WO2020175594A1 - 血液凝固および／または補体異常疾患の治療用組成物 - Google Patents

血液凝固および／または補体異常疾患の治療用組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2020175594A1
WO2020175594A1 PCT/JP2020/007886 JP2020007886W WO2020175594A1 WO 2020175594 A1 WO2020175594 A1 WO 2020175594A1 JP 2020007886 W JP2020007886 W JP 2020007886W WO 2020175594 A1 WO2020175594 A1 WO 2020175594A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
factor
complement
vascular endothelial
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/007886
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貴則 武部
憲和 佐伯
絵理 川上
Original Assignee
公立大学法人横浜市立大学
武田薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人横浜市立大学, 武田薬品工業株式会社 filed Critical 公立大学法人横浜市立大学
Priority to EP20762621.9A priority Critical patent/EP3932486A4/en
Priority to JP2021502350A priority patent/JP7501875B2/ja
Priority to US17/434,635 priority patent/US20220088085A1/en
Publication of WO2020175594A1 publication Critical patent/WO2020175594A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1725—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a or C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4833—Thrombin (3.4.21.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21027—Coagulation factor XIa (3.4.21.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a composition for treating blood coagulation and/or a disorder of complement abnormality. More specifically, the present invention relates to a method for producing a composition for treating blood coagulation and/or abnormal complement diseases by culturing organoid. The present invention also relates to a composition for treating blood coagulation and/or complement abnormalities, which is produced by such a method.
  • Hemophilia is a representative of diseases related to the blood coagulation system (blood coagulation disorders) caused by a deficiency of a specific blood coagulation factor, that is, factor VIII (hemophilia 8) or factor IX (hemophilia). It is a target.
  • congenital coagulation factor deficiency due to deficiency or abnormality of other blood coagulation factors eg, factor II, factor V, factor VII, factor X and factor XI
  • factor II, factor V, factor VII, factor X and factor XI is related to hemophilia. It is classified as a disease.
  • antithrombin deficiency causes thrombosis.
  • deficiencies or abnormalities of complement components/factors also cause diseases related to various complement systems.
  • a method for treating such blood coagulation diseases a method of administering a protein such as a blood coagulation factor to a patient is used.
  • a protein such as a blood coagulation factor
  • the recombinant protein of human factor VIII is produced in cultured cells using the adeno-associated virus (88) vector, and the recombinant protein is recovered and used in patients.
  • the method of administration is done.
  • such a therapeutic method has a therapeutic effect because it is difficult to express Factor VIII in cultured cells using the 88V vector, and an antibody that inhibits the action of the recombinant protein is produced in the patient's body. There is a problem that it decreases.
  • Non-Patent Document 1 describes (two-dimensionally) on Matrigel applied to a slide (1) Organoids made from human microvessel endothelial cells (MVEC) and liver cells, (2) Organoids made from human umbilic al-vein endothelial cells (HUVEC) and liver cells , (3) Organoids made from liver liver sinusoidal endothelial cells (L SEC) and liver cells, and (4) Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human dermal fibroblasts. (Normal human derma I fibroblasts; N HDF) and an organoid prepared from liver cells were cultured, respectively, and the network of vascular endothelial cells collapsed in (2) and (3) above.
  • Non-Patent Document 1 it is unclear whether vascular coagulation factors and/or complements are secreted into the culture supernatant, and at least the cell supernatants were collected to detect abnormal blood coagulation and/or complement diseases. None is mentioned about its use as a raw material for the manufacture of a therapeutic composition.
  • Non-Patent Document 1 TISSUE ENGINEERING, 12(6), 2006, pp.1627-1638.
  • the present invention provides a composition suitable for treating blood coagulation diseases and/or complement abnormality diseases (raw material for producing a therapeutic agent for those diseases) and an efficient method for producing the same. Is an issue.
  • the present inventors have packaged an organoid produced from vascular endothelial cells, or an organoid produced from liver cells and vascular endothelial cells in an extracellular matrix represented by Matrigel (registered trademark). It was found that blood coagulation factors and/or complement factors were secreted into the cell supernatant when they were cultured in a buried state. So ⁇ 02020/175594 3 ⁇ (: 171? 2020 /007886
  • the present invention provides the following [1] to [4] to solve the above problems.
  • a method for producing a composition for treating blood coagulation and/or abnormal complement disease which comprises the following steps:
  • vascular endothelial cells or
  • Vascular endothelial cells and liver cells are Vascular endothelial cells and liver cells
  • composition for treating blood coagulation and/or complement abnormality disease which comprises the culture supernatant according to Item 2.
  • a composition for treating a blood coagulation disease and/or a complement abnormality disease which comprises two or more components selected from the following:
  • a blood coagulation disease and/or complement A culture supernatant suitable as a composition for treating abnormal diseases (or a raw material for a therapeutic agent for those diseases) can be obtained.
  • the therapeutic composition can be obtained not only once but from the culture supernatant repeatedly, so that the efficiency of the manufacturing process when the therapeutic composition is mass-produced And cost reduction can be expected.
  • the “marker” means a cell antigen or its gene that is specifically expressed by a predetermined cell type, such as “marker protein” or “mer gene”.
  • the marker is a cell surface marker, in which case viable cell enrichment, isolation and/or detection can be performed.
  • the marker can be a positive selection marker or a negative selection marker.
  • Detection of the marker protein is carried out by an immunological assay known in the art using an antibody specific to the target marker protein, for example, It can be performed using immunostaining and flow cytometry.
  • the marker gene can be detected by a nucleic acid amplification method and/or nucleic acid detection method known in the art, for example, 0 (3 ⁇ 4 (quantitative , Etc.), microarrays, biochips and the like.
  • the term "positive" for a marker means that the protein or gene is expressed in a detectable amount (or an amount higher than the intensity of background) by a method known in the art. Means
  • a marker "negative” means that the expression level of a protein or gene is below the lower limit of detection (or lower than the background level) by all or any of the methods known in the art. ) Means that. The lower limit of detection of protein or gene expression may vary with each method.
  • the method for producing a composition for treating blood coagulation diseases and/or abnormal complement diseases of the present invention includes the following steps (1) to (3):
  • vascular endothelial cells or
  • Vascular endothelial cells and liver cells are Vascular endothelial cells and liver cells
  • step (1) is a step (1 A) of embedding an organoid prepared from vascular endothelial cells in an extracellular matrix. In one embodiment of the present invention, step (1) is a step (1B) of embedding an organoid prepared from vascular endothelial cells and liver cells in an extracellular matrix.
  • the vascular endothelial cells in the present invention include both hematopoietic vascular endothelial cells (hemogen ic endothe Iia I cell; HEC) and non-hematopoietic vascular endothelial cells (non-HEC). Is a term that includes.
  • HEC is a vascular endothelial cell capable of producing hematopoietic stem cells (has a hematopoietic ability), and is also called a hematopoietic vascular endothelial cell.
  • HEC vascular endothelial cells
  • HEC, non-HEC, and any combination of progenitor cells thereof may be used.
  • the present invention is carried out by combining with liver cells, that is, the embodiment of step (1 B).
  • H EC hematopoietic vascular endothelial cell
  • H EC used in the present invention may contain its progenitor cells.
  • progenitor cells are typically cells present in the process of differentiation from Flk-1 (CD309, KDR)-positive vascular endothelial cell progenitor cells (eg, lateral plate mesodermal cells) to H EC cells. (See Cell Reports 2, 553-567, 2012).
  • Flk-1 (CD309, KDR)-positive progenitor cells at an early stage of differentiation are progenitor cells that are common to HEC cells and n ⁇ n _ HEC cells.
  • the “progenitor cell” also includes a progenitor cell common to HEC cells and n° n -HEC cells.
  • non-hematopoietic vascular endothelial cells (n __H EC) "means vascular endothelial cells that are positive for CD31, CD73 and CD144 and have no hematopoietic ability.
  • the n° n-HEC used in the present invention may contain the progenitor cells thereof.
  • progenitor cells are typically present in the process of differentiation from Flk-1 (CD309, KDR)-positive vascular endothelial cell progenitor cells (eg, lateral plate mesodermal cells) to non _H EC cells. Cells (see CeU Reports 2, 553-5 67, 2012).
  • Progenitor cells at an early stage of differentiation are progenitor cells common to HEC cells and n ⁇ n _ HEC cells.
  • “O n-HEC progenitor cells” also include progenitor cells that are common to HEC cells and n o n-HEC cells.
  • the vascular endothelial cells used in the present invention include vascular endothelial cells collected from a living body (for example, microvessel endothelial cells (MVEC), liver sinusoidal endothelial cells (LSEC)).
  • Umbilical-vein endothelial cells (UVEC) and other highly pure cell populations, or pluripotent stem cells such as ES cells and i PS cells, and other vascular endothelial cells It may be a highly pure cell population of vascular endothelial cells obtained by differentiating cells having the ability to differentiate into.
  • the highly pure cell population of vascular endothelial cells contains 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more of vascular endothelial cells with respect to the total number of cells in the cell population.
  • the hematopoietic vascular endothelial cells (H EC) used in the present invention may be a highly pure cell population of H EC collected from a living body, or pluripotent cells such as ES cells and i PS cells. It may be a high-purity H EC cell population obtained by differentiating stem cells or other cells capable of differentiating into vascular endothelial cells (eg, lateral plate mesodermal cells).
  • the above H EC-purified cell population is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 99% or more of H EC and/or H EC with respect to the total number of cells in the cell population. Contains progenitor cells.
  • a method for differentiating pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and other cells having the ability to differentiate into vascular endothelial cells into hematopoietic vascular endothelial cells (H EC) is known, and for example, , IPS cells, PLoS One, 2013; 8(4): e59243, N at Biotechnol. 2014; 32(6): 554-61, Sci Rep. 2016; 6: 35680. It can be carried out.
  • the H EC high-purity cell population is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 99% or more with respect to the total number of cells in the cell population. Including H EC.
  • non-hematopoietic vascular endothelial cells used in the present invention may be a high-purity cell population of n ⁇ n -HEC collected from a living body, ES cells or i PS.
  • N ⁇ n _ obtained by differentiating pluripotent stem cells such as cells and other cells that have the ability to differentiate into vascular endothelial cells (eg, lateral plate mesoderm cells) It may be a highly pure cell population of HEC.
