导的器官芽移植到活体内而开始血液流通，进行由终末分化的功能细胞和血管系统组成的组织－器官的制作。

具体而言，将由iPS细胞等的多能性干细胞得到的最适分化阶段的器官细胞与血管内皮细胞及间叶系细胞进行共培养。将这3种不同的细胞成分以最适的混合比率进行培养，在被细胞外基质成分支持的特殊的环境下，进行含特定的营养因子－液性因子的分化诱导培养基的初步短期间培养，从而使在试管内诱导有微小血管结构的立体的器官芽变得可能。再者，通过将在培养系统中诱导的器官芽移植到活体内，通过促进血管化而开始血液流通，从而使制作有与成体组织同等的有高度秩序的组织结构的组织－器官变得可能。认为血管内皮细胞和间叶系细胞中任何一方或两方也可用由血管内皮细胞分泌的因子，由间叶系细胞分泌的因子，由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子等的物质代替。

关注于这样的多种细胞的细胞间相互作用，尝试组织－器官的3维的重构的方法在过去是不存在的，被认为是新颖性极高的方法。

本发明的要点如下。

（1） 器官芽的制作方法，其包括将器官细胞与选自下述至少1种细胞及/或因子一同培养，所述的细胞及/或因子是：血管内皮细胞、间叶系细胞、血管内皮细胞分泌的因子；由间叶系细胞分泌的因子；由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子。

（2） （1）所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是分化的细胞。

（3） （1）所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是未分化的细胞。

（4） （1）～（3）中任一项所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是：内胚叶性器官的细胞或可能分化为内胚叶性器官的细胞的细胞、中胚叶性器官的细胞或可能分化为中胚叶性器官的细胞的细胞、或者外胚叶性器官的细胞或可能分化为外胚叶性器官的细胞的细胞。

（5） （4）所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是内胚叶性器官的细胞或可能分化为内胚叶性器官的细胞的细胞。

（6） （5）所述的器官芽的制作方法，其中内胚叶性器官是肝脏或胰腺。

（7） （1）～（6）中任一项所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是人工多能性干细胞来源的细胞。

（8） （7）所述的器官芽的制作方法，其中人工多能性干细胞是人来源。

（9） （1）～（8）中任一项所述的器官芽的制作方法，其与选自由血管内皮细胞、间叶系细胞、血管内皮细胞分泌的因子，由间叶系细胞分泌的因子，由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子的至少1种细胞及/或因子一同将器官细胞在血管内皮细胞培养用培养基中培养。

（10） （1）～（9）中任一项所述的器官芽的制作方法，其与选自由血管内皮细胞、间叶系细胞、血管内皮细胞分泌的因子，由间叶系细胞分泌的因子，由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子的至少1种细胞及/或因子一同将器官细胞接种于凝胶上进行培养。

（11） （1）～（10）中任一项所述的器官芽的制作方法，其中血管内皮细胞是分化的细胞。

（12） （1）～（10）中任一项所述的器官芽的制作方法，其中血管内皮细胞是未分化的细胞。

（13） （1）～（12）中任一项所述的器官芽的制作方法，其中间叶系细胞是分化的细胞。

（14） （1）～（12）中任一项所述的器官芽的制作方法，其中间叶系细胞是未分化的细胞。

（15）组织或器官的制作方法，其包括：将由（1）～（14）中任一项所述的方法制作的器官芽移植到非人动物，分化为组织或器官。

（16）器官芽的移植方法，其包括：将由（1）～（14）中任一项所述的方法制作的器官芽移植进人或非人动物。

（17） （16）所述的器官芽的移植方法，其中器官芽的移植部位选自：颅内、肠系膜、肝脏、脾脏、肾脏、肾被膜下、门静脉上。

（18）组织或器官的再生或功能恢复方法，其包括：将由（1）～（14）中任一项所述的方法制作的器官芽移植到人或非人动物，使之分化为组织或器官。

（19）非人嵌合体动物的制作方法，其包括：将由（1）～（14）中任一项所述的方法制作的器官芽移植到非人动物，使之分化为组织或器官。

（20）评价药剂的方法，其中使用选自由（1）～（14）中任一项所述的方法制作的器官芽、由（15）所述的方法制作的组织及器官、以及由（19）所述的方法制作的非人嵌合体动物的至少一种。

【发明效果】

以往、从多能性干细胞通过分化诱导得到的功能细胞，与构成活体组织的功能细胞相比，止于未成熟的分化阶段。这是因为，在以往的分化诱导法中，不诱导功能细胞的终末分化。由本发明，期待基于立体的的组织重构的人功能细胞的终末分化的诱导法的确立（例如，对血管结构的细胞极性的再构成等），从而作为人功能细胞的制造技术价值高。

另外，在以往的多能性干细胞的分化诱导法中，完全无法得到组织干细胞。由本发明，只要实现从iPS细胞制造组织干细胞，本发明人通过联用过去开发的人肝干细胞操作技术（国际公开编号：WO/2009/139419），可期待对于人肝细胞的大量制造有用的细胞操作技术。

再者，在本发明中，通过人为地再现器官发生中发生的多种细胞间相互作用来重构有血管系统的立体的人组织结构体是可能的。从而，期待成为以往的技术完全无法实现的，用于制作有血管系统适宜地配置的血流的人组织－器官的平台技术。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请、特愿2011-210157的说明书及/或附图中记载的内容。

附图说明

图1：显示人iPS细胞来源的肝脏内胚叶细胞的自律的组织化的图。左下图显示人肝脏内胚叶细胞。左上图显示由肝脏内胚叶细胞、血管内皮细胞及未分化间叶系细胞的三者的共培养形成的三维结构体（肝芽）（培养开始4天后）。右上图是上述三维结构体的荧光显微镜照片。血管内皮细胞（HUVEC）被EGFP标记，未分化间叶系细胞（hMSC）被KO标记。iPS细胞未被标记。

图2：显示构成器官芽的细胞等的标志物蛋白质的表达量的图。图中的“Hep.End.HUVEC MSC”表示构成器官芽的细胞，“undiffiPS”及“iPS”表示iPS细胞，“Def End”表示由激活素诱导的内胚叶系细胞，“Hep End”表示由BMP4及FGF2诱导的肝脏内胚叶细胞。“IH-样”表示K.Si-Taiyeb，et al.Hepatology，51（1）：297-305（2010）所述的不成熟的肝细胞样细胞，“MH-样”表示K.Si-Taiyeb，et al.Hepatology，51（1）：297-305（2010）所述的成熟的肝细胞样细胞。

图3：显示构成器官芽的细胞等的标志物蛋白质的表达量的图。图中的“Hep.End.HUVEC MSC”表示构成器官芽的细胞，“iPS”表示iPS细胞，“Def End”表示由激活素诱导的内胚叶系细胞，“HepEnd”表示由BMP4及FGF2诱导的肝脏内胚叶细胞。“IH-样”表示K.Si-Taiyeb，et al.Hepatology，51（1）：297-305（2010）所述的不成熟的肝细胞样细胞，“MH-样”表示K.Si-Taiyeb，et al.Hepatology，51（1）：297-305（2010）所述的成熟的肝细胞样细胞。

图4：显示向免疫缺陷小鼠活体内移植的肝芽的状态的图。iPS细胞被GFP标记，未分化内皮细胞被KO标记。

图5：组织学解析移植2周后的肝芽的图。

图6：显示胰腺β细胞的自立的组织化的图。左图显示共培养的胰腺β细胞，右图显示单独培养的胰腺β细胞。

图7：显示胰腺β细胞的集块及血管样管腔结构的图。

图8：显示向移植的细胞块的血液回流的图。

图9：显示胰腺β细胞的球形形成过程的图。血管内皮细胞（HUVEC）被GFP标记，胰腺β细胞（MIN6）被KO标记。

图10：显示向胰腺β细胞集团内的血管形成的图。血管内皮细胞（HUVEC）被GFP标记，胰腺β细胞（MIN6）被KO标记。

图11：显示向胰腺β细胞集团内部的血液回流的图。由标记的右旋糖苷可视化血流。

图12：组织学解析胰腺β细胞集团的图。

图13：使用hiPSCs的人肝芽（hiPSC-LBs）的制成。（a）本方法的略图。（b）肝内胚叶分化（hiPSC-Hep）在第9天将HNF4A及AFP用抗体染色评价（结果以平均值±标准偏差表示、n=3）。（c）将hiPSC-Heps与HUVECs及hMSCs共培养时的hiPSC-LBs的3维的自身组织化。在hiPSC-LBs内确认内皮发芽。绿色、EGFP标记的HUVEC；红色、KOFP（Kusabira橙色荧光蛋白）标记的hMSC。标尺长度是100μm。（d）在不含hMSCs的培养系统中确认不到hiPSC-LBs的形成。标尺长度是1mm。（e）由使用共聚焦显微镜的时间推移观察，确认使用Cell Tracker Red CMTMR（MolecularProbes）标记的hiPSC-Heps的自律的的组织化。图像是最大强度的共聚焦Z方向的图像的投影。（f）用转孔培养基，96小时、hiPSC-Heps单独或与HUVEC及hMSCs共培养时的将HNF4A、FOXA2、AFP、RBP4、TTR及ALB的表达由定量RT-PCR（qPCR）解析（结果以平均值±标准偏差表示、n=3）。（g、h）显示肝分化标志物基因的表达解析的结果，由BMP抑制剂头蛋白（500ng/ml）及FGF抑制剂SU-5402（50μM）的添加，妨碍与HUVEC及hMSCs共培养的hiPSC-Heps的有效的肝成熟（g）。另一方面，通过添加BMP4（20ng/ml）及FGF2（20ng/ml），尽管用hiPSC-Heps单独进行培养，确认肝分化标志物的表达亢进（h）（结果以平均值±标准偏差表示、n=3）。