  • n ⁇ n-HEC high-purity cell population is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more of non _H EC and/or the total number of cells in the cell population. Alternatively, it contains n ⁇ n _ HEC progenitor cells.
  • a method for differentiating pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells and other cells having the ability to differentiate into vascular endothelial cells into non-hematopoietic vascular endothelial cells is known. Yes, for example, from iPS cells according to the method described in Nat Cell Biol. 2015; 17 (8): 994-1003, Cell Rep. 2017; 21 (10): 2661 -2670, etc. ..
  • the n ⁇ n _ HEC high-purity cell population is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more with respect to the total number of cells in the cell population, or Includes 99% or more n ⁇ n-H EC.
  • the “liver cell” in the present invention refers to a differentiated liver cell (differentiated liver cell) and a cell whose fate to differentiate into a liver cell is not yet differentiated into a liver cell (undifferentiated).
  • Differentiated liver cells) and so-called hepatic progenitor cells are terms that include both concepts.
  • the differentiated liver cell may be a cell collected from a living body (isolated from a liver in vivo), a pluripotent stem cell such as ES cell or iPS cell, a liver progenitor cell, and other liver cells. It may be a cell obtained by differentiating a cell having the ability to differentiate into a cell.
  • Undifferentiated liver cells may be obtained from a living body, or may be obtained by differentiating pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, or other stem cells or progenitor cells.
  • Cells capable of differentiating into liver cells are, for example, K.Si-Taiyeb, et a 1. Hepatology, 51 (1): 297-305 (2010), T. Touboul, et al. Hepato log y. 51 (5). :1754-65. (2010).
  • Purified cell population may be used, or differentiated liver Cell mixtures containing cells and undifferentiated liver cells in any proportion may be used.
  • a method for differentiating pluripotent stem cells such as ES cells and i PS cells, hepatic progenitor cells, and other cells having the ability to differentiate into liver cells into liver cells is known. Can be performed according to the method described in Hepatology, 2010; 51(1): 297-305, Cell Rep. 2017; 21(10): 2661-2670 and the like.
  • a cell is a differentiated hepatocyte depends on whether mature hepatocyte marker asialoglycoprotein receptor 1 (ASGR 1) or immature hepatocyte marker (early liver differentiation marker) a fetoprotein (AFP), early liver differentiation marker albumin (AL B), retinol binding protein (RBP 4), transthyretin (TT R), glucose _ 6-phosphatase (G 6 PC), etc. It can be determined by whether the expression of protein or mRNA is positive.
  • ASGR 1 asialoglycoprotein receptor 1
  • AFP fetoprotein
  • AL B early liver differentiation marker albumin
  • RBP 4 retinol binding protein
  • TT R transthyretin
  • G 6 PC glucose _ 6-phosphatase
  • Whether or not a cell is an undifferentiated liver cell depends on H H EX, S0X2, H N
  • marker proteins such as F4a, AFP, and ALB is positive.
  • the organoid used in the above step (1 A) is a three-dimensional structure made only from vascular endothelial cells.
  • the organoid used in the above step (1 B) is a three-dimensional structure prepared from vascular endothelial cells and liver cells, and has a vascular network composed of vascular endothelial cells between liver cells.
  • These organoids are generally produced by a three-dimensional culture method known per se (eg, Nature Cell Biology 18, 246-254 (2016)). Alternatively, as will be described later, it is possible to form a three-dimensional structure by culturing single cells in an extracellular matrix in advance to form an organoid.
  • the ratio of the cell numbers of vascular endothelial cells and liver cells for producing the organoid used in the above step (1 B) is determined by, for example, the components contained in the culture supernatant recovered in the step (3). Appropriate from the perspective of ensuring that It can be adjusted within a wide range.
  • the ratio of cell numbers of vascular endothelial cells and liver cells is typically 1:0.1-5, preferably 1:0.1-. Is 2.
  • a medium for vascular endothelial cells and a medium for liver cells are used.
  • An organoid medium mixed with (culture solution) in an appropriate ratio (for example, 1:1) is used.
  • Examples of the medium for vascular endothelial cells include DMEM/F-12 (Gibco), Stempro-3 4 SFM (Gibco), Essential 6 medium (Gibco), Essential 8 medium (Gibco), EG M (Lonza) ), Bu l letKi t (Lonza), EGM-2 (Lonza), Bu l letKi t (Lonza), E GM-2 MV (Lonza), VascuLife EnGS Comp Kit (LCT), Human Endothe lia lS FM Basal Growth Medium (Invitrogen), human microvascular endothelial cell growth medium (T 0Y0B0) and the like.
  • the medium for vascular endothelial cells includes B27 Supplements (GIBCO), BMP4 (bone morphogenetic factor 4), GSK/S inhibitor (eg, CHIR99021), VEGF (vascular endothelial growth factor), FGF 2 (Fibroblast Growth).
  • GEBCO B27 Supplements
  • BMP4 bone morphogenetic factor 4
  • GSK/S inhibitor eg, CHIR99021
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF 2 Fibroblast Growth
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF Stem Cell Factor
  • TGF/S receptor inhibitor e.g., SB 431542
  • F lt-3L Fms-related tyrosine kinase 3
  • IL-6 Interleukin 6
  • TPO thrombopoietin
  • hEGF recombinant human epidermal growth factor
  • hydrocortisone ascorbic acid
  • IG F1 FBS bovine Fetal serum
  • antibiotics eg gentamicin, amphotericin B
  • heparin L-glutamine, phenol red, BBE and the like
  • Examples of the medium for liver cells include RPMI (Fujifilm) and HCM (Lonza).
  • the medium for liver cells is Wnt3a, activin A, BMP4, FGF2, FBS (fetal bovine serum), HGF (hepatocyte growth factor), oncostatin M (0SM), dexamethas. It may contain one or more kinds of additives selected from Dex and the like. Those skilled in the art can appropriately determine the amounts of these additives to be added with reference to the usual culture conditions for culturing liver cells.
  • a medium for liver cells containing at least one selected from ascorbic acid, BSA-FAF, insulin, hydrocortisone and GA-1 000.
  • GM Bu I letKit medium without hEGF (recombinant human epidermal growth factor), RPMI1640 (Sigma-Aldrich) supplemented with 1% B27 Supplements (GIBC0) and 10 ng/mL hHGF (Sigma-Aldrich) Lonza) and HCM Bullet Kit (Lonza) without hEGF (recombinant human epidermal growth factor) mixed in a ratio of 1:1, and use a medium such as dexamethasone, ncostatin M and HGF. May be.
  • culture conditions typically 5% culture temperature at C_ ⁇ 2. 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C, the culture period is usually 1-2 days is there.
  • the container used for producing the organoid can be appropriately selected depending on the size of the organoid to be produced.
  • a culture vessel include a culture vessel having an equivalent diameter of 20 Mm or more and 2.5 mm or less and a depth of 20 Mm or more and 100 Oym or less, as described in WO2014/199622, or a commercially available culture vessel.
  • a container E Ip traditionala (Kuraray)
  • the culture vessel is preferably made of a material that does not allow organoids to adhere to the surface or is surface-treated.
  • the formation of the organoid used in the above step (1 B) can be determined by one or more of the following methods:
  • Hepatocyte marker eg, AFP, ALB, HNF4a positive.
  • mesenchymal cells are not used in the production of organoid.
  • mesenchymal cells are mainly found in connective tissue derived from mesoderm. However, it refers to connective tissue cells that form the supporting structure of cells that function in tissues, and the fate of differentiation into differentiated cells (differentiated mesenchymal cells) and mesenchymal cells has been determined. It is a term that includes both the concept of cells that have not differentiated into lineage cells (undifferentiated mesenchymal cells), so-called mesenchymal stem cells. Terms such as mes enchyma I stem cells, mesenchymal progenitor cells, mesenchymal cells (R. Peters, et al.
  • vascular endodermal cells are a type of cells differentiated from undifferentiated mesenchymal cells, but are excluded from the definition of “mesenchymal cells” in the present specification. That is, in the present invention, neither "undifferentiated mesenchymal cells” nor “differentiated mesenchymal cells” excluding vascular endothelial cells are used in the organoid production step.
  • Whether a certain cell is an undifferentiated mesenchymal cell or a differentiated mesenchymal cell depends on, for example, a marker of an undifferentiated mesenchymal cell, S tr o-1, CD 29, CD44, CD. 73, CD 90, CD 105, CD 133, CD 271, N estin, etc. depending on whether or not expression of one or more proteins or mRNAs is positive (if positive, undifferentiated mesenchymal system Cells, and if negative, differentiated mesenchymal cells).
  • the extracellular matrix in the present invention a general one that is solid at room temperature or higher and is used in cell culture, particularly three-dimensional cell culture, can be used.
  • the extracellular matrix is mainly composed of fibrous proteins and proteoglycans. Examples of such components include elastin, entactin, osteonectin, collagen, tenascin, thrombospondin, parcan, vitronectin, fiprilin, fibronectin, Examples include heparin (sulfate) and laminin. Contains laminin, collagen V and entactin known under the trade name "Matrigel" (Corning), and also contains growth factors such as EG F, IGF-1, P DG F, and TGF _ /S.
  • the basement membrane matrix is a preferred extracellular matrix of the present invention. ⁇ 0 2020/175 594 13
  • a self-assembling peptide known as a hydrogel such as a hydrogel containing arginine, glycine and asparagine, can be used as the extracellular matrix in the present invention.
  • the composition and concentration of the extracellular matrix is determined by those skilled in the art as an extracellular matrix in which the resulting organoid is embedded (hereinafter sometimes abbreviated as "organoide-embedded matrix"). Can be appropriately adjusted so as to have an appropriate hardness.
  • An extracellular matrix in which an organoid produced from vascular endothelial cells is embedded, or an extracellular matrix in which an organoid produced from vascular endothelial cells and liver cells is embedded is, for example, the above-mentioned organoid.
  • Add an appropriate amount of extracellular matrix containing the appropriate components to the wells of the culture vessel containing the cells if necessary, further add an ionic solution or an ionic molecule for solidifying the hydrogel).
  • the organoid-embedded matrix contains organoids made from vascular endothelial cells in the step (18) and organoids made from vascular endothelial cells and liver cells in the step (1). It is preferably prepared so as to be retained in an extracellular matrix of appropriate hardness. For example, when extracellular matrix (such as Matrigel) is added to a relatively large amount of medium in which the above organoid is suspended, the hardness of the extracellular matrix becomes insufficient and the above organoid precipitates and the culture vessel Therefore, in the steps (2) and (3), the recovery rate of the culture supernatant containing the desired component may decrease.