图14：hiPSC-LBs的在体外的特性解析。（a）细胞角蛋白8及18（CK8.18）、AFP、PECAM-1（CD31）、Flk-1、结蛋白、PCNA及5′-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）的抗体染色。标尺长度是100μm。（b、c、d、e）各细胞表征的比率如下：肝芽细胞、AFP阳性/CK8.18阳性；增殖细胞、（PCNA阳性或BrdU阳性）/CK8.18阳性；内皮细胞、（CD31阳性或Flk1阳性）/DAPI阳性；间叶细胞、结蛋白阳性/DAPI阳性。hiPSC-LBs内的各细胞种的比率与E10.5小鼠LBs（mLBs）的比率大致近似。在b、c、d中，将结果作为平均值±标准偏差，e中，表示为平均值±平均值的标准误差、n=3。（f）显示小鼠和人的肝脏发生时、对于阶段性地表达升高的83种肝脏特异性基因，由微阵列数据取得的热图谱。在体外的肝芽形成之后，这些肝脏中特征性的基因组的表达显著地升高。hiPSC-Def；hiPSC来源的胚体内胚叶细胞、hiPSC-Hep；hiPSC来源的肝内胚叶细胞、hiPSC-IH；hiPSC来源的未成熟肝细胞样细胞、hiPSC-MH；hiPSC来源的成熟肝细胞样细胞、hFLT；胎儿（妊娠后期、22-40周）肝脏组织、hALT；人成体（30岁）肝脏组织。

图15：在体内有功能性的血管网的人肝脏组织的制成。（a）向NOD/SCID小鼠的颅窗内移植hiPSC-LBs。肉眼观察进行移植的hiPSC-LBs的结果，从移植约48小时后，确认向人血管的血液流入。点区域显示移植的hiPSC-LBs。标尺长度是1mm。（b）由经时的共聚焦显微镜的活体观察的结果确认由hiPSC-LBs中的血管内皮细胞的血管网的形成。（c）由葡聚糖的静脉内施用，在移植第3天确认，通过功能性的人血管网使hiPSC-LBs完全地灌流。小图显示人和小鼠血管的连结。虚线显示移植片的末端。标尺长度是500μm。（d）将HUVECs（绿色、GFP）和宿主血管（蓝色、Alexa647标记的小鼠特异性的CD31、静脉施用）的连结直接可视化。标尺长度是250μm。（e、f）在移植第15天观察形成的肝脏组织内的hMSCs或hiPSC来源细胞的所在位置。标尺长度是100（e）及250（f）μm。（g）体内的hiPSC-LB移植片内部的人血管网的定量解析（结果以平均值±平均值的标准误差表示、n=3）。（h）在hiPSC-LB和HUVEC hMSC移植片（Tx）间比较功能性的血管的长度（结果以平均值±平均值的标准误差表示、n=5、*：P<0.01）。（i）注入FITC-葡聚糖之后的活体内共聚焦观察。hiPSC-LB来源的组织的血管新生是与正常的成体小鼠肝脏的血管新生大致相同程度（结果以平均值±平均值的标准误差表示、n=5、*：P<0.01）。

图16：hiPSC来源的肝脏组织的在体内的功能解析。（a）将移植60天后的组织切片HE染色的结果，确认含血窦样的内皮细胞的肝细胞索的形成，而在HUVEC hMSC移植片（Tx）内确认不到。虚线显示在脑上的移植片的界限。标尺长度是200μm（上部）及100μm（下部）。（b）显示hiPSC-LB及hFLC-LB来源的在组织内的肝脏标志物的表达的免疫染色。标尺长度是100μm（左、中央）及25μm（右）。（c、d）经时的小鼠血清中的人ALB及AAT量（结果以平均值±平均值的标准误差表示、c是n=6、d是n=3）。AAT产生与hiPSC-LB的移植片数有比例关系。分别将2个LB移植到颅，将3或6个LB移植到肠系膜。（e）显示由CE-TOFMS测定的hiPSC-LB移植片的代谢特征的Venn图（图31）。在hiPSC-LB移植片上发现的代谢物之中，78%与成体肝脏的代谢物一致。右图显示在hiPSC-LB移植片及健康的人成体肝脏的两方检测，原来的hiPSCs中检测不到的主要的代谢物。（f）由质谱法在小鼠尿中检测的人特异性的酮洛芬代谢物（结果以平均值±平均值的标准误差表示、n=3、*：P<0.05）。（g）在经口施用异喹胍的小鼠的血清代谢物中用药物动态解析探讨4-OHDB的形成。（h）在颅内移植（CW）或肠系膜移植的小鼠间比较血清4-OHDB代谢物的形成（结果以平均值±平均值的标准误差表示、n=3、*：P<0.05）。（i）hiPSC-LB移植后的TK-NOG小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。由Wilcoxon统计解析显示，受模拟处置的对照组和hiPSC-LB移植组的曲线有显著的差异（P=0.0120）。

图17：hiPSC的向肝内胚叶的初期分化诱导。（a），通过在第6天及第9天对FOXA2、SOX17、HNF4A及AFP分别免疫染色来监测从hiPSC的向胚体内胚叶的分化及向肝内胚叶的分化。（b）通过在诱导第6天对FOXA2及SOX17进行免疫染色来评价向胚体内胚叶的分化效率（结果以平均值±标准偏差表示；n=3）。

图18：在体外的hiPSC来源肝芽形成条件的优化。（a）通过与各种细胞类型的共培养的肝芽（LB）的形成。标尺长度是1mm。（b）将肝内胚叶细胞，在各种基质蛋白质上，与HUVECs及hMSCs共培养。将细胞接种于基质胶（LAM COL ENT）上，观察hiPSC来源LB（hiPSC-LB）的形成。LAM:层粘连蛋白；ENT：巢蛋白；COL：胶原IV。（c）给LB形成带来的基质蛋白质浓度的效果。（d）hiPSC-LB的qPCR基因表达分析。通过与内皮及间叶系细胞共培养，显示作为初期肝分化标志物基因的ALB，RBP4，TTR及G6PC的显著的表达升高（结果以平均值±标准偏差表示；n=3）。

图19:与间叶细胞的共培养物来源液性因子的鉴定。（a）与未分化hiPS细胞比较，与内皮及间叶细胞的共培养物中上调的5000种基因的基因本体论（GO）分析。条表示，对于生物学过程，GO:0008083（生长因子活性）内的特定GO分类的显著性（P值）。在间叶细胞特异性基因之中，FGF信号途径（红色）及BMP信号途径（蓝色）强调。（b，c）显示内皮及间叶细胞高表达FGF2及BMP4，（b）FGFs及（c）BMPs的qPCR分析。

图20:由代表性的肝标志物基因的微阵列分析的表达表征。将hiPSC-LB的基因表达与人胎儿(妊娠22-40周）及成体肝组织（30岁）的基因表达比较，在适宜的阶段。TAT:酪氨酸氨基转移酶；G6PC：葡萄糖-6-磷酸酶；TDO²：色氨酸-2,3-脱氧酶；GLUT2：葡萄糖转运蛋白2；GYS2：糖原合酶2；APOL6:载脂蛋白L；KNG1:激肽原1；CFB:补体B因子；CFI：补体I因子；PCK1：磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶；LDHD：乳酸脱氢酶D；CP:细胞纤溶酶；ACTB:肌动蛋白β。

图21:从小鼠肝芽来源细胞的小鼠肝组织的制作。（a）EGFP标记E13.5mFLC移植片的经时的活体内荧光像。移植30天后，由尾静脉注入四甲基若丹明葡聚糖，得知血管是有功能的。（b）制作的小鼠肝组织的HE染色。肝细胞群集含血窦内皮细胞（右、箭头）。在群集内部形成胆管状的结构物，由细胞角蛋白免疫染色确认（右、下部）。

图22:制作的小鼠肝组织、E13.5胎儿肝组织及成体肝组织的组织学比较。（a）500ng/ml的HGF及200ng/ml的EGF的添加使肝组织的再构成增强。（b）制作的小鼠肝组织与E13.5胎儿肝组织比较，有与成体肝组织类似的组织学特征。标尺长度：200μm。

图23:hFLC-LBs的体内移植。将在体外制成的hFLC-LBs向NOD/SCID小鼠的颅窗下移植。（a）显示血管新生的进行的经时的肉眼像。功能性的血流在第3天开始，然后经时，血管随进一步复杂化的同时稳定化。（b）hFLC-LBs来源组织的在第3天的活体内共聚焦像。绿色：表达EGFP的hFLCs；红色：表达KOFP的HUVECs。标尺长度是100μm。

图24:hFLC来源肝组织内的功能的血管网的体内形成。由德克萨斯红葡聚糖的注入（第3天）显示的持续性脉管结构。

图25:与宿主血管连结的人血管网的形成对于hiPSC-Hep上首尾的植入不可或缺。（a）HUVECs（绿色、GFP）及宿主血管（蓝色、Alexa647结合小鼠特异性CD31；静脉注射）间的连结的直接可视化。将灌流的血管由带有荧光的葡聚糖(红色）的静脉注射，在第10天可视化。标尺长度是250μm及25μm。（b）外植的hiPSC-LB移植片的种特异性CD31免疫染色显示hiPSC来源肝组织中的人及小鼠血管之间的直接连结。标尺长度是100μm。（c）不含内皮细胞的hiPSC/hMSC移植片的多个时间点的肉眼像。完全见不到可鉴定的血管。（d）hiPSC/hMSC移植片的HE染色，在30天后，显示纤维性组织的形成。结果显示hiPSC来源肝细胞的植入的失败，提示内皮细胞的必要性。标尺长度是100μm。

图26:制作的人肝脏及体内的正常的小鼠肝脏的脉管结构的活体内成像。（a）移植30天后，由FITC结合葡聚糖的注入可视化的，仅HUVEC hMSC（上段）或hiPSC-LB移植片（下段）的血管结构。（b）可视化由FITC葡聚糖的血流的正常的小鼠肝脏的活体成像。标尺长度是200μm。