  • extracellular matrix such as Matrigel
  • the organoid-embedded matrix of the present invention is typically an organoid prepared from vascular endothelial cells according to the so-called three-dimensional cell culture method, that is, by the procedure described above.
  • organoid in the extracellular matrix it should be solidified after mixing the single matrix of vascular endothelial cells) or an organoid made from vascular endothelial cells and liver cells with the components of the extracellular matrix. It is obtained by. Therefore, ⁇ 0 2020/175594 14 ⁇ (: 171? 2020 /007886
  • Two-dimensional coating method that is, a coating layer consisting of extracellular matrix that has been solidified to a certain degree is formed in advance in a culture vessel such as a plate well, and then organoid (or cells that constitute a single organoid) is deposited on it.
  • organoid or cells that constitute a single organoid
  • the structure in which the organoid will grow on the coating layer or in the state of migrating or settling in the coating layer over time does not correspond to the organoid-embedded matrix of the present invention.
  • an extracellular matrix was added to the vascular endothelial cells alone or to the cell mixture of vascular endothelial cells and liver cells to prepare an embedded material, and then the embedded state.
  • An embedding obtained by forming an organoid (three-dimensional structure) by culturing the cell mixture of (which can be continuously cultured as the step (2))
  • the above-mentioned method of embedding an organoid or a cell in an extracellular matrix is typically carried out by mixing the extracellular matrix (eg Matrigel) in a liquid state with an organoid or a cell at a temperature of 4° or less with stirring. Then, the cells are allowed to stand at 37 ° C or higher to solidify the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix eg Matrigel
  • the step (2) includes the extracellular matrix prepared by the step (1), in which the organoid prepared from vascular endothelial cells is embedded, or the organo matrix prepared from vascular endothelial cells and liver cells.
  • Extracellular matrix ⁇ 0 2020/175 594 15 ⁇ (: 171-1? 2020 /007886
  • the culture of the organoid-embedded matrix in the step (2) is performed by the following step (a)
  • the culture supernatant containing the desired components in the desired concentration in 3) can be collected.
  • the culturing temperature is usually 30% to 40°C, preferably about 37°C at 5% ⁇ 2 , and the culturing period is usually 10 to 50°. Is the day.
  • the culture of the organoid-embedded matrix in step (2) can be typically performed by a suspension culture method.
  • the shape, material, size (culture scale) and the like of the culture vessel are not particularly limited, and a means for culturing while stirring or shaking may be provided if necessary.
  • the culture vessel is preferably made of a material that does not allow the organoid-embedded matrix to adhere to the surface or is surface-treated.
  • a commercially available low-adsorption culture vessel Can be used.
  • the medium for the extracellular matrix embedding in step (2) is, for example, a blood coagulation factor or complement from vascular endothelium or organoid (component (3) described in the explanation of the following step (3)). ) ⁇ (I)) is promoted so that the culture supernatant containing higher concentrations of each component can be obtained in step (3), or the culture supernatant containing the desired concentrations of each component can be obtained in a shorter period of time. It is preferable to use a medium in which the components have been adjusted in consideration of making it obtainable or in consideration of the ratio of vascular endothelial cells and liver cells used in the production of organoid.
  • the medium for extracellular matrix embedding is the above-mentioned medium for vascular endothelial cells.
  • the medium for extracellular matrix embedding is an organoid medium in which the above-mentioned medium for vascular endothelial cells and the above-mentioned medium for liver cells are mixed.
  • Those skilled in the art can appropriately adjust the mixing ratio of these media so that a desired component (blood coagulation factor and/or complement) can be obtained.
  • the medium in step (2) has an appropriate serum concentration.
  • the medium is adjusted to a precise range, preferably a medium having a serum concentration of 0% (that is, a serum-free medium) to 5%. It is also possible to use a “serum substitute” as the “serum”, and in that case, the concentration range of the serum substitute can correspond to the above-mentioned concentration range of serum.
  • the medium in step (2) is N r f 2 (nuc
  • Lear factor erythroid-2-related factor 2 This is a culture medium supplemented with activvator.
  • N rf 2 activator include Ra-lipoic acid, tert-putylhydroquinone, sulforaphane, knotweed (Polygonum cuspidatum) extract containing resveratrol, BM (Bardoxo lone methyl), etc.
  • the concentration of n r f 2 act i v a t o r in the medium is preferably 20 nM or more.
  • Step (3) is a step of collecting the culture supernatant from the culture after the culturing in step (2).
  • components such as blood coagulation factors and complement secreted from vascular endothelial cells and/or liver cells are produced, and a composition for treating blood coagulation diseases and/or abnormal complement diseases is produced. Therefore, the culture supernatant containing the desired concentration can be collected.
  • the culture supernatant recovered in step (3) comprises two or more components (blood coagulation factor and/or complement) selected from the following (a) to (I). Body), preferably containing Factor VIII and one or more other components.
  • blood coagulation factor and/or complement selected from the following (a) to (I).
  • Body preferably containing Factor VIII and one or more other components.
  • Detection and quantification of blood coagulation factors and complement can be performed by a method known per se, for example, the ELISA method (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay method), and kits therefor are also commercially available.
  • Human Coagulation Factor II F2 ELIS A Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor V (F5) ELISA Kit (B i omat ik), Human Coagulation Factor VII (F7) ELISA Kit (Biomatik) N Human C oagu Lat i On Factor VIII (F8) ELISA Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor IX (F9) ELISA Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor X (F10) ELISA Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor XI (F11) ELISA Kit
  • the culture supernatant recovered in step (3) may be concentrated if necessary.
  • Concentrated culture supernatants have abnormal blood coagulation and/or complement abnormalities, for example, increased activity (shortening A PTT) based on act iv ated partial thromboplastin time (A PTT). It is preferable for use as a composition for treating diseases.
  • blood coagulation diseases include hemophilia (hemophilia 8 (factor VIII Deficiency), hemophilia B (factor IX deficiency) ), hemophilia-related diseases (factor II deficiency, factor V deficiency, factor VII deficiency, factor X deficiency, factor XI) Deficiency) and thrombosis (antithrombin deficiency).
  • hemophilia hemophilia 8 (factor VIII Deficiency)
  • hemophilia B factor IX deficiency
  • hemophilia-related diseases factor II deficiency, factor V deficiency, factor VII deficiency, factor X deficiency, factor XI) Deficiency
  • thrombosis antithrombin deficiency
  • abnormal complement diseases include complement third component deficiency, complement fifth component deficiency, factor B deficiency,
  • the culture supernatant recovered in step (3) or the concentrated culture supernatant has low toxicity (eg, acute toxicity, chronic toxicity, genotoxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, carcinogenicity), and
  • mammals eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cattle, sheep, monkeys, humans
  • toxicity eg, acute toxicity, chronic toxicity, genotoxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, carcinogenicity
  • mammals eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cattle, sheep, monkeys, humans
  • any blood coagulation factor and/or complement in the above-mentioned culture supernatant is separated by a method known per se, concentrated if necessary, and used as it is or as an additive used in a pharmaceutical product. May be added to form a formulation.
  • the content of the blood coagulation factor and/or complement in the above-mentioned preparation is appropriately determined depending on the administration subject (sex, age, body weight), administration route, disease, symptom and the like.
  • confirmation of cell markers was performed by flow cytometry, immunostaining, and/or quantitative PCR.
  • the HNF4a marker was confirmed by immunostaining and quantitative PCR.
  • the P C R primer (Fw: forward primer; Rv: reverse primer) and probe used are as follows:
  • Example 1 Preparation of an organoid using non-hematopoietic vascular endothelial cells and liver cells, and production of blood coagulation factor and complement factor from the organoid
  • 1 _ 1 Human non-hematopoietic blood vessel
  • DMEM/F-12 (Gibco) (10 ml) in 1% B-27 Supplements (GIBCO)
  • BMP4 25ng/ %
  • CHIR 99021 8 ⁇ M
  • mesoderm cells were induced by culturing at 5%C ⁇ 2 and 37 ° C for 3 days ⁇
  • Stempro-34 SFM Stempro-34 SFM (Gibco) (10 ml).
  • H EC H EC of 10: 7 cell count ratio of (total 1 were mixed at 8X 1 ⁇ 5), one day on three-dimensional culture vessel ELpLasia (Kuraray), co-cultured in 5% C_ ⁇ 2, 37 ° C By doing so, an aggregate was prepared.
  • the culture medium was HCM (Lonza) plus FBS (5 %).HGF (10 ng/ml), OSM (20 ng/ml), Dex (100 nM) and a liver cell culture medium (A).
  • Stempro-34 SFM (Gibco) mixed with VEGF (50 ng/ml) % FGF2 (10 ng/ml) for vascular endothelial cell medium (A) at a volume ratio of 1:1 2iiU of "Organoide medium (A)" in the detailed text was used.
  • HE human liver endoderm cells
  • non-HEC human non-hematopoietic vascular endothelial cells
  • Factor VIII Human Coagulation Factor VIII (F8) ELISA Kit (Biomatik) Complement C3 Human ELISA kit (Abeam);
  • H Factor Human Factor H ELISA Kit (Abeam):
  • FB Human Factor B ELISA Kit (Abeam) ⁇
  • liver cell medium (A) or the vascular endothelial cell medium (A) was used, otherwise the same as (1 _3) and (1 -4) above.
  • Production of blood coagulation factor (factor VIII) and complement factor (complement third component (C3), complement fifth component (C5), H factor (FH) and B factor (FB)) was measured.
  • Organoides obtained from mixed cell populations were used.
  • complement factor (third complement component ( ⁇ 3), fifth complement component ( ⁇ 5), and minor factor 8) contained in the culture medium (culture supernatant) on the 30th day of culture.
  • ! factor concentration ( ⁇ 0 2020/175 594 23 ⁇ (: 171? 2020/007886 The results of 06 1) are shown in the table below.
  • Organoids formed from non-hematopoietic vascular endothelial cells and liver cells embedded and cultured in Matrigel according to the present invention produce each complement factor.
  • a medium for organoids (8) The amount of production of each complement factor was high in the case of using.
  • BMP4 80 ng/ml % VEGF (80 ng/ml), CHIR 99021 (2 ⁇ M) was added to Essential 8 medium (Gibco) (8 nU), and 5% C ⁇ 2 , 37 Cultivated for 2 days in C ⁇
  • VEGF 80ng/ml
  • FGF2 25ng/ml
  • SCF 50ng/ml
  • SB 431542 2/xM
  • Stempro-34 SFM(Gibco) (8 ml) was added to VEGF (80 ng/ml), SCF (50 ng/ml), FU-3L (50 ng/ml) % IL-3 (50ng/ml) % IL-6. (50ng / ml)% TPO and (5 ng / nU) was replaced with medium was added, 5% C_ ⁇ and cultivated for 2 days at 2, 37 ° C, further to replace the medium minus VEGF from the medium of the above composition , 5% C_ ⁇ 2, 37 ° CD34 positive Rukoto be cultured for one day in C, and to obtain a hematopoietic vascular endothelial cells of CD73-negative.
  • HEC human hematopoietic vascular endothelial cells
  • Matrigel BD pharmingen
  • the cells were embedded evenly inside to prepare H EC aggregates (organoide).
  • Oruganoi Dotsutsumiuma Matrigel produced on low adsorption culture dishes (Corning) at 5% C_ ⁇ 2, 37 ° C.
  • the organoid medium (A) was used as the culture medium.
  • the following table shows the results of the concentration of factor VIII (pg/mi Uion ceUs) contained in the culture medium on the 21st day of culture.
  • a large amount of factor VIII was produced from hematopoietic vascular endothelial cells (H EC) embedded and cultured in Matrigel according to the present invention.
  • the complement factor contained in the culture solution in the culture on day 21 (complement third component ( ⁇ 3), complement fifth component (05), snake factor 8) and 1 to 1 factor)
  • the results of the concentration ( n 9/( ⁇ 1110 ⁇ 06118) are shown in the following table. From the organoids formed from hematopoietic vascular endothelial cells (1 to 1 _), which were embedded and cultured in Matrigel according to the present invention, Each complement factor was produced, and especially the amount of complement factor 3 (03) and 1-1 to 1 was high.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、血液凝固および／または補体異常疾患の治療用組成物（それらの疾患の治療薬を製造するための原料）として好適な組成物およびその効率的な製造方法を提供する。本発明に係る血液凝固および／または補体異常疾患の治療用組成物の製造方法は、以下の工程を含む：（１）血管内皮細胞、または血管内皮細胞および肝臓細胞から作製されたオルガノイド、を細胞外マトリックスに包埋する工程；（２）前記細胞外マトリックスを培養する工程；および（３）前記工程（２）で培養した培養物から培養上清を回収する工程。

Description

\¥0 2020/175594 1 ?＜：17 2020 /007886 明 細 書
発明の名称 ：
血液凝固および/または補体異常疾患の治療用組成物
技術分野
[0001 ] 本発明は、 血液凝固および/または補体異常疾患の治療用組成物の製造方 法に関する。 より詳しくは、 本発明は、 オルガノイ ドの培養により血液凝固 および/または補体異常疾患の治療用組成物を製造する方法に関する。 本発 明はまた、 このような方法により製造された血液凝固および/または補体異 常疾患の治療用組成物に関する。
[0002] [発明の背景]
血友病は、 特定の血液凝固因子、 すなわち第VIII因子 （血友病八） または 第IX因子 （血友病巳） の欠乏に起因する、 血液凝固系に関する疾患 （血液凝 固障害） の代表的なものである。 また、 上記以外の血液凝固因子 （例、 第II 因子、 第V因子、 第VII因子、 第X因子および第XI因子） の欠乏および異常によ る先天性凝固因子欠乏症も、 それぞれ血友病類縁疾患として分類されている 。 さらに、 アンチトロンビンの欠乏は、 血栓症の原因となる。 他方で、 補体 成分/因子 （補体第 3成分、 補体第 5成分、 巳因子 8） 、 1~1因子 など ） の欠乏や異常も、 様々な補体系に関する疾患の原因となる。
[0003] このような血液凝固疾患等の治療法としては、 血液凝固因子等のタンパク 質を患者に投与する方法が用いられている。 例えば、 血友病八を治療するた めに、 アデノ随伴ウイルス （八八 ） ベクターを用いてヒト第VIII因子の組 換えタンパク質を培養細胞に産生させ、 その組換えタンパク質を回収して患 者に投与する方法が行われている。 しかしながら、 このような治療法には、 八八 Vベクターを用いて培養細胞に第VIII因子を発現させることの困難さや 、 組換えタンパク質の作用を阻害する抗体が患者の体内で産生され治療効果 が低下するといった問題がある。
[0004] 非特許文献 1 には、 スライ ドに塗布したマトリゲル上で （2次元的に） （1） ヒト微小血管内皮細胞 (Microvessel endothelial cells; MVEC) と肝臓細 胞から作製されたオルガノイ ド、 (2) ヒト臍帯静脈内皮細胞 (Human umbilic al-vein endothelial cells; HUVEC) と肝臓細胞から作製されたオルガノイ ド、 (3) ラッ ト肝類洞壁内皮細胞 (Uver sinusoidal endothelial cells; L SEC) と肝臓細胞から作製されたオルガノイ ド、 および (4) ヒト臍帯静脈内皮 細胞 (HUVEC) とヒト皮膚線維芽細胞 (Normal human derma I fibroblasts; N HDF) と肝臓細胞から作製されたオルガノイ ド、 のそれぞれを培養したところ 、 血管内皮細胞のネッ トワークが上記 (2)および (3)ではやがて崩壊したが、 上記 ( 1 )および (4)では存続し、 やがて線維芽細胞のカプセルを形成してスラ イ ドから浮上したことなどが記載されている。 なお、 非特許文献 1 において は、 培養上清中に血管凝固因子および/または補体が分泌されているかは不 明であり、 少なくとも細胞上清を回収して血液凝固および/または補体異常 疾患の治療用組成物を製造するための原料として用いることに関して何も記 載されていない。
先行技術文献
非特許文献
[0005] 非特許文献 1 : TISSUE ENGINEERING, 12(6), 2006, pp.1627-1638
発明の概要
発明が解決しようとする課題
[0006] 本発明は、 血液凝固疾患および/または補体異常疾患の治療用 (それらの 疾患の治療薬を製造するための原料) として好適な組成物およびその効率的 な製造方法を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、 血管内皮細胞から作製されたオルガノイ ド、 または肝臓細 胞および血管内皮細胞から作製されたオルガノイ ドを、 マトリゲル (登録商 標) に代表される細胞外マトリックスに包埋して培養した場合に、 血液凝固 因子および/または補体因子が細胞上清中に分泌されることを見出した。 そ \¥02020/175594 3 卩（：171? 2020 /007886
して、 そのような細胞上清は、 血液凝固および/または補体異常疾患の治療 用組成物の製造にとって好適な原料として利用できることを見出し、 本発明 を完成させた。
[0008] すなわち本発明は、 上記課題解決のため、 以下の [1 ] 〜 [4] を提供す る。
[1 ]
以下の工程を含む、 血液凝固および/または補体異常疾患の治療用組成物 の製造方法：
( 1 ) 血管内皮細胞、 または
血管内皮細胞および肝臓細胞、
から作製されたオルガノイ ド、
を細胞外マトリックスに包埋する工程；
(2) 前記細胞外マトリックスを培養する工程；および
(3) 前記工程 (2) で培養した培養物から培養上清を回収する工程。
[2]
項 1記載の方法により得られた培養上清。
[3]
項 2記載の培養上清を含む、 血液凝固および/または補体異常疾患の治療 用組成物。
[4]
以下から選択される 2以上の成分を含む、 血液凝固疾患および/または補 体異常疾患の治療用組成物：
1 0X 1 0-6重量％〜 1 000X 1 0_6重量％の第II因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第V因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第VII因子、
1 X 1 0-6重量％〜 1 00X 1 0-6重量％の第VIII因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第IX因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第X因子、 \¥02020/175594 4 卩（：171? 2020 /007886
〇. 01 X 1 0_6重量％〜 1 X 1 0_6重量％の第 XI因子、
1 X 1 0_6重量％〜 1 00X 1 0- 6重量％のアンチトロンビン、
1 0X 1 0-6重量％〜 · I 000X 1 0-6重量％の補体第 3成分 （〇3） 、 1 0X 1 0-6重量％〜 · I 00 X I 0-6重量％の補体第 5成分 （〇5） 、 1 0X 1 0_6重量％〜 1 00X 1 0_6重量％の巳因子 （ 巳） 、 および 1 00X 1 0-6重量％〜 1 000X 1 0-6重量％の|~|因子 （ 1~1） 。