图27:肝组织内部的人血管网及肝细胞形态的活体内评价。（a）由FITC葡聚糖注入可视化的功能性人血管。接下来使用MetaMorphAngiogenesis Module软件处理像投影（左侧小图）。右侧小图显示各像的分段图像。（b）血管直径的定量（平均值±标准偏差；n=3）。（c）hiFLC-LB移植片内部的肝细胞形态的活体内像、及细胞圆形度（形状因子）的推定（结果以平均值±标准误差表示；n=3；对于各样品测量100个以上的细胞；*：P<0.05；N.S.:不显著）。

图28:hiPSC-LB移植片的在体内的经时变化。（a）hiPSC-LB移植片的长时间HE染色。如在正常的小鼠肝脏发生中观察到¹、圆形的hiPSC来源肝芽细胞大规模增殖，分化为有增大的细胞质的未成熟肝细胞。标尺长度是50μm。（b）在体内的hiPSC-LB移植片内的增殖性细胞数的2周后，在1、2及4个月后的由Ki67免疫染色的定量。

图29:hiPSC-LB或hFLC-LB移植片的全标本包埋免疫染色。（a）显示制作的肝组织内的基底膜蛋白质的再构成的胶原IV免疫染色。标尺长度是100μm及50μm。（b）与正常的小鼠肝组织同样地，由成熟肝细胞及间叶细胞组成的移植片来源人肝组织。标尺长度是50μm。

图30:hFLC-LB来源人肝组织的免疫染色及透过型电子显微镜分析。（a）hFLC-LB移植片来源的肝组织表达肝细胞特异性抗原（HSA），但不表达AFP（左侧小图）。对人CD31及α平滑肌肌动蛋白（SMA）的免疫染色显示肝组织内部中的主要血管的形成（右侧小图）。标尺长度是100μm。（b，c，d，e）hFLC-LB来源肝组织的电子显微镜图像。显示有紧密连接（b，c）、毛细胆管、丰富的线粒体、以及有糖原及脂质的蓄积（d，e）的肝细胞。

图31:hiPSC-LB移植片的表达基因的表征。由移植60天后的多数的肝成熟标志物基因的（a）微阵列表征及（b）qPCR验证的结果得知，hiPSC-LB向由移植的成熟肝细胞成熟。

图32:60天hiPSC-LB移植片（蓝色）、人成体肝脏（红色）及未分化hiPSCs（绿色）的代谢途径图谱。将在途径图谱中鉴定的代谢物用不同的颜色着色的四角显示。N.D.:未检测到。

图33:向治疗用途的肠系膜移植模型的确立。（a）将在体外增殖的hiPSC或FLC来源LB移植到用纤维蛋白糊覆盖的肠系膜。（b）移植60天后的hiPSC来源肝组织的肉眼观察。用点围起来的区域显示移植片。（c）hiPSC-LB移植30天后，的2/3PH而人白蛋白的产生增大。（n=3）（d）DT注入Alb-TRECK/SCID小鼠的，hFLC-LB移植的（n=8）或伪手术的（n=7）组中的Kaplan-Meier生存曲线。

实施方式

以下，详细地说明本发明。

本发明的器官芽的制作方法的特征在于，将器官细胞与选自由血管内皮细胞、间叶系细胞、血管内皮细胞分泌的因子，由间叶系细胞分泌的因子，由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子的至少1种细胞及/或因子一同培养器官细胞。

本发明中“器官芽”是指通过成熟可分化为器官的结构体，即器官细胞、血管内皮细胞、及未分化间叶系细胞或含从其分化的细胞的三种细胞的结构体。何种结构体是器官芽可通过下述方法确认，例如，研究将该结构体向活体移植是否可分化为目的器官（向目的器官分化，则可判断为器官芽。）、及/或研究是否结构体含全部上述的三种细胞（含全部三种细胞，则可判断为器官芽。）。器官芽可为分化为例如，肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等的器官的器官芽等，但优选为分化为肝脏的器官芽（肝芽）、分化为胰腺的器官芽（胰腺芽）、分化为肠道的器官芽等分化为内胚叶性器官的器官芽。何种结构体是分化为内胚叶性器官的器官芽可通过研究成为标志物的蛋白质的表达来确认（表达后述的标志物蛋白质之任何一种或多种，则可判断为器官芽。）。例如，在肝芽中，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标志物，胰腺芽中，PDX1、SOX17、SOX9等成为标志物，分化为肠道的器官芽中，CDX2、SOX9等成为标志物。本领域技术人员使用的用语之中，肝芽、肝盲囊、肝类器官、胰腺（背侧或腹侧）芽、胰腺原基、胰腺类器官、肠芽、肠憩室、肠类器官（K.Matsumoto，et al.Science.19；294（5542）:559-63.（2001））等包括在本发明中的器官芽中。

本发明中“器官细胞”是指，构成器官的功能细胞、或者向功能细胞分化的未分化细胞。作为“未分化的器官细胞”，可举出例如，可分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等的器官的细胞等，可分化为脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发－爪·皮肤腺、感觉器、末梢神经、水晶体等之外胚叶性器官的细胞、可分化为肾脏、尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨架、真皮、结缔组织、中皮等中胚叶性器官的细胞、可分化为肝脏、胰腺、肠道、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路等之内胚叶性器官的细胞等。何种细胞是可分化为外胚叶性器官、中胚叶性器官或内胚叶性器官的细胞可通过研究成为标志物的蛋白质的表达来确认（表达标志物蛋白质中的任何一种或多种，则可判断为可分化为内胚叶性器官的细胞。）。例如，可分化为肝脏的细胞中，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标志物，可分化为胰腺的细胞中，PDX1、SOX17、SOX9等成为标志物，可分化为肠道的细胞中，CDX2、SOX9等成为标志物，可分化为肾脏的细胞中，SI×2、SALL1、可分化为心脏的细胞中，NK×2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA、可分化为血液的细胞中，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4、可分化为脑或脊髓的细胞中，HNK1、AP2、NESTIN等成为标志物。本领域技术人员间使用的用语之中，成肝细胞、肝祖细胞、成胰腺细胞、肝前体细胞、成胰腺细胞、胰腺祖细胞、胰腺祖细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、肠祖细胞、肠前体细胞、中胚层、后肾间叶前体细胞、多能性肾单位祖细胞、肾祖细胞、心脏中胚层、心血管祖细胞、心脏祖细胞、（JR.Spence，et al.Nature.；470（7332）:105-9.（2011）、Self，et al.EMBO J.；25（21）：5214-5228.（2006）、J.Zhang，etal.Circulation Research.；104：e30-e41（2009）、G.Lee，et al.NatureBiotechnology25，1468-1475（2007））等包括在本发明中的未分化的器官细胞中。未分化的器官细胞可从人工多能性干细胞（iPS细胞）、胚性干细胞（ES细胞）等的多能性干细胞根据公知的方法制作。例如，可分化为肝脏的器官细胞可根据K.Si-Taiyeb，et al.Hepatology，51（1）：297-305（2010）、T.Touboul，et al.Hepatology.51（5）:1754-65.（2010）制作，可分化为胰腺的器官细胞可根据D.Zhang，et al.CellRes.；19（4）:429-38.（2009）制作，可分化为肠道的器官细胞可根据J.Cai，et al.J Mol Cell Biol.；2（1）:50-60（2010）、R.Spence，et al.Nature.；470（7332）:105-9.（2011）制作，可分化为心脏的器官细胞可根据J.Zhang，et al.Circulation Research.；104：e30-e41（2009）制作，可分化为脑或脊髓的细胞可根据G.Lee，et al.NatureBiotechnology25，1468-1475（2007）制作。作为“分化的器官细胞”，可例示胰腺的内分泌细胞、胰腺的胰腺管上皮细胞、肝脏的肝细胞、肠道之上皮细胞、肾脏的尿细管上皮细胞、肾脏的肾小球上皮细胞、心脏的心肌细胞、血液的淋巴细胞或粒细胞、红细胞、脑的神经细胞或神经胶质细胞、脊髓的神经细胞或许旺细胞等。器官细胞主要使用人来源的，但也可使用人以外的动物、例如，小鼠、大鼠、狗、猪、猴等的动物来源的器官细胞。

本发明中，“血管内皮细胞”是指构成血管内皮的细胞、或者可分化为那样的细胞的细胞。何种细胞是血管内皮细胞可通过研究是否表达标志物蛋白质、例如，TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41来确认（表达上述标志物蛋白质中的任何一种或多种，则可判断为血管内皮细胞。）。本发明中，使用的血管内皮细胞可为分化的，也可为未分化的。血管内皮细胞是否为分化的细胞可由CD31、CD144确认。本领域技术人员使用的用语之中，内皮细胞、脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞、血管性祖细胞、成血管细胞（HJ.joo，et al.Blood.25；118（8）:2094-104.（2011））等包括在本发明中的血管内皮细胞中。血管内皮细胞主要使用人来源的，但也可使用人以外的动物、例如，小鼠、大鼠、狗、猪、猴等的动物来源的血管内皮细胞。

本发明中，“间叶系细胞”的概念是指，主要存在于从中胚叶来源的结缔组织中，形成以组织发挥功能的细胞的支持结构的结缔组织细胞，也包括被决定向间叶系细胞的分化运命，但尚未向间叶系细胞分化的细胞。本发明中，使用的间叶系细胞可为分化的，也可为未分化的。何种细胞是未分化间叶系细胞可通过研究是否表达标志物蛋白质、例如，Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin来确认（表达上述标志物蛋白质中的任何一种或多种，则可判断为未分化间叶系细胞。）。另外，可判断不表达前项的标志物中的任何一种的间叶系细胞为分化间叶系细胞。本领域技术人员使用的用语之中，间叶干细胞、间叶祖细胞、间叶细胞（R.Peters，et al.PLoS One.30；5（12）:e15689.（2010））等包括在本发明中之间叶系细胞中。间叶系细胞主要使用人来源的，但也可使用人以外的动物、例如，小鼠、大鼠、狗、猪、猴等的动物来源的未分化间叶系细胞。

共培养中的三种细胞的培养比只要在可形成器官芽的范围内，就不特别限定，适宜的细胞数比是器官细胞：血管内皮细胞:未分化间叶系细胞=10:10～5:2～1。

另外，血管内皮细胞和间叶系细胞中的任何一方或两方可用由血管内皮细胞分泌的因子，由间叶系细胞分泌的因子，由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子等的物质代替。

作为由血管内皮细胞分泌的因子、由间叶系细胞分泌的因子、及由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子等的物质的例，可例示FGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGF等，但不限于这些。

作为这些物质的添加量，对于FGF2，每1×10^6个细胞，10～100ng/ml是适当的，20ng/ml左右是优选的，对于BMF4而言，每1×10^6个细胞，10～100ng/ml是适当的，20ng/ml左右是优选的。

培养时使用的培养基只要是形成器官芽的就可，但优选使用血管内皮细胞培养用的培养基、器官细胞培养用的培养基、将上述2种培养基混合的等。血管内皮细胞培养用的培养基可使用任何培养基，优选使用含hEGF（重组人上皮细胞生长因子）、VEGF（血管内皮细胞生长因子）、氢化可的松、bFGF、抗坏血酸、IGF1、FBS、抗生素（例如，庆大霉素、两性霉素B等）、肝素、L-谷氨酰胺、酚红、BBE的至少1种的培养基。作为血管内皮细胞培养用的培养基，可使用EGM-2BulletKit（Lonza公司制）、EGM BulletKit（Lonza公司制）、VascuLife EnGS Comp Kit（LCT公司制）、人内皮-SFM基础生长培养基（Invitrogen公司制）、人微小血管内皮细胞增殖培养基（TOYOBO公司制）等。器官细胞培养用的培养基可使用任何培养基，但当器官细胞是肝细胞时，优选使用含抗坏血酸、BSA-FAF、胰岛素、氢化可的松、GA-1000的至少1种的培养基。作为肝细胞培养用的培养基，从HCM BulletKit（Lonza公司制）除去hEGF（重组人上皮细胞生长因子）的培养基，可向RPMI1640（Sigma-Aldrich公司制）使用1%B27补充物（GIBCO公司制）和10ng/mL hHGF（Sigma-Aldrich公司制）等。关于人肝芽的形成，向将GM BulletKit（Lonza公司制）和从HCM BulletKit（Lonza公司制）除去hEGF（重组人上皮细胞生长因子）的培养基以1:1混合的培养基，添加地塞米松、抑瘤素M、HGF，确证对肝芽的成熟有效果。

器官细胞优选接种于凝胶上进行培养。此时、使用的凝胶不特别限定，可使用BD Matrigel（BD pharmingen公司制）等。

培养时的温度不特别限定，优选30～40℃，再优选37℃。

培养期间不特别限定，优选3～10天，再优选6天。

将如上所述制作的器官芽移植到非人动物，通过使其在非人动物内成熟，可制作组织或器官。作为使用的非人动物，可举出小鼠、兔、猪、狗、猴等。另外，使用的非人动物，为了回避免疫排斥反应，优选免疫缺陷动物。

从而，本发明提供包括将由上述的方法制作的器官芽移植进人或非人动物的器官芽的移植方法。器官芽的移植部位是只要可移植，任何部位都可，可例示颅内、肠系膜、肝脏、脾脏、肾脏、肾被膜下、门静脉上等。在移植到颅内时，移植在体外制作的1～3个左右的5mm大的器官芽就可，在移植到肠系膜时，移植在体外制作的1～6个左右的5mm大的器官芽就可，在移植到门静脉上时，移植在体外制作的1～20个左右的5mm大的器官芽就可。在移植到肾皮膜时，移植在体外制作的1～5个左右的5mm大的器官芽就可，在移植到肝脏－脾脏－肾脏时，移植在体外制作的100～200个左右的100μm大的器官芽就可。

如上所述制作的组织及器官可在创药筛选或再生医疗等中使用。

从而，本发明提供组织或器官的再生或功能恢复方法，包括将由上述的方法制作的器官芽移植到人或非人动物，分化为组织或器官。作为非人动物，可举出小鼠、兔、猪、狗、猴等。

另外，本发明提供非人嵌合体动物的制作方法，包括将由上述的方法制作的器官芽移植到非人动物，分化为组织或器官。移植器官芽的非人动物（例如，小鼠）可模仿器官芽的制作中使用的器官细胞的来源生物种（例如，人）的生理功能。在后述的实施例中，移植从人来源的iPS细胞制作的器官芽的小鼠确认模仿人的肝功能，所以认为，使用此小鼠可预测人的药物代谢表征。

再者，本发明提供评价药剂的方法，其使用选自由上述的方法制作的器官芽、组织及器官、及非人嵌合体动物的至少一种。作为药剂的评价，可举出例如，药的候选化合物的药物代谢表征的预测、药效评价、毒性评价、药物相互作用评价等。

另外，从由本发明的方法制作的组织及器官制造组织干细胞也可能，本发明在人组织细胞或器官细胞的大量制造的向细胞操作技术的应用是可能的。

【实施例】

以下，通过实施例再详细地说明本发明。

〔实施例1〕使用未分化的器官细胞的器官的制作

〔实验方法〕

【（1）人肝脏内胚叶细胞的制作】

通过将人iPS细胞（人皮肤来源TkDA3hiPSC克隆（由Koji Eto氏及Hiromitsu Nakauchi氏获赠））向无血清培养基添加激活素来培养，诱导CXCR4及E-钙粘素两阳性的内胚叶系细胞。通过将得到的内胚叶系细胞添加BMP4、FGF2培养2天，得到CXCR4阴性HNF4α阳性的肝脏内胚叶集团。CXCR4及HNF4α的表达，根据Hepatology，51（1），297-305,2010的记载，由免疫染色及基因表达解析确认。

【（2）人肝芽的制作】

将得到的肝脏内胚叶细胞，与血管内皮细胞（人脐带血来源静脉内皮细胞）（Lonza、Basel、Switzerland）及未分化间叶系细胞（人间叶系干细胞）（Lonza、Basel、Switzerland）以各10：5-10：2的比例混合，进行共培养。血管内皮细胞及未分化间叶系细胞使用进行各荧光标记的细胞。共培养时，向进行原液至2倍稀释的基质胶（BDpharmingen）的固相化的培养皿之上接种细胞悬浮液。培养液使用内皮细胞培养基试剂盒-2：EGM-2BulletKit（制品编码CC-3162：Lonza）。

进行短期间（3-10天）培养，制作人三维结构体（肝芽）。另外，进行形成过程、及由形成的结构体的共聚焦显微镜的观察，实施细胞的形态、所在位置等的动态/静态解析。再者，进行形成的人三维结构体的基因表达解析。

【（3）人肝组织的制作】

将形成的人三维结构体，向免疫缺陷小鼠（NOD/SCID小鼠（Sankyo Lab.Co.，Tsukuba，Japan））活体内移植。实施由肉眼及共聚焦显微镜的活体观察，确认人细胞的植入－增殖的同时，解析移植后的血管成熟化过程。回收移植早期的样品（2周），进行其组织学解析。

〔实验结果〕

（1）从仅人细胞自律地进行组织化，形成可肉眼观察的立体的结构体（图1）。

（2）在培养第4天，确认血管样的管腔结构（图1右上图的扩大像）。

（3）形成的三维结构体减弱作为未分化细胞的标志物的NANOG或CXCR4等的表达（图2）。

（4）与由以往技术进行终末分化诱导的细胞比较，显示使作为肝细胞的分化标志物的白蛋白（ALB）的表达增强100倍以上（图2）、使其他分化标志物（FOXA2、TAT、PCK2）的表达也达到数十倍程度的表达增强（图3）。

（5）由移植，人血管与小鼠血管连接，从早期（移植第2天）开始血液灌流（图4）。

（6）确认人iPS细胞来源肝脏细胞的增殖（图5）。

（7）由移植早期（2周）的样品的组织学解析，确认白蛋白阳性的索状结构的形成。另外，也确认血窦样结构的形成（图5）。

（8）共培养时、不将细胞悬浮液接种于基质胶固相化培养皿上，将细胞悬浮液包埋于基质胶中时，向非包被的培养皿接种时，或者向将培养皿用1型胶原包被的培养皿接种时不形成立体结构。

（9）共培养时、在作为培养液不使用内皮细胞培养基，而使用添加Hepatocyte Medium（XenoTech）、或者BMP4及FGF2的肝细胞诱导培养基（Hepatology，51（1），297-305,2010）时，在肝芽确认不到特征性的表达基因的增强（Alb、TTR等）。

〔实施例2〕使用分化的器官细胞的器官的制作

〔实验方法〕

将胰腺β细胞株（MIN6）与血管内皮细胞（人脐带血来源静脉内皮细胞）及未分化间叶系细胞（人间叶系干细胞）以各5：5-10：2的比例混合，进行共培养。胰腺β细胞株（KO）及血管内皮细胞（EGFP）使用进行各荧光标记的细胞。共培养时，向进行原液至2倍稀释的基质胶（BD pharmingen）的固相化的培养皿之上接种细胞悬浮液。再有，向基质胶内部包埋时，或者，在非包被、1型胶原包被的培养皿中，不形成立体结构。培养液使用内皮细胞培养基试剂盒-2：EGM-2BulletKit（制品编码CC-3162：Lonza）。

进行短期间（3-10天）培养，制作三维结构体。进行形成过程、及由形成的结构体的共聚焦显微镜的观察，实施细胞的形态、所在位置等的动态/静态解析。

将形成的三维结构体向免疫缺陷小鼠（NOD/SCID小鼠（SankyoLab.Co.，Tsukuba，Japan））活体内移植。实施由肉眼及共聚焦显微镜的活体观察，确认细胞的植入－增殖的同时，解析移植后的成熟化过程。回收移植样品（4周），进行其组织学解析。