発明の効果
[0009] 本発明により、 血管内皮細胞から作製されたオルガノイ ド、 または血管内 皮細胞および肝臓細胞から作製されたオルガノイ ドを細胞外マトリックスに 包埋することによって、 血液凝固疾患および/または補体異常疾患の治療用 組成物 （または、 それらの疾患の治療薬の原料） として好適な培養上清を得 ることができる。 本発明では上記オルガノイ ドの培養を続けることで、 一度 きりではなく、 繰り返し培養上清から上記治療用組成物を得ることが出来る ので、 上記治療用組成物を大量生産した際の製造工程の効率化と費用削減が 期待できる。
発明を実施するための形態
[0010] _定義一
本明細書において、 「マーカー」 とは、 「マーカータンパク質」 、 「マー 力一遺伝子」 など、 所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はそ の遺伝子を意味する。 好ましくは、 マーカーは細胞表面マーカーであり、 そ の場合、 生存細胞の濃縮、 単離、 及び/又は検出が実施可能となる。 マーカ —は、 陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
[0011] マーカータンパク質の検出は、 当該分野で公知の、 対象とするマーカータ ンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、 例えば、
Figure imgf000006_0001
免疫染 色、 フローサイ トメ トリーを利用して行うことができる。 マーカー遺伝子の 検出は、 当該分野で公知の核酸増幅方法及び/又は核酸検出方法、 例えば、 丁 0（¾ （定量的
Figure imgf000006_0002
を含む） 、 マイクロアレイ、 バイオチップ等を利用して行 うことができる。 [0012] 本明細書において、 マーカーが 「陽性」 とは、 タンパク質又は遺伝子が、 上記当該分野で公知の手法による検出可能量 （またはバックグラウンドの強 度よりも高い量） で発現していることを意味する。
[0013] 本明細書において、 マーカーが 「陰性」 とは、 タンパク質又は遺伝子の発 現量が、 上記当該分野で公知の手法の全てあるいはいずれかによる検出下限 値未満 （またはバックグラウンドよりも低い量） であることを意味する。 夕 ンパク質又は遺伝子の発現の検出下限値は、 各手法により異なりえる。
[0014] _製造方法—
本発明の血液凝固疾患および/または補体異常疾患の治療用組成物の製造 方法は、 下記 （1） 〜 （3） の工程を含む：
（ 1） 血管内皮細胞、 または
血管内皮細胞および肝臓細胞、
から作製されたオルガノイ ド、
を細胞外マトリックスに包埋する工程；
（2） 前記細胞外マトリックスを培養する工程；および
（3） 前記工程 （2） で培養した培養物から培養上清を回収する工程。
[0015] 工程 （ 1）
本発明の一実施形態において、 工程 （1） は、 血管内皮細胞から作製され たオルガノイ ドを細胞外マトリックスに包埋する工程 （ 1 A） である。 本発 明の一実施形態において、 工程 （1） は、 血管内皮細胞および肝臓細胞から 作製されたオルガノイ ドを細胞外マトリックスに包埋する工程 （ 1 B） であ る。
[0016] 血管内皮細胞
本発明における血管内皮細胞は、 造血性血管内皮細胞 （hemogen i c endothe I i a I ce l l ; H E C） および非造血性血管内皮細胞 （non-hemogen i c endothe l i a l ce l l ; n o n— H E C） の両方の概念を包含する用語である。 H E Cは 、 造血幹細胞を産生することのできる （造血能を有する） 血管内皮細胞であ り、 血球産生型血管内皮細胞とも呼ばれる。 本発明では血管内皮細胞として 、 H E Cまたは n〇 n— H E Cのいずれか一方のみを用いてもよいし、 H E Cおよび n〇 n _ H E Cの両方を用いてもよいし、 それらの前駆細胞 (後述 ) を用いてもよいし、 あるいは H EC、 n o n -H EC、 およびそれらの前 駆細胞の任意の組み合わせを用いてもよい。
[0017] —つの実施形態では、 血管内皮細胞として n〇 n _H ECのみを用いる場 合は、 肝臓細胞と組み合わせること、 すなわち工程 (1 B) の実施形態によ り本発明を実施する。
[0018] 本明細書において 「造血性血管内皮細胞 (H EC) 」 とは、 CD34陽性かつ C D73陰性の造血能を有する血管内皮細胞を意味する。 また、 本発明に用いられ る H ECは、 その前駆細胞を含んでいてもよい。 このような前駆細胞として は、 代表的には、 Flk-1 (CD309、 KDR) 陽性の血管内皮細胞の前駆細胞 (例、 側板中胚葉系細胞) から H EC細胞までの分化過程に存在する細胞が挙げら れる (Cell Reports 2, 553-567, 2012参照) 。
[0019] Flk-1 (CD309、 KDR) 陽性のような分化早期の段階の前駆細胞は、 H EC細 胞と n〇 n _ H E C細胞で共通する前駆細胞であり、 特に述べない限り、 「 H E C前駆細胞」 は、 H E C細胞と n〇 n -H E C細胞で共通する前駆細胞 も含む。
[0020] 本明細書において 「非造血性血管内皮細胞 (n o n _H EC) 」 とは、 CD3 1、 CD73および CD144が陽性であり、 造血能を有しない血管内皮細胞を意味す る。 また、 本発明に用いられる n〇 n— H E Cは、 その前駆細胞を含んでい てもよい。 このような前駆細胞としては、 代表的には、 Flk-1 (CD309、 KDR) 陽性の血管内皮細胞の前駆細胞 (例、 側板中胚葉系細胞) から n o n _H E C細胞までの分化過程に存在する細胞が挙げられる (CeU Reports 2, 553-5 67, 2012参照) 。
[0021] Flk-1 (CD309、 KDR) 陽性のような分化早期の段階の前駆細胞は、 H EC細 胞と n〇 n _ H E C細胞で共通する前駆細胞であり、 特に述べない限り、 「 n〇 n -H E C前駆細胞」 は、 H E C細胞と n〇 n -H E C細胞で共通する 前駆細胞も含む。 [0022] 本発明に用いられる血管内皮細胞は、 生体から採取された血管内皮細胞 （ 例えば、 微小血管内皮細胞 （microvessel endothelial cells: MVEC） 、 肝類 洞壁内皮細胞 （liver sinusoidal endothelial cells: LSEC） 、 臍帯静脈内 皮細胞 （umbi lical-vein endothelial cells: UVEC） など） の純度の高い細 胞集団であってもよいし、 ES細胞や i PS細胞等の多能性幹細胞、 その他 の血管内皮細胞へ分化する能力を有する細胞を分化させて得られた血管内皮 細胞の純度の高い細胞集団であってもよい。 上記血管内皮細胞の純度の高い 細胞集団は、 細胞集団中の細胞総数に対して、 70%以上、 80 %以上、 9 0%以上、 95 %以上、 または 99 %以上の血管内皮細胞を含む。
[0023] 本発明に用いられる造血性血管内皮細胞 （H EC） は、 生体から採取され た H ECの純度の高い細胞集団であってもよいし、 ES細胞や i PS細胞等 の多能性幹細胞、 その他の血管内皮細胞へ分化する能力を有する細胞 （例え ば、 側板中胚葉系細胞） を分化させて得られた H ECの純度の高い細胞集団 であってもよい。 上記 H ECの純度の高い細胞集団は、 細胞集団中の細胞総 数に対して、 70 %以上、 80 %以上、 90 %以上、 95 %以上、 99 %以 上の H ECおよび/または H EC前駆細胞を含む。
[0024] ES細胞や i PS細胞等の多能性幹細胞、 その他の血管内皮細胞へ分化す る能力を有する細胞を、 造血性血管内皮細胞 （H EC） へ分化させる方法は 公知であり、 例えば、 i PS細胞からは、 PLoS One, 2013; 8（4）: e59243、 N at Biotechnol. 2014; 32（6）: 554-61、 Sci Rep. 2016; 6: 35680などに記載 の方法に準じて行うことができる。
[0025] 一つの実施形態では、 上記 H ECの純度の高い細胞集団は、 細胞集団中の 細胞総数に対して、 70 %以上、 80 %以上、 90 %以上、 95 %以上、 9 9%以上の H ECを含む。
[0026] 本発明に用いられる非造血性血管内皮細胞 （n o n _H EC） は、 生体か ら採取された n〇 n - H E Cの純度の高い細胞集団であってもよいし、 E S 細胞や i PS細胞等の多能性幹細胞、 その他の血管内皮細胞へ分化する能力 を有する細胞 （例えば、 側板中胚葉系細胞） を分化させて得られた n〇 n _ H E Cの純度の高い細胞集団であってもよい。 上記 n〇 n - H E Cの純度の 高い細胞集団は、 細胞集団中の細胞総数に対して、 70%以上、 80%以上 、 90 %以上、 95 %以上、 または99%以上のn o n _H ECおよび/ま たは n〇 n _ H E C前駆細胞を含む。
[0027] ES細胞や i PS細胞等の多能性幹細胞、 その他の血管内皮細胞へ分化す る能力を有する細胞を、 非造血性血管内皮細胞 （n o n _H EC） へ分化さ せる方法は公知であり、 例えば、 i PS細胞から、 Nat Cell Biol. 2015; 17 （8）: 994-1003、 Cell Rep. 2017; 21（10）: 2661 -2670などに記載の方法に準 じて行うことができる。
[0028] 一つの実施形態では、 上記 n〇 n _ H E Cの純度の高い細胞集団は、 細胞 集団中の細胞総数に対して、 70%以上、 80%以上、 90%以上、 95% 以上、 または 99 %以上の n〇 n -H ECを含む。
[0029] 肝臓細胞
本発明、 特に工程 （1 B） における 「肝臓細胞」 は、 分化した肝臓細胞 （ 分化肝臓細胞） と、 肝臓細胞への分化運命が決定しているがまだ肝臓細胞へ 分化していない細胞 （未分化肝臓細胞） 、 いわゆる肝前駆細胞 （例、 肝臓内 胚葉細胞） の両方の概念を包含する用語である。 分化肝臓細胞は、 生体から 採取された （生体内の肝臓から単離された） 細胞であってもよいし、 ES細 胞や i PS細胞等の多能性幹細胞、 肝前駆細胞、 その他の肝臓細胞へ分化す る能力を有する細胞を分化させて得られた細胞であってもよい。 未分化肝臓 細胞は、 生体から採取されたものであってもよいし、 ES細胞や i PS細胞 等の多能性幹細胞、 その他の幹細胞または前駆細胞を分化させて得られたも のであってもよい。 肝臓細胞に分化可能な細胞は、 例えば、 K.Si-Taiyeb, et a 1. Hepatology, 51 （1）: 297 - 305（2010）、 T. Touboul, et al. Hepato log y. 51（5）:1754-65.（2010）に従って作製することができる。 生体から採取した 細胞集団、 ES細胞や i PS細胞等の分化誘導により作製した細胞集団、 い ずれについても （特に後者については） 、 分化肝臓細胞の純度の高い細胞集 団または未分化肝臓細胞の純度の高い細胞集団を用いてもよいし、 分化肝臓 細胞および未分化肝臓細胞を任意の割合で含む細胞混合物を用いてもよい。