〔实验结果〕

（1）从仅细胞自律地进行组织化，在次日形成可肉眼观察的立体的结构体（图6）。

（2）在培养第2天，胰腺β细胞株形成集块，确认人血管样的管腔结构包围其周围（图7）。

（3）由移植，人血管与小鼠血管连接，从移植早期开始血液灌流（图8）。

（4）胰腺β细胞株形成集块地增殖，形成胰岛样的结构体（图9）。

（5）在形成的胰岛样结构体之中确认包含人细胞的血管结构的形成（图10）。

（6）由血流的可视化确认，胰腺岛样结构体之内部再开始充分地血液灌流（图11）。

（7）由移植样品的组织学解析，确认胰岛素阳性的岛状结构的形成。形成的结构体内部有复杂的血管结构，有与正常小鼠胰腺岛类似的结构（图12）。

〔实施例3〕由人工多能性干细胞来源的器官芽移植的功能性的血管化人肝脏的制造

用于治疗末期器官功能衰竭的供体器官显著地不足，使用患者来源的人工多能性干细胞（hiPSCs）^1，2制成器官的必要性越发升高。尽管多个论文报告了功能性的细胞分化^3-7，尚无在肝脏这样的有3维的血管网的器官的制成中成功的例。我们通过在体外制备的hiPSC来源的肝芽（hiPSC-LBs）的移植，在有血管结构的功能性的人肝脏组织的制成中成功。除了内皮细胞和间叶细胞⁸之外，当促进器官形成时，iPS细胞来源肝内胚叶细胞与3维的hiPSC-LBs发生自身组织化。免疫染色及表达基因的解析的结果，在体外生长的hiPSC-LBs和体内的肝芽间确认类似性。hiPSC-LBs移植片内的人血管网在48小时以内与宿主血管连结，开始血液灌流。通过形成功能性的血管结构，得知hiPSC-LBs向与成体肝脏类似的组织成熟。再者，有高的代谢能力的hiPSC来源的移植组织不要求受者的肝脏的取代^9，10，发挥人型的蛋白质产生或人特异性的药物代谢这样的肝脏特异性的功能。再者，当将hiPSC-LBs移植到肠系膜时，使药物诱导的致死的肝功能衰竭模型的生存率升高。据我们所知，本报告是从多能性干细胞制成功能性的人器官的最初的例。虽然想将本方法临床应用，进一步的探讨是必要的，我们实验证实的器官芽移植提供在再生医疗中有可能性的新的方法。

自1981年发现胚胎干细胞以来，数次尝试了从多能性干细胞制成具有如肝脏一样的复杂的结构的器官，但尚无成功的例。这被认为是因为在体外再现器官形成过程中发生的在细胞或组织间的复杂的相互作用是困难的^2，11。我们关注于器官形成中的最初的过程、即，器官芽发生时的细胞间相互作用，研究了本课题。

在肝脏形成初期，由片状的前肠内胚叶层释放细胞，形成三维的肝芽（LB）¹²。这样的形态学的大的变化依赖于血液灌流前发生的在内胚叶细胞、间叶系及内皮系前体细胞间的精密编成的信号⁸。基于这些见解，我们假定，将肝内胚叶细胞与内皮系及间叶系细胞一同培养，可在体外再现3维的（3D）的LB形成（图13a）。为了证实本假说，首先最初，通过阶段性的诱导因子的添加将人iPSCs向肝内胚叶细胞（hiPSC-Hep）分化诱导。结果，所述细胞的约80%中确认与细胞运命决定相关的肝性标志物HNF4A的表达（图17及13b）。

接下来，以再现初期肝脏形成作为目的，将hiPSC-Hep细胞与间叶细胞组共培养。对于内皮及间叶细胞而言，只要无特别说明，使用有未分化性的人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）及人间叶干细胞（hMSCs）。需要特别说明的是，仅管在2D培养的条件下培养，在特定的基质蛋白质上生长的hiPSC-Hep细胞由于内在性的组织化能力而在培养后24小时以内形成可肉眼确认的程度的大小的3D细胞群集（图13c、d、e）。被推定为hiPSC-Hep来源的肝芽（hiPSC-LBs）的群集有适度的力学强度，可耐受随后的移植操作等。使用用荧光蛋白质标记的细胞将在hiPSC-LBs内的伴随精密的内皮细胞的发芽的血管网的发达可视化（图13c）。另外，通过使用从相同的供体得到的脐带来源的MSCs及HUVECs，hiPSC-LB的形成均一地保持（图18a、右）。qPCR解析的结果，hiPSC-LBs内的细胞以高的水平转录作为肝脏的初期分化标志物的α胎蛋白（AFP）、视黄醇结合蛋白（RBP4）、转甲状腺素蛋白（TTR）及白蛋白（ALB）⁵（图18d）。令人感兴趣的是，间叶细胞依赖性的hiPSC-Hep细胞的肝成熟在使用转孔的共培养系统中也以一定程度维持（图13f）。以研究诱导肝成熟的介导因子作为目的，进行微阵列及qPCR解析。在间叶细胞特异性的基因组之中，BMP4及FGF2在与内皮及间叶细胞的共培养系统中显著地升高（图19）。作为BMP-及FGF-特异性的信号传导的抑制剂的头蛋白及SU-5402抑制由与间叶细胞的共培养的分化促进效果。另一方面，将BMP4及FGF2添加于hiPSC-Hep培养基，则观察到同样的肝分化诱导效果（图13g、h）。这些结果提示，如在动物实验¹³中也确认，除了直接的细胞间的相互作用之外，经BMP及FGF途径的活化，通过由间叶细胞的液性因子的旁分泌支持支持一部分肝脏初期成熟。

hiPSC-LB与如在妊娠后期及生产后小鼠的发达的肝脏不同，与E10.5小鼠的LBs（mLBs）非常类似（图14a）。hiPSC-LB及E10.5mLBs与间叶系及内皮系前体细胞同样地表达AFP^14，15，由有二分化能力的增殖性肝芽细胞构建。在hiPSC-LB及E10.5mLBs中，90%以上的推定肝细胞表达AFP，但在E15.5及E17.5mLBs中确认不到（图14b）。hiPSC-LB内的肝细胞与E10.5mLBs有同程度的增殖能力（图14c）。再者，hiPSC-LB由与E10.5mLBs同样的比例的间叶系及内皮系前体细胞构成（图14d、e）。为了研究表达基因的特征，选择肝脏发生时连续地表达升高的83种基因，将其表达用微阵列RNA表征探讨。由先前研究确认，E10.5mLBs显示与妊娠3-4周（3-4GW）的人胎儿肝脏对应^16，17、与这一致的是，与妊娠22-40GW的胎儿及成体来源的发达的肝脏组织比较，hiPSC-LB中的83种基因表达模式处于适宜的分化阶段（图14f及图20）。

血流动力学的促进在LB成熟中是必须的¹⁸。为了探讨hiPSC-LBs是否重构有完全的功能的肝脏组织，进行可经长期进行重复成像¹⁹的向颅观察窗的移植。首先，通过在移植实验中使用小鼠肝芽来源的细胞（mLB），确认本模型可再现LB的成熟过程（补充考察、图21及22）。再者，以同样地有LB（hFLC-LBs）形成能力的胎儿肝细胞作为对照，在培养时使用（图18a）。为了观察移植的人细胞的在体内的经过，将在体内的hiPSC-LBs来源的组织在各种各样的时间点重复成像。需要特别说明的是，体外来源的hiPSC-LBs在移植后48小时以内与宿主的血管结构快速连结（图15a、b及图23）。注入荧光素－葡聚糖接合体及或Alexa647标记的小鼠特异性CD31抗体的结果，得知移植的hiPSC-LBs内的人血管在移植片的末端与宿主血管连结。结果也在将摘出组织片由全标本包埋的免疫染色中确认（图15c、d及图24、25a、b）。再者显示，不含内皮细胞而进行移植的hiPSC-Heps不发生血管形成，由于无法植入，功能性的血管形成对于hiPSC-LB的移植及增大是必要不可或缺的（图15f及图25）。由hMSC来源的血管周围细胞稳定化的人血管残留至少180天（图15e及g）。令人感兴趣的是，hiPSC-LB移植片的血管网有与具有类似的形态的成体肝脏同程度的密度。另一方面，仅由HUVECs及hMSCs构建的移植片内的血管结构与hiPSC-LB移植片比较，虽然血管径是相同程度（约12μm），但密度更低（图15h、i及图26、27）。另外发现，由活体内成像，基于肝细胞的形态可推定分化状态（图27c及补充考察）。近年，从以基因改变动物作为对象的详细的研究的结果推测，内皮细胞不仅形成输送营养素或氧的途径，还由旁分泌TROPHOGEN（トロフォゲン）产生确立促进肝脏的器官形成及再生^8，20，21的血管微小环境。通过使用这样的移植模型，以人组织作为对象，确立了可评价器官形成时的成熟及分化过程的独特的活体内监测系统。由进一步研究得知，期待被知更精密再现生理性的肝形成的人间叶细胞株的器官发生时的作用。

将LB移植片在60天后，组织学地进行解析。与hFLC-LB同样地，hiPSC-LB移植片也有在成体肝脏中特征性的肝细胞索样的结构（图16a及图28a）、本结构由表达紧密连接蛋白－闭锁小带1（ZO-1）、ALB、细胞角蛋白8及18（CK8.18）（图16b）的细胞、及通常含沿洞样血管²²的全长发现的胶原IV的基底膜（图29a）构成。再者显示，表达作为成熟肝细胞标志物的无唾液酸糖蛋白受体1（ASGR1），不表达未成熟肝细胞标志物AFP（图29b、14a）。移植4个月后，在形成肝组织的几乎全部细胞中，由作为增殖标志物的Ki-67的表达确认与通常的肝脏内的肝细胞同样地增殖停止（图28b）。移植片来源的细胞有：良好发达的卵形的线粒体、紧密连接的形成、糖原及脂肪的细胞质内蓄积、毛细胆管这样的成熟肝细胞中特征性的超微细结构（图30b、c、d、e）。