[0030] ES細胞や i PS細胞等の多能性幹細胞、 肝前駆細胞、 その他の肝臓細胞 へ分化する能力を有する細胞を、 肝臓細胞へ分化させる方法は公知であり、 例えば、 i PS細胞からは、 Hepatology, 2010; 51（1）: 297-305、 Cell Rep. 2017; 21（10）: 2661-2670などに記載の方法に準じて行うことができる。
[0031 ] ある細胞が分化肝臓細胞であるかどうかは、 成熟肝細胞マーカーであるア シアログリコプロテインレセプター1 （ASGR 1） 、 未成熟肝細胞マーカー （初期肝分化マーカー） である aフエトプロテイン （A F P） 、 初期肝分化 マーカーであるアルブミン （AL B） 、 レチノール結合プロテイン （R B P 4） 、 トランスチレチン （TT R） 、 グルコース _ 6—ホスファターゼ （G 6 PC） などの 1種または 2種以上のタンパク質または m R N Aの発現が陽 性かどうかにより判別することができる。
[0032] ある細胞が未分化肝臓細胞であるかどうかは、 H H EX、 S0X2、 H N
F4 a、 A F P、 A L Bなどのマーカータンパク質の発現が陽性かどうかに より判別することができる。
[0033] -オルガノイ ド （三次元構造体）
上記工程 （1 A） で使用されるオルガノイ ドは、 血管内皮細胞のみから作 製された三次元構造体である。 上記工程 （1 B） で使用されるオルガノイ ド は、 血管内皮細胞および肝臓細胞から作製された三次元構造体であり、 肝臓 細胞間に血管内皮細胞からなる脈管のネッ トワークを有することを特徴とす る。 これらのオルガノイ ドは、 一般的には、 自体公知の三次元培養法 （例え ば、 Nature Cell Biology 18, 246-254 （2016）） により作製される。 あるい は、 後述するようにあらかじめ細胞外マトリックスに単体の細胞を包埋させ た状態で培養することにより三次元構造を形成させて、 オルガノイ ドを作製 するような三次元培養も可能である。
[0034] 上記工程 （1 B） で使用されるオルガノイ ドを作製するための血管内皮細 胞および肝臓細胞の細胞数の比率は、 例えば工程 （3） において回収する培 養上清に含まれる成分が所望のものとなるようにするなどの観点から、 適切 な範囲で調整することができる。 本発明の一実施形態において、 血管内皮細 胞および肝臓細胞の細胞数の比率 (血管内皮細胞：肝臓細胞) は、 代表的に は 1 : 0. 1〜 5、 好ましくは 1 : 0. 1〜 2である。
[0035] オルガノイ ドを作製する際は、 血管内皮細胞用の培地と肝臓細胞用の培地
(培養液) とを適切な割合で (例えば 1 : 1で) 混合したオルガノイ ド用培 地が用いられる。
[0036] 血管内皮細胞用の培地としては、 例えば、 DMEM/F-12 (Gibco) 、 Stempro-3 4 SFM (Gibco)、 Essential 6培地 (Gibco) 、 Essential 8培地 (Gibco) 、 EG M (Lonza) 、 Bu l letKi t (Lonza) 、 EGM-2 (Lonza) 、 Bu l letKi t (Lonza) 、 E GM-2 MV (Lonza) 、 VascuLife EnGS Comp Kit (LCT) 、 Human Endothe l i a l-S FM Basal Growth Medium (Invitrogen) 、 ヒト微小血管内皮細胞増殖培地 (T 0Y0B0) などが挙げられる。
[0037] 血管内皮細胞用の培地は、 B27 Supplements (GIBCO) 、 BMP4 (骨形成因子 4) 、 GSK/S阻害剤 (例、 CHIR99021) 、 VEGF (血管内皮細胞成長因子) 、 FGF 2 (Fibroblast Growth Factor (bFGF (basic fibroblast growth factor) と もいう) ) 、 Folskolin, SCF (Stem Cell Factor) 、 TGF/S受容体阻害剤 (例 、 SB 431542) 、 F lt-3L (Fms-re lated tyrosine kinase 3 ligand) % IL-3 (I nterleukin 3) 、 IL-6 (Interleukin 6) , TPO (トロンボポイエチン) 、 hEG F (組換えヒト上皮細胞成長因子) 、 ヒドロコルチゾン、 アスコルビン酸、 IG F1、 FBS (ウシ胎児血清) 、 抗生物質 (例えば、 ゲンタマイシン、 アンフォテ リシン B) 、 へパリン、 L—グルタミン、 フエノールレッ ド、 BBEなどから選 ばれる 1種以上の添加物を含んでいてもよい。 これら添加物の添加量は、 当 業者であれば、 血管内皮細胞を培養するための通常の培養条件を参考にして 適宜決定することができる。
[0038] 肝臓細胞用の培地としては、 例えば、 RPMI (富士フイルム) 、 HCM (Lonza ) などが挙げられる。
[0039] 肝臓細胞用の培地は、 Wnt3a、 アクチビン A、 BMP4、 FGF2、 FBS (ウシ胎児 血清) 、 H G F (肝細胞増殖因子) 、 オンコスタチン M (0SM) 、 デキサメタ ゾン (Dex) 、 などから選ばれる 1種以上の添加物を含んでいてもよい。 これ ら添加物の添加量は、 当業者であれば、 肝臓細胞を培養するための通常の培 養条件を参考にして適宜決定することができる。
[0040] あるいは、 肝臓細胞用の培地として、 アスコルビン酸、 BSA— FA F、 インスリン、 ヒドロコルチゾンおよび GA— 1 000から選ばれる少なくと も 1種を含む肝臓細胞用の培地、 HCM BulletKit (Lonza) から hEGF (組換え ヒト上皮細胞成長因子) を除いたもの、 RPMI1640 (Sigma-Aldrich) に 1% B27 Supplements (GIBC0) と 10ng/mL hHGF (Sigma-Aldrich) を添加した培地、 G M Bu I letKi t (Lonza) と HCM Bu l letKi t (Lonza) より hEGF (組換えヒト上皮 細胞成長因子) を除いたものを 1 : 1で混ぜたものに、 デキサメタゾン、 才 ンコスタチン Mおよび HGFを添加した培地などを用いてもよい。
[0041] オルガノイ ドの作製において、 培養条件は、 通常、 5%C〇2にて培養温度 は 30〜 40°C、 好ましくは約 37 °Cであり、 培養期間は、 通常 1〜 2日で ある。
[0042] オルガノイ ドの作製に用いる容器は、 作製するオルガノイ ドのサイズに応 じて適宜選択できる。 このような培養容器としては、 例えば、 WO2014/ 199622 に記載されるような、 相当直径が 20 Mm以上 2. 5 mm以下、 深さが 20 Mm以上 1 00 Oym以下の培養容器や、 市販の培養容器 (E Ip Iasi a (クラ レ) ) が好ましく用いられる。 さらに、 培養容器としては、 オルガノイ ドが 表面に付着しないような材質で作製されているまたは表面処理がされている ものが好ましい。
[0043] 上記工程 (1 B) で使用されるオルガノイ ドの形成は、 以下の方法の 1以上 により判別することができる ：
(i) 形状 (例、 三次元構造の存在) ；
( i i ) 培養上清中のアルブミンの存在；
(Mi) 肝細胞マーカー (例、 AFP、 ALB、 HNF4a) 陽性。
[0044] なお、 本発明では、 オルガノイ ドの作製において 「間葉系細胞」 を用いな い。 ここで、 「間葉系細胞」 は、 主として中胚葉に由来する結合組織に存在 し、 組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合組織細胞を指し、 分化し た細胞 （分化間葉系細胞） と、 間葉系細胞への分化運命が決定しているがま だ間葉系細胞へ分化していない細胞 （未分化間葉系細胞） 、 いわゆる間葉系 幹細胞の両方の概念を包含する用語である。 当業者間で使用されている、 mes enchyma I stem cells、 mesenchymal progenitor cells、 mesenchymal cells （R. Peters, et al. PLoS One. 30;5（12） :e15689.（2010）） などの用語が指 す対象は、 本明細書における 「間葉系細胞」 に相当する。 ただし、 「血管内 皮細胞」 は未分化間葉系細胞から分化した細胞の一種であるが、 本明細書に おける 「間葉系細胞」 の定義から除外されるものとする。 すなわち、 本発明 では、 オルガノイ ド作製工程において 「未分化間葉系細胞」 も、 血管内皮細 胞を除外した 「分化間葉系細胞」 も用いられない。
[0045] ある細胞が未分化間葉系細胞であるか分化間葉系細胞であるかは、 例えば 、 未分化間葉系細胞のマーカーである、 S t r o-1、 CD 29、 CD44、 CD 73、 CD 90、 CD 1 05、 CD 1 33、 CD 27 1、 N e s t i n などの 1種または 2種以上のタンパク質または m R N Aの発現が陽性かどう かにより （陽性であれば未分化間葉系細胞、 陰性であれば分化間葉系細胞と ） 判別することができる。
[0046] 細胞外マトリックス
本発明における細胞外マトリックスとしては、 室温以上で固体であり、 細 胞培養、 特に三次元細胞培養に用いられている一般的なものを用いることが できる。 細胞外マトリックスは、 繊維状タンパク質とプロテオグリカンを主 成分としており、 そのような成分としては例えば、 エラスチン、 エンタクチ ン、 オステオネクチン、 コラーゲン、 テネイシン、 トロンボスポンジン、 パ —ルカン、 ビトロネクチン、 フィプリリン、 フィブロネクチン、 へパリン （ 硫酸塩） 、 ラミニンなどが挙げられる。 商品名 「マトリゲル」 （Corning） と して知られている、 ラミニン、 コラーゲン 丨 Vおよびエンタクチンを含有し 、 EG F、 I G F— 1、 P DG F、 T G F _ /Sなどの増殖因子も併せて含有 している基底膜マトリックスは、 本発明における好ましい細胞外マトリック \¥0 2020/175594 13 卩（：171? 2020 /007886
スの一例である。 また、 ハイ ドロゲルとして知られている自己組織化べプチ ド、 例えばアルギニン、 グリシンおよびアスパラギンを含むハイ ドロゲルな ども、 本発明における細胞外マトリックスとして用いることができる。 細胞 外マトリックスの組成や濃度 （原液か、 希釈物か） は、 当業者であれば、 得 られるオルガノイ ドが包埋された細胞外マトリックス （ 「オルガノイ ド包埋 マトリックス」 と略記する場合がある） が適度な硬さを有するものとなるよ う、 適宜調整することができる。