解析进行hiPSC-LB移植的小鼠的血清的结果确认作为人蛋白质的人型ALB及A1抗胰蛋白酶（AAT）的生产及分泌（图16e）。移植60天后，将外植的hiPSC-LBs用qPCR解析的结果确认，与体外来源的hiPSC-LBs比较，有明显的肝成熟（图31）。为了研究糖质、氨基酸及核苷酸代谢这样的低分子量代谢物的表征，将hiPSC-LB移植片代谢产物组解析时，检测到含牛磺胆酸这样的肝脏特异性的物质的222种代谢物（图16f）。这些代谢性高的表征，相比原来的hiPSCs更近似于人成体肝脏的表征（图32）。再者，为了研究作为肝脏的重要的功能之一的药物代谢活性，将已知在人和小鼠以不同的样式代谢的酮洛芬²³或异喹胍^24，25施用于小鼠。药物施用之后，由移植hiPSC-LB的小鼠的尿及血清样品确认人中特异性的代谢物的形成（图16f、g、h及补充考察）。这显示，通过使用本小鼠模仿人的在体内的生理功能，可预测人的药物代谢表征。特别是，以往方法有以具有重度受损伤的肝脏的小鼠^26、27作为宿主，移植高品质的成体肝细胞的必要，在今后可使用人iPS细胞精密验证人型的药物应答的点上意义深远。

以将来的向临床的应用作为目的，对于作为相比颅更现实的目标部位，侵袭性极其低的肠系膜移植模型进行探讨。将hiPSC-LB向用纤维蛋白糊密封的肠系膜移植的结果，在第1个月人血管与宿主血管连结，由肉眼确认移植LB的植入（图33a、b）。进行向肠系膜移植的hiPSC-LB与颅移植的情况比较，在蛋白质产生及药物代谢的方面有更高的功能，如在先的研究²⁸也显示，证实门静脉循环的重要性。再者，与模拟处置小鼠比较，由hiPSC-LB的移植，用更昔洛韦引起肝功能衰竭的TK-NOG小鼠²⁹的生存率升高（图16i及补充考察）。从以上事实可说，通过移植体外hiPSCs来源的LB，我们在诱导有血管网的功能性的人肝脏组织中成功。

使用自身的多能性干细胞的再生医疗集合了极其大的期待。但是，作为使用干细胞的方法，使用作为现在主要的课题的细胞移植的临床试验至今尚无令人满足的结果^30、31。作为在体内制成3维血管新生的器官的新的方法，由本研究证明器官芽的移植是有效的。这些结果强调，作为器官功能衰竭的治疗，在体外生长的器官芽的移植具有大的治疗的有效性。

【方法摘要】

hiPSCs的肝初期分化诱导根据前述的方法⁵进行。将HUVECs和hMSCs（Lonza、Basel、Switzerland），使用内皮增殖培养基（EGM）（Lonza）或MSC增殖培养基（Lonza），在加湿温育器内，于37度、5%的CO₂存在下维持。在体外制成人LB时，向EGM和肝细胞用培养基（HCM）（Cambrex、Baltimore、MD）（含地塞米松（0.1μM、Sigma-Aldrich、St Louis、MO）、抑瘤素M（10ng/ml、R&DSystem、Minneapolis、MN）、HGF（20ng/ml、PromoKine）及SingleQuots（Lonza））悬浮1×10⁶的hiPSC来源肝细胞、0.8-1×10⁶的HUVECs、及2×10⁵的hMSCs，涂布于基质胶（BD Biosciences、Bedford、MA、USA）上。培养4-6天后，剥下生成的hiPSC-LBs，采集之后，移植到免疫缺陷小鼠的颅窗¹⁹。

【方法】

细胞培养及分化TkDA3hiPSC克隆购自Koji Eto氏及HiromitsuNakauchi氏。对于未分化hiPSC细胞，将小鼠胚成纤维细胞作为饲养细胞使用，在其上生长。内胚叶性分化时，将hiPSCs接种于用基质胶包被的皿上之后，移到含1%的B27（不含胰岛素）和（100ng/ml）的RPMI1640培养基，培养5～6天。通过将hiPSC来源的内胚叶细胞用含hbFGF（10ng/ml）、hBMP4（20ng/ml）及1%B27的PRMI1640再处理3-4天来进行向肝脏的特化。人重组体激活素A/EDF购自Yuzuru Eto氏（Ajinomoto Co.Inc.）。将hFLCs（CS-ABI-3716；AppliedCell Biology Research Institute）接种于用胶原IV包被的6-孔板（BDBiosciences）上之后，使用该研究室的标准培养基［含10%FBS（Lot.7219F；ICN Biochemical、USA）、50mmol/l HEPES（Wako PureChemical Industries、Japan）、2mmol/L L-谷氨酰胺（LifeTechnologies Corporation、USA）、50mmol/L2-巯基乙醇（Sigma）、1×青霉素/链霉素（Life Technologies）、10mmol/L烟酰胺（Sigma）、1×10^-4M地塞米松（Sigma）及1μg/ml胰岛素（Wako）的F-12（SigmaAldrich、Japan）和DMEM的1:1混液］维持。在培养前添加人重组体HGF（50ng/ml）及EGF（20ng/ml）（Sigma）。使用上皮增殖培养基或MSC增殖培养基（Lonza），在加湿温育器内，于37度、5%的CO₂存在下维持HUVECs及hMSCs（Lonza）。

为了由反转录病毒的转导活体成像，用表达EGFP或kusabiraorange（KOFP）的反转录病毒，如文献记载¹⁹感染细胞。即，将反转录病毒载体pGCDNsam IRES-EGFP或KOFP转染到293gp及293gpg包装细胞（由Masafumi Onodera氏提供）中，使用四环素诱导性的系统诱导病毒粒子产生。将感染反转录病毒的细胞的培养上清用0.45-μm滤器（Whatman，GE Healthcare，Japan）过滤，立即用于感染。KOFP是将在515nm处有小的峰的主要吸收极大波长在548nm处显示，然后发在561nm处有峰的亮橙色荧光³²。

【移植】

剥离在体外生成的LB，采集之后，移植到实施重度免疫缺陷的NOD/SCID小鼠（Sankyo Lab.Co.，Tsukuba，Japan）的颅窗内。移植的细胞的在体内的经过通过使用荧光显微镜（model BZ-9000；Keyence、Osaka、Japan）或Leica TCS SP5共聚焦显微镜（LeicaMicrosystems、Germany）的活体内成像观察。对于生存曲线而言，使用TK-NOG小鼠（体重<20-30g）（提供方Central Institute forExperimental Animals、Kanagawa、Japan）²⁹进行解析。将1打的hiPSC-LBs移植到肠系膜后，在第7及10天，在人及小鼠组织中，通过向小鼠施用无毒的更昔洛韦（GCV、50mg/kg、腹腔内注入），组织特异性地消去基因导入的肝脏的实质细胞。小鼠根据关于动物实验利用的当研究设施指南进行交配及维持。

由植入血管的灌流的数量化，由1%四甲基若丹明结合葡聚糖（MW2,000,000）、异硫氰酸荧光素结合葡聚糖（MW2,000,000）及德克萨斯红结合葡聚糖（70,000MW，中性）的尾静脉注入鉴定血管腔（全部Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。对于移植的血管及葡聚糖得到多个共聚焦像。使用MetaMorph Angiogenesis Module软件（Molecular Devices，Union City，CA，USA），处理像的投影。接下来，向Excel电子数据表自动地记录全细管长、每视场细管%及管直径。

如前所述³³实施表达基因的分析qPCR分析。人胎儿肝脏（LotNo.：A601605）及人成体肝脏（Lot No.：B308121）的全RNA从BiochainInstitute（Hayward，CA，USA）得到。

【表达基因的微阵列及数据分析】

使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA），由hiPSC来源细胞/组织（hiPSC，hiPSC-Def，hiPSC-Hep，hiPSC-IH，hiPSC-MH，hiPSC-LB，hiPSC-LB-Tx）制备全RNA。人胎儿肝脏（Lot No.：A601605）及人成体肝脏（Lot No.：B308121）的全RNA从BiochainInstitute（Hayward，CA，USA）得到。扩增cRNA，使用Low InputQuick Amp Labeling Kit（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）标记，与44K的60寡聚体微阵列（Human Gene Expression4×44K v2Microarray Kit；Agilent Technologies），根据生产商的指示杂交。将杂交的微阵列载玻片使用Agilent高解析度微阵列扫描仪扫描。使用特征提取软件版本10.7.3.1（Agilent Technologies），计算相对杂交强度及背景杂交值。根据Agilent Technologies推荐的顺序，使用GeneSpring11.5.1软件中的标志基准，由杂交强度及斑信息计算原始信号强度及各探针的标志。再者，对样品的原始信号强度进行log2变换，由变位值算法标准化。我们对全部的样品，除“妥协的”（compromised）标志之外，选择探针，作为检测的基因得到34,183个的探针。再者，我们把焦点放在基因水平中的26,153个的表达数据。由GeneSpring制作热图谱。加载标准化的强度值，由从各探针的中位值的距离进行标度调节。我们由使用欧几里得测定基准的序列的聚类法将样品及基因分类。为了评价各阶段的hiPSCs中的基因表达模式的差异，我们分析选择的83种基因的表达变化。这些基因在由在各不同的发生阶段的小鼠肝细胞及2个在不同阶段的人肝组织的微阵列分析的我们的以前的研究中鉴定。从全部的基因将83种基因作为肝脏特性基因选择。这是因为，它们的基因在人及小鼠两者的肝脏发生时继续增加。

使ELISA血液样品于室温在离心管内凝固（约5分钟）、从管的侧面分离，保持于4℃（熔化中的冰）20分钟。将凝固的血液以10-15分钟400g，于4℃离心，一边注意排除红细胞或凝固的物质，一边除去血清级分。将小鼠血清样品中的人ALB及AAT，使用人白蛋白ELISA定量试剂盒（Bethyl Laboratories Inc.，Montgomery，TX，USA）及人α1-抗胰蛋白酶ELISA定量试剂盒（GenWay Biotech，Inc.，San Diego，CA，USA），根据生产商的说明书测定。

使用溶解于全标本包埋免疫染色PBS的4%多聚甲醛（PFA）由心穿刺给小鼠灌流。除去形成颅窗的盖玻片，摘出移植片（厚度约300μm），在溶解于PBS的4%PFA中在冰上放置1.5小时。为了免疫染色，将固定胶原凝胶用PBS清洗3次（各10分钟）、使用3%BSA/0.1%Triton X-100阻断1小时，与第一抗体一同于4℃温育一晚。接下来，实施3次使用PBS/0.1%Triton X-100的10分钟清洗。与第二抗体一同将样品于4℃温育一晚，接下来，实施3次使用PBS/0.1%Triton X-100的10分钟清洗。使用DAPI对组织样品进行对比染色，包埋于封入剂（Vector Laboratories，USA）中的玻璃载玻片上，加盖盖玻片。使用以下的第一抗体：小鼠抗人ZO1、小鼠抗人CD31、及大鼠抗小鼠CD31（BD Biosciences）、兔抗小鼠胶原IV（Millipore，USA）及结蛋白（Dako Corporation，Carpinteria，CA）。免疫染色使用Leica TCS SP5共聚焦显微镜进行分析。

将组织处理及免疫染色组织在4%PFA中于4℃固定一晚，处理，然后在石蜡中包埋。为了使用苏木精/伊红（HE）的免疫染色或标准的组织学染色，将横断切片（4μm）加载到MAS包被载玻片（Matsunami，Osaka，Japan）上。免疫染色之前，实施使用柠檬酸缓冲液（pH6.0）的灭菌锅抗原回收。使用的第一抗体是，抗人：CD31；平滑肌肌动蛋白；AFP；CK8.18（全部Dako Corporation）及ALB（BD Biosciences）。将组织切片与第二抗体Alexa Fluor（LifeTechnologies）一同于室温温育1小时，接下来进行DAPI（Sigma）核染色。使用LSM510激光扫描显微镜（Carl Zeiss Co.，Germany）得到像。

统计学分析数据表示从3或6次独立的实验得到的平均值±标准偏差。将3或4组间的比较，依次（依顺序）使用Kruskal-Wallis检验进行分析，然后将Mann-Whitney的U检验与邦弗朗尼补正一同使用而进行事后比较。作为<0.05的两侧P值被认为是显著的。

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【补充方法】

【HUVEC MSC分离】

我们根据由横浜市立大学伦理委员会制定，承认的指南得到脐带样品（承认编号：13120510008）。HUVECs及MSCs，如文献中记述²、从脐带同时分离。

【mFLC分离】

将从C57BL/6-Tg CAG::EGFP（SLC，日本）分离的E13.5mFLCs，在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM；含10%牛胎儿血清（FBS））（JRH Bioscience，USA）中通过移液器吸吐机械分离。通过实施数次低速离心分离（690rpm/于4℃1分钟），将肝细胞与非实质细胞分离。使分离的细胞2次通过70μm细胞滤器（Falcon，USA），得到单细胞。

【植入的肝细胞形态的定量】

使用IN Cell Investigator软件（GE Healthcare，Fairfield，CT，USA）处理活体内共聚焦像，使用“形状因子”（将周长与面积关联的，圆形度的标准的推定）对肝细胞分化的状态进行分类。此测定值是，以1作为完全的圆，在0～1之间变动。

【代谢产物组表征的获得】

移植60天后，回收hiPSC-LB移植片（n=3），分析。使用具备Agilent6210小时飞行型质谱分析计，Agilent1100均一浓度HPLC泵，Agilent G1603A CE-MS适配体试剂盒及Agilent G1607A CE-ESI-MS喷雾器套件的Agilent CE毛细管电泳系统（Agilent Technologies，Waldbronn，Germany），实施CE-TOFMS。此系统由CE用AgilentG2201AA ChemStation软件版本B.03.01（Agilent Technologies，Waldbronn，Germany）控制。阳离子性代谢物使用作为电解质使用阳离子缓冲溶液（Human Metabolome Technologies）的融合氧化硅毛细管（内径50μm x全长80cm）进行分析。用50mbar的压力注入样品10秒钟（约10nl）。将施加电压设定为27kV。以阳性离子模式实施电子喷雾离子化质谱分析（ESI-MS），将毛细管电压设定为4,000V。从m/z50至1,000扫描质谱分析计。其他条件与在阳离子分析³中同样。

阴离子性代谢物使用作为电解质使用阴离子缓冲溶液（HumanMetabolome Technologies）的融合氧化硅毛细管（内径50μm x全长80cm）进行分析。用50mbar的压力注入样品25秒钟（约25nl）。将施加电压设定为30kV。以阴性离子模式实施ESI-MS，将毛细管电压设定为3,500V。从m/z50至1,000扫描质谱分析计。其他条件与在阴离子分析⁴中同样。

将从CE-TOFMS得到的原始数据由作为自动积分软件的MasterHands⁵处理。得到含m/z、移动时间（MT）及面积的峰信息。峰面积根据下述的等式变换为相对峰面积。各峰根据CE中的类似的移动时间及由TOFMS确定的m/z值合并。

相对峰面积=代谢物峰面积/（内部标准峰面积×样品量）

代谢途径图谱使用作为公有的软件的VANTED：Visualisation andAnalysis of Networks containing Experimental Data⁶提供。

【药物代谢活性】

向在颅窗内移植hiPSC-LB的NOD/SCID小鼠（n=3）静脉内施用酮洛芬（15mg/kg）。作为对照，使用伪手术的NOD/SCID小鼠。将尿（0-2小时）在0.5M醋酸缓冲液（pH5.0）中集合。向尿样品添加1N KOH，于80℃温育3小时，其后，使用等容量的1N HCL进行中和。添加含1%醋酸的乙腈，经离心（15000rpm，4℃，5分钟）。使上清经历液相层析-串联质谱分析（LC/MS/MS）。在液相层析实验中，使用具备Intersil ODS-3柱（GL Science株式会社、东京、日本）的LC-20A系列（岛津、京都、日本）。由层析的分离使用Intersil ODS-3柱（5μm，4.6x150mm I.D.；GL Science株式会社、东京、日本）实现。柱温度维持在40℃。将包含含有0.1%醋酸（溶剂A）及0.1%醋酸的乙腈（溶剂B）的移动相，根据以下的梯度进度表，以流速0.5mL/分注入：25-80%溶剂B的直线梯度（0-15分钟）、80%溶剂B（15-25分钟）、80-25%溶剂B的直线梯度（25-26分钟）、及25%溶剂B（26-35分钟）。将液相层析与4000Q Trap系统（AB SCIEX，Foster City，CA）连结，以阴性电子喷雾离子化模式操作。涡轮气体维持在600℃。亲及/或片段离子用第一四极子过滤，然后作为冲突气体使用氮而在冲突池内解离。离子喷雾电压是-4500V，酮洛芬及1-羟基酮洛芬分析的m/z迁移（Q1/Q3）分别是253.1/209.3及269.1/209.3。

向在颅窗内（n=3）及肠系膜内（n=3）移植hiPSC-LB的NOD/SCID小鼠经口施用异喹胍（2mg/kg）。作为对照，使用伪手术的NOD/SCID小鼠。施用的0.5、1，2及8小时后，将血液样品集合，添加肝素钠。从血液由离心分离血浆。将内部标准（尼氟酸1μm）及甲醇溶液（100μL）添加到5μL的血浆，经离心（15000rpm，4℃，5分钟）。使上清经历LC/MS/MS。在LC实验中，使用具备Aquity UPLC BEH C18柱（Waters，Milford，MA，USA）的Acquity UltraPerformance LC系统（Waters，Milford，MA，USA）。由层析的分离使用Acquity UPLCBEH C18（1.7μm，2.1x50mm I.D.；Waters，Milford，MA，USA）实现。柱温度维持在40℃。将含有10mM醋酸铵（溶剂A）及乙腈（溶剂B）的移动相，根据%以下的梯度进度表，以流速0.8mL/分注入：0%溶剂B（0-0.2分钟）、0-30%溶剂B的直线梯度（0.2-0.3分钟）、30-60%溶剂B的直线梯度（0.3-0.85分钟）、60%溶剂B（0.85-1.15分钟）、60-100%溶剂B的直线梯度（1.15-1.16分钟）、及100%溶剂B（1.16-1.5分钟）。将液相层析与API4000系统（AB SCIEX，FosterCity，CA）连结，以阳性电子喷雾离子化模式操作。涡轮气体维持在450℃。亲及/或片段离子用第一四极子过滤，然后作为冲突气体使用氮在冲突池内解离。离子喷雾电压是5000V，4-羟基异喹胍及内部标准分析的m/z迁移（Q1/Q3）分别是192.6/132.1及283.2/245.4。

【肝损伤模型】

为了评价我们的移植战略的治疗的可能性，使用Alb-TRECK/SCID小鼠进行肝损伤研究。Alb-TRECK/SCID小鼠由Hiromichi Yonekawa及Kunie Matsuoka（东京都临床医学综合研究所）提供。此转基因系统从ALB增强子/启动子表达HBEGF，然后施用少量的白喉毒素（DT）的则引发剧症肝炎⁷。向用纤维蛋白糊覆盖的肠系膜中移植hFLCs-LBs。LB移植后，在第2天由尾静脉注入1.5μg/kg DT，引起重度的肝损伤。比较受移植的小鼠和未受移植的小鼠之间的生存。