[0047] 血管内皮細胞から作製されたオルガノイ ドが包埋された細胞外マトリック ス、 または血管内皮細胞および肝臓細胞から作製されたオルガノイ ドが包埋 された細胞外マトリックスは、 例えば、 上記オルガノイ ドを収容した培養容 器のウエルに、 適切な成分を含有する適量の細胞外マトリックスを添加する こと （必要に応じてさらに、 ハイ ドロゲルを固化させるためのイオン性溶液 またはイオン性分子を添加すること） により作製することができる。
[0048] オルガノイ ド包埋マトリックスは、 工程 （1 八） においては血管内皮細胞 から作製されたオルガノイ ドが、 工程 （1 巳） においては血管内皮細胞およ び肝臓細胞から作製されたオルガノイ ドが、 適度な固さの細胞外マトリック ス内に保持されるように調製することが好ましい。 例えば、 上記オルガノイ ドが懸濁している比較的多量の培地に細胞外マトリックス （マトリゲル等） を添加した場合などは、 細胞外マトリックスの固さが十分でなくなり、 上記 オルガノイ ドが沈降して培養容器に付着しやすくなるため、 工程 （2） およ び （3） において、 所望の成分を含有する培養上清の回収率が低下するおそ れがある。
[0049] なお、 本発明におけるオルガノイ ド包埋マトリックスは、 典型的には、 い わゆる三次元細胞培養法に準じて、 つまり前述したような手順により、 血管 内皮細胞から作製されたオルガノイ ド （もしくは、 細胞外マトリックス中で オルガノイ ドを形成させる場合は、 単体の血管内皮細胞） 、 または血管内皮 細胞および肝臓細胞から作製されたオルガノイ ドと、 細胞外マトリックスの 成分とを混合した後に固化させることにより得られるものである。 従って、 \¥0 2020/175594 14 卩（：171? 2020 /007886
二次元コーティング法、 すなわちプレートウエル等の培養容器にあらかじめ —定程度固化した細胞外マトリックスからなるコーティング層を形成してお き、 その上にオルガノイ ド （または単体のオルガノイ ドを構成する細胞） を 播種することにより、 オルガノイ ドがコーティング層上で、 または経時的に コーティング層内に遊走または沈降した状態で生育することになる構造物は 、 本発明におけるオルガノイ ド包埋マトリックスには該当しない。
[0050] —方で、 工程 （1） の実施形態においては、
（_|） 血管内皮細胞のみ、 または血管内皮細胞および肝臓細胞から、 オルガノ イ ドを作製した後、 そのオルガノイ ドを単離して細胞外マトリックスと混合 して得られた包埋物、
（ 1 1） 三次元培養により血管内皮細胞のみから、 または血管内皮細胞および 肝臓細胞から、 オルガノイ ドを作製した後、 そのオルガノイ ドをマトリック スと混合して得られた包埋物、 および
あらかじめ、 三次元細胞培養法に準じて、 血管内皮細胞のみ、 または 血管内皮細胞および肝臓細胞の細胞混合物に、 細胞外マトリックスを添加す ることにより包埋物を作製した後、 包埋された状態の細胞混合物を培養する ことによってオルガノイ ド （三次元構造） を形成することにより得られた包 埋物 （そのまま引き続き工程 （2） としての培養を連続的に行うことが可能 なもの） 、
のいずれも本発明におけるオルガノイ ド包埋マトリックスに該当する。
[0051 ] 上記オルガノイ ドや細胞を細胞外マトリックスへ包埋する方法は、 代表的 には、 4°〇以下で液体状態の細胞外マトリックス （例、 マトリゲル） とオルガ ノイ ドまたは細胞を攪拌混合した後、 3 7 °〇以上で静置して細胞外マトリッ クスを固化させることにより行われる。
[0052] 工程 （ 2）
工程 （2） は、 工程 （1） において調製した、 血管内皮細胞から作製され たオルガノイ ドが包埋された細胞外マトリックス、 または血管内皮細胞およ び肝臓細胞から作製されたオルガノイ ドが包埋された細胞外マトリックス （ \¥0 2020/175594 15 卩（：171? 2020 /007886
オルガノイ ド包埋マトリックス） を培養する工程である。
[0053] 工程 （2） におけるオルガノイ ド包埋マトリックスの培養は、 次の工程 （
3） において所望の成分を所望の濃度で含有する培養上清を回収できるよう 、 適切な条件で行えばよい。 例えば、 工程 （2） において、 培養温度は、 通 常、 5 %〇〇2にて3 0 ~ 4 0 °〇、 好ましくは約 3 7 °〇であり、 培養期間は、 通常 1 〇〜 5 0日である。
[0054] 本発明において、 工程 （2） におけるオルガノイ ド包埋マトリックスの培 養は、 代表的には、 浮遊培養法により行うことができる。
[0055] 培養容器の形状、 材質、 サイズ （培養スケール） 等は特に限定されるもの ではなく、 必要に応じて撹拌や振盪をしながら培養するための手段を備えて いてもよい。 培養容器は、 オルガノイ ド包埋マトリックスが表面に付着しな いような材質で作製されているまたは表面処理がされているものが好ましく 、 例えば、 市販の低吸着培養容器
Figure imgf000017_0001
を用いることができる。
[0056] 工程 （2） における細胞外マトリックス包埋物の培地は、 例えば、 血管内 皮細胞またはオルガノイ ドからの血液凝固因子または補体 （次の工程 （3） の説明において記載する成分 （3） 〜 （ I） ） の分泌を促進し、 工程 （3） においてより高濃度の各成分を含む培養上清が得られるよう、 またはより短 期間で所望の濃度の各成分を含む培養上清が得られるようにすることを考慮 して、 あるいはオルガノイ ドの作製に用いた血管内皮細胞および肝臓細胞の 比率を考慮して、 成分が調整された培地を用いることが好ましい。
[0057] 本発明の一実施形態において、 細胞外マトリックス包埋物の培地は、 上記 血管内皮細胞用の培地が用いられる。
[0058] 本発明の別の実施形態において、 細胞外マトリックス包埋物の培地は、 上 記血管内皮細胞用の培地と、 上記肝臓細胞用の培地とを混合したオルガノイ ド用培地が用いられる。 当業者であれば、 所望の成分 （血液凝固因子および /または補体） が得られるように、 これらの培地の混合割合を適宜調整する ことができる。
[0059] 本発明の一実施形態において、 工程 （2） における培地は、 血清濃度が適 切な範囲に調整されたもの、 好ましくは血清濃度が〇% （つまり血清無添加 の培地） 〜 5 %の培地である。 なお、 「血清」 としては 「血清代替品」 を用 いることも可能であり、 その場合の血清代替品の濃度範囲は、 上記の血清の 濃度範囲に対応したものとすることができる。
[0060] 本発明の一実施形態において、 工程 （2） における培地は、 N r f 2 （nuc
Lear factor erythroid-2-related factor 2） a c t i v a t o rが添加さ れた培地である。 N r f 2 a c t i v a t o rとしては、 例えば、 R-a —リポ酸、 tert-プチルヒドロキノン、 スルホラフアン、 レスべラトロールを 含有しているイタドリ （Polygonum cuspidatum） 抽出物、 BM （バルドキソ ロンメチル （Bardoxo lone methyl） ） などが挙げられる。 これら添加物の添 加量は、 当業者であれば、 血管内皮細胞や肝臓細胞を培養するための通常の 培養条件を参考にして適宜決定することができる。 本実施形態において、 培 地中の n r f 2 a c t i v a t o rの濃度は、 好ましくは 20 n M以上で ある。
[0061] 工程 （3）
工程 （3） は、 工程 （2） における培養後の培養物から培養上清を回収す る工程である。 この工程 （3） により、 血管内皮細胞および/または肝臓細 胞から分泌された血液凝固因子、 補体等の成分を、 血液凝固疾患および/ま たは補体異常疾患の治療用組成物を製造するために好ましい濃度で含む培養 上清を回収することができる。
[0062] 本発明の一実施形態において、 工程 （3） により回収される培養上清は、 下記 （a） 〜 （ I） から選択される 2以上の成分 （血液凝固因子および/ま たは補体） 、 好ましくは第 VIII因子とその他の 1以上の成分とを含む。
（a） 1 0X 1 0-6重量％〜 1 000X 1 0_6重量％の第 II因子；
（b） 0. 1 X 1 0-6重量％〜 1 0 X 1 0-6重量％の第 V因子；
（c） 0. 1 X 1 0-6重量％〜 1 0 X 1 0-6重量％の第 VII因子；
（d） 1 X 1 0-6重量％〜 1 00X 1 0-6重量％の第 VIII因子；
（e） 0. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第 IX因子； (f ) 0. 1 X 1 0-6重量％〜 1 0 X 1 0-6重量％の第 X因子；
(g) 0. 01 X 1 0-6重量％〜 1 X 1 0-6重量％の第 XI因子；
( h ) 1 X 1 0-6重量％〜 1 00X 1 0-6重量％のアンチトロンビン；
( i ) 1 0X 1 0-6重量％〜 · | 〇〇〇x i 0-6重量％の補体第 3成分 (C 3
) ;
( j ) 1 0X 1 0-6重量％〜 1 00X 1 0-6重量％の補体第 5成分 (C5)
(k) 1 0 X 1 0-6重量％〜 1 00 X 1 0-6重量％の B因子 (F B) ;およ び
( I ) 1 00X 1 0- 6重量％〜 1 000X 1 0 -6重量％の H因子 (F H) 。
[0063] 血液凝固因子および補体の検出や定量は、 自体公知の方法、 例えば、 ELISA 法 (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay法)により行うことができ、 そのた めのキッ トも市販されている [例、 Human Coagulation Factor II (F2) ELIS A Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor V (F5) ELISA Kit (B i omat i k) 、 Human Coagulation Factor VII (F7) ELISA Kit (Biomatik) N Human C oagu Lat i on Factor VIII (F8) ELISA Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor IX (F9) ELISA Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor X (F10 ) ELISA Kit (Biomatik) N Human Coagulation Factor XI (F11 ) ELISA Kit
(Biomatik) N High Sensitive Human Albumin (ALB) ELISA Kit (Biomatik ) 、 (C3) : Complement C3 Human ELISA kit (Abeam) 、 (C5) : Comp Lemen t C5 Human ELISA ki t (Abeam) N Human Factor H ELISA Ki t (Abeam) N Hum an Factor B ELISA Kit (Abeam) ] 0
[0064] 工程 (3) により回収された培養上清は、 必要に応じて濃縮してもよい。