补充考察

功能性肝脏组织制造中的颅窗模型的可能性

用于颅窗制备的详细的顺序如前所述⁸。我们评价了在使用表达EGFP的E13.5小鼠胎儿肝细胞（mFLCs）的移植片来研究肝细胞的成熟上的颅窗的可能性。切出包埋于胶原/纤连蛋白凝胶的mFLCs的一片，置于颅窗之中心部。接下来，使用组织适合性的氰基丙烯酸酯糊使8mm的盖玻片粘接于骨，将此窗密封。活体内荧光显微镜成像显示移植的mFLCs良好地植入，及在移植片内形成功能性血管网（图21a）。移植的组织广范分化为类似于肝细胞索、血窦及胆管的组织。这些组织是成体肝脏中特征性的，不是供体E13.5LBs中特征性的（图21b）。由mFLCs的肝组织再构成随HGF及EGF（这些已知刺激肝干细胞/前体细胞的增殖）的添加增强（图22）^9,10。从而提示，此移植方法是对于评价LB细胞的成熟及分化有益的活体内监测系统。

人肝细胞成熟的活体内评价

在正常肝发生过程中，肝细胞的形态从圆形变化为铺路石状的细胞¹¹。此变化可由细胞角蛋白免疫染色容易地可视化（图16a、左）。使用IN Cell Investigator软件，我们发现小鼠肝细胞的圆形度（形状因子）从E13.5时的0.833±0.18降低至生产后8周的0.568±0.16。同样地，单细胞形态的活体内成像显示，移植的EGFP标记hFLCs的圆形度从第0天的0.93±0.07变化为30天后的0.512±0.13（图27c、右）。与这些考察一致，酶联免疫测定法（ELISA）显示从移植30天后起的人白蛋白产生的出现（图16c及d）。从而，细胞形态的活体内监测可成为用于预测在体内的肝细胞分化的状态的一种指标。

人特异性药物代谢的检测

我们使用酮洛芬（KTP）评价了人特异性药物代谢功能。KTP在小鼠中被细胞染料P450第一代谢，形成1-羟基酮洛芬（OH-KTP）¹²。另一方面，在人中，KTP主要被UDP-葡萄糖醛酰基转移酶（UGT）代谢，形成酮洛芬葡萄糖醛酸苷（KTP-G）¹³。

肝脏人化小鼠是在研究人特异性药物代谢上有用的工具。使用高品质的成体肝细胞及有严重损伤的肝脏的免疫缺陷小鼠，以前报告了肝脏人化小鼠中的人特异性药物代谢功能。KTP的施用后观察到，UGT使KTP葡萄糖醛酸苷化变得容易¹⁴、及由水解而KTP代谢为KTP-G。计算KTP/OH-KTP峰面积比，在水解样品和非水解样品之间比较此面积比。KTP/OH-KTP峰面积比的倍增提示样品中的KTP-G的形成。有移植的hiPSC-LBs的NOD/SCID小鼠及对照小鼠中的尿中的倍增分别是11.8±5.2及2.3±0.7，提示在移植hiPSC-LBs的NOD/SCID小鼠中观察到KTP葡萄糖醛酸苷化（人特异性药物代谢功能）。

作为对人CYP2D6的一般表现型检查剂发挥作用的异喹胍在人中被代谢为4-羟基异喹胍（4-OHDB），但在小鼠中可忽略。重要的是，人CYP2D6与公知药物的25%的代谢相关，由此，通过多型多数存在，恭献于显著的个体差异。异喹胍的经口施用后，在肠系膜或颅接受移植的组中的4-OHDB的血浆浓度相比伪手术组中的浓度更高，这反映人特异性药物代谢物的产生。

面向临床应用的hFLC-或hiPSC-LB的肠系膜移植模型的确立

由于颅窗模型是高度侵袭性的，对于器官芽移植而言说不上是非常地有效的方法。从而，在推定临床应用时，更低侵袭性的移植法的开发是必要的。再者，移植可能的量对于逆转肝功能衰竭而言是不足够的。从而，我们试着探讨了侵袭性最少、有临床适宜性的、肠系膜移植模型的可能性。这是因为，对于肝功能的改善而言，门静脉血流被认为是重要的。与我们的期待一致，最近的报告显示，恐怕由来自肠系膜血流的宿主血管补充而腹腔部位可支持人成体肝细胞的植入及肝功能的维持¹⁵。将在体外增殖的hFLC-LBs或hiPSC-LBs移植到肠系膜上（图33a）。

【由2/3份分肝切除的刺激】

为了确定hiPSC-LB移植片中的肝细胞成熟是否可被HGF等的再生因子促进，在肠系膜移植后第7天实施2/3部分肝切除（PH）。2/3PH实施后，在第30天，人白蛋白的产生从伪手术组的82.1ng/ml升高至2/3PH组的121ng/ml（图33c）。这些的结果提示，恐怕由于hiPSC-LB移植片内的广范的肝细胞增殖及成熟，hiPSC-Heps可应答于2/3PH后的再生刺激。

【使用hFLC-LB肠系膜移植的肝功能衰竭的逆转】

为了评价使用我们的移植法的治疗可能性，将在体外增殖的hFLC-LBs移植到用纤维蛋白糊密封的肠系膜上。作为肝损伤模型，使用在肝细胞特异性白蛋白启动子的控制下表达人HB-EGF前体的转基因免疫缺陷小鼠。一旦向被称为毒素受体媒介细胞敲除/重症复合免疫缺陷（TRECK/SCID）小鼠的这些小鼠施用少量的白喉毒素（DT），则会引发剧症肝炎⁷。在移植后第2天，以1.5μg/kg的用量由尾静脉注入DT剂。生存曲线显示，未受移植的TRECK/SCID小鼠的全部在10天以内死亡。作为对照，移植hFLC-LB的TRECK/SCID小鼠的28%生存经40天以上，显示我们的概念证实的治疗上的可能性（图32d）。但是，此移植模型虽在某种程度良好，但救助率却不高。这是因为，DT对人细胞有毒性。从而，我们采用免疫缺陷肝损伤模型作为TK-NOG小鼠。这是因为，GCV（对人组织是非毒性的）的施用在适宜的时机诱导转基因肝实质细胞的组织特异性除去。使用此模型，我们在经功能性人血管网的形成而移植片被预测良好地植入的移植后第7天及第10天除去宿主肝细胞。

补充参考文献

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将本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请直接作为参考并入本说明书中。

工业实用性

由本发明的方法制作的组织及器官可在药物开发筛选等中使用，从而本发明可在制药产业等利用。

Claims (20)

1.器官芽的制作方法，其包括将器官细胞和选自下述的至少1种细胞和/或因子一起培养，所述细胞和/或因子为：由血管内皮细胞、间叶系细胞、血管内皮细胞分泌的因子；由间叶系细胞分泌的因子；由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者的存在而分泌的因子。

2.权利要求1所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是分化的细胞。

3.权利要求1所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是未分化的细胞。

4.权利要求1～3中任一项所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是：内胚叶性器官的细胞或可能分化为内胚叶性器官的细胞的细胞、中胚叶性器官的细胞或可能分化为中胚叶性器官的细胞的细胞、或者外胚叶性器官的细胞或可能分化为外胚叶性器官的细胞的细胞。

5.权利要求4所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是内胚叶性器官的细胞或可能分化为内胚叶性器官的细胞的细胞。

6.权利要求5所述的器官芽的制作方法，其中内胚叶性器官是肝脏或胰腺。

7.权利要求1～6中任一项所述的器官芽的制作方法，其中器官细胞是人工多能性干细胞来源的细胞。

8.权利要求7所述的器官芽的制作方法，其中人工多能性干细胞是人来源的。

9.权利要求1～8中任一项所述的器官芽的制作方法，其将器官细胞和选自下述的至少1种细胞和/或因子一起在血管内皮细胞培养用培养基中培养，所述细胞和/或因子为：由血管内皮细胞、间叶系细胞、血管内皮细胞分泌的因子；由间叶系细胞分泌的因子；由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子。

10.权利要求1～9中任一项所述的器官芽的制作方法，其将器官细胞和选自下述的至少1种细胞和/或因子一起接种于凝胶上进行培养，所述的细胞和/或因子选自由血管内皮细胞、间叶系细胞、血管内皮细胞分泌的因子；由间叶系细胞分泌的因子；由于血管内皮细胞和间叶系细胞这二者存在而分泌的因子。

11.权利要求1～10中任一项所述的器官芽的制作方法，其中血管内皮细胞是分化的细胞。

12.权利要求1～10中任一项所述的器官芽的制作方法，其中血管内皮细胞是未分化的细胞。

13.权利要求1～12中任一项所述的器官芽的制作方法，其中间叶系细胞是分化的细胞。

14.权利要求1～12中任一项所述的器官芽的制作方法，其中间叶系细胞是未分化的细胞。

15.组织或器官的制作方法，其包括将由权利要求1～14中任一项所述的方法制作的器官芽移植进非人动物而分化为组织或器官。

16.器官芽的移植方法，其包括将由权利要求1～14中任一项所述的方法制作的器官芽移植进人或非人动物。

17.权利要求16所述的器官芽的移植方法，其中器官芽的移植部位选自：颅内、肠系膜、肝脏、脾脏、肾脏、肾被膜下、门静脉上。

18.组织或器官的再生或功能恢复方法，其包括将由权利要求1～14中任一项所述的方法制作的器官芽移植到人或非人动物，分化为组织或器官。

19.非人嵌合体动物的制作方法，其包括将由权利要求1～14中任一项所述的方法制作的器官芽移植进非人动物而分化为组织或器官。

20.评价药剂的方法，其使用选自由权利要求1～14中任一项所述的方法制作的器官芽、由权利要求15所述的方法制作的组织及器官、以及由权利要求19所述的方法制作的非人嵌合体动物的至少一种。

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