濃縮された培養上清は、 例えば、 活性化部分トロンボプラスチン時間 (act iv ated partial thromboplastin time : A PTT) に基づく活性が上昇する ( A PTTを短縮化する) など、 血液凝固および/または補体異常疾患の治療 用組成物としての用途に好ましいものとなる。
[0065] ここで、 血液凝固疾患の具体例としては、 血友病 （血友病八 （第 VIII因子 欠損症） 、 血友病 B （第 IX因子欠損症） ） 、 血友病類縁疾患 （第 II因子欠損 症、 第 V因子欠損症、 第 VII因子欠損症、 第 X因子欠損症、 第 XI因子欠損症） 、 血栓症 （アンチトロンビン欠損症） が挙げられる。 また、 補体異常疾患の具 体例としては、 補体第 3成分欠損症、 補体第 5成分欠損症、 B因子欠損症、
H因子欠損症が挙げられる。
[0066] 工程 （3） により回収された培養上清や濃縮された培養上清は、 毒性 （例 、 急性毒性、 慢性毒性、 遺伝毒性、 生殖毒性、 心毒性、 癌原性） が低く、 そ のままで、 または医薬品に用いられる添加剤を加えて製剤化することにより 、 哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 ウサギ、 ネコ、 イヌ、 ウシ、 ヒツジ、 サル、 ヒト） に対して、 安全に投与 （代表的には、 非経口投 与） することができる。
[0067] あるいは、 上記培養上清中の任意の血液凝固因子および/または補体を、 自体公知の方法で分離し、 必要に応じて濃縮して、 そのままで、 または医薬 品に用いられる添加剤を加えて製剤化してもよい。
[0068] 上記製剤中の血液凝固因子および/または補体の含有量は、 投与対象 （性 別、 年齢、 体重） 、 投与ルート、 疾患、 症状などにより適宜決定される。
[0069] 以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、 これによって本 発明が限定されるものではない。
実施例
[0070] 以下の実施例において、 細胞マーカーの確認は、 フローサイ トメ トリー、 免疫染色、 および/または定量的 P C Rにより行った。
[0071 ] （CD31、 CD34、 CD73および CD144マーカーの確認）
CD31、 CD34、 CD73および CD 144マーカーの確認は、 細胞を、 蛍光標識済み抗 CD31抗体 （FITC Mouse ant i -Human CD31、 BD Pharm i ngen） 、 抗 CD34抗体（APC ant i -human CD34 Ant i body、 B i oLegend）、 抗 CD73抗体（CD73-PE, human、 M i It eny i B i otecもしくは CD73-APC, human、 M i Iteny i B i otec）、 および抗 CD144抗 体 （PE Mouse ant i -Human CD144、 BD Pharm i ngen） と反応させた後、 フロー サイ トメ トリー （FACS Fortessa （BD） ） により行った。 マーカー陰性サンプ ルとしては、 未分化ヒト iPS細胞 （1383D2 ;京都大学 iPS研究所） を用いた。 また、 標識抗体と同じアイソタイプで目的マーカーを認識しない抗体を反応 させたネガテイブコントロールを作製した。
[0072] （HNF4aマーカーの確認）
HNF4aマーカーの確認は、 免疫染色と定量的 P C Rにより行った。
[0073] （免疫染色法）
細胞を、 P B S中 4 %パラホルムアルデヒド （P F A） で室温にて 1 5分 固定し、 ロバおよびヤギ血清でブロッキングを行った後、 抗 HNF4a抗体 （san ta-cruz） とこの抗体に結合する虽光標識二次抗体 （Novex Donkey anti -Goat IgG （H+L） Secondary Ant i body （invitrogen） ） を用いて免疫染色したのち 、 蛍光顕微鏡により確認した。
[0074] （定量的 P C R）
PureLink RNA Mini Kit （invitrogen） を用いて、 細胞から RNAを抽出し、 H igh-Capaci ty cDNA Reverse Transcription Kit （invitrogen） を用いて cDN Aを合成した。 THUNDERBIRD Probe qPCR Mix （T0Y0B0）及び QuantStud i o 7Flex リアルタイム PCRシステム （Applied Biosystems） を用い、 定量的 P C Rを 実施した。 用いた P C Rプライマー （Fw:フォワードプライマー； Rv : リバー スプライマー） 及びプローブは、 以下のとおり ：
HNF4a
Fw 5’ -TCAGACCCTGAGCCACCT-3’ （配列番号： 1 ）
Rv 5’ -AGCAACGGACAGATGTGTGA-3’ （配列番号： 2）
プローブ； Universal ProbeL i brary Probe 027 （Roche）
AFP
Fw 5’ -TCCTTGTAAGTGGCTTCTTGAAC-3’ （配列番号： 3）
Rv 5’ -TGTACTGCAGAGATAAGTTTAGCTGAC-3’ （配列番号： 4）
プローブ； Universal ProbeL i brary Probe 061 （Roche）
ALB
Fw 5’ -CTTCCCTTCATCCCGAAGTT-3’ （配列番号： 5） Rv 5’ -AATGTTGCCAAGCTGCTGA-3’ (配列番号： 6 )
プローブ； Universal ProbeL i brary Probe 027 (Roche)
18s rRNA (Endogenous Control)
EUK 18s rRNA (20 X) (ABI)
[0075] [実施例 1 ] 非造血性血管内皮細胞および肝臓細胞を用いたオルガノイ ド の作製、 および当該オルガノイ ドからの血液凝固因子および補体因子の産生 ( 1 _ 1 ) ヒト非造血性血管内皮細胞 ( n〇 n _ H E C) の作製 ヒト iPS細胞 (1383D2 ;京都大学 iPS研究所)を DMEM/F-12 (Gibco) (10ml) に 1% B-27 Supplements (GIBCO) 、 BMP4 (25ng/ml) % CHIR 99021 (8^M) を 添加し、 5%C〇2、 37 °Cで 3日間培養することで中胚葉系細胞を誘導した 〇 さらに Stempro-34 SFM (Gibco) (10ml) に VEGF (200ng/ml) 、 Folskolin ( 2^M) を添加し、 5%C〇2、 37 °Cで 7日間培養することで、 CD31陽性、 CD7 3陽性および CD144陽性のヒト非造血性血管内皮細胞集団を得た。
[0076] (1 —2) ヒト肝臓内胚葉細胞 (human Hepatic Endoderm ; H E) の作製 ヒト iPS細胞 (1383D2 ;京都大学 i PS研究所)を RPMI (富士フィルム) (2ml) に Wnt3a (50ng/mL)、 アクチビン A (100ng/ml) を添加して 5 %C〇 2、 37 °Cで 5日間培養することで、 内胚葉系細胞を誘導した。 得られた内胚葉系細胞 を、 同培地に、 1%B27 Supplements (GIBCO) 、 FGF 2 (10ng/ml) を添加して 、 5%C〇2、 37°Cで、 さらに 5日間培養することで、 AFP、 ALBおよび HNF4 aが陽性のヒト肝臓内胚葉細胞集団を得た。
[0077] (1 -3) オルガノイ ド (三次元構造体) の作製
作製したヒト肝臓内胚葉細胞 ( H E ) とヒト非造血性内皮細胞 (n o n—
H EC) を 10:7の割合の細胞数 (総数 1 8X 1 〇5個) で混合し、 三次元培養 容器 ELpLasia (クラレ) 上で一日間、 5%C〇2、 37 °Cで共培養することで 凝集体を作製した。 この共培養において、 培養培地は、 HCM (Lonza)に FBS (5 %) . HGF (10ng/ml) , OSM (20ng/ml) , Dex (100nM) を加えた肝臓細胞用培 地 (A) と、 Stempro-34 SFM (Gibco)に VEGF (50ng/ml) % FGF2 (10ng/ml) を加えた血管内皮細胞用培地 (A) を、 1:1の体積割合で混合したもの (本明 細書中 「オルガノイ ド用培地 （A） 」 という） を 2iiU用いた。
[0078] （1 -4） 細胞外マトリックスへの包埋
上記 （1 _3） に従って得た凝集したヒト肝臓内胚葉細胞 （HE） およびヒ 卜非造血性血管内皮細胞 （non-HEC） のオルガノイ ド （三次元構造体） をマト リゲル（BD pharmingen）内に 4°Cにて混合したのち 37°Cまで温度を上げるこ とにより、 オルガノイ ドをマトリゲル内に均一になるように包埋した。 マト リゲルに包埋されたオルガノイ ドを低吸着培養皿 （Corning） 上で 5%C〇2 、 37 °Cにて浮遊培養した。 培養培地は上記 （1 —3） で使用したものと同 —のオルガノイ ド用培地 （A） を 4mL用いた。 浮遊培養 21日〜 60日程度までの 培養液 （培養上清） を経時的に採取し、 血液凝固因子 （第 VIII因子） および 補体因子 （補体第 3成分 （C3） 、 補体第 5成分 （C5） 、 H因子 （FH） および B因子 （FB） ） の産生量を測定した。
[0079] 第 VIII因子、 補体第 3成分 （C3） 、 補体第 5成分 （C5） 、 H因子 （FH） お よび B因子 （FB） のそれぞれの産生量は、 それぞれ下記キッ トを用いて、 ELI SA法（Enzyme-L i nked Immuno Sorbent Assay法）により測定した。
第 VIII因子： Human Coagulation Factor VIII （F8） ELISA Kit （Biomatik） 補体第 3成分 （C3） : Complement C3 Human ELISA kit （Abeam） ;
補体第 5成分 （C5） : Complement C5 Human ELISA kit （Abeam） ;
H因子 （FH） : Human Factor H ELISA Kit （Abeam） :
B因子 （FB） : Human Factor B ELISA Kit （Abeam） 〇
[0080] （1 -5） 培養培地の変更
オルガノイ ド用培地 （A） の代わりに、 肝臓細胞用培地 （A） のみ、 また は血管内皮細胞用培地 （A） のみを用い、 それ以外は上記 （1 _3） および （1 -4） と同様の手順で、 血液凝固因子 （第 VIII因子） および補体因子 （ 補体第 3成分 （C3） 、 補体第 5成分 （C5） 、 H因子 （FH） および B因子 （FB ） ） の産生量を測定した。
[0081] （1 -6） 細胞の混合割合の変更 \¥02020/175594 22 卩（：171? 2020 /007886
ヒト肝臓内胚葉細胞 （ ） とヒト非造血性血管内皮細胞 （ ^ 〇 を 10:7 の割合 （細胞総数 1 8X1 0，） で混合した細胞集団から得られたオルガノ イ ドの代わりに、
Figure imgf000024_0001
: 1 （7 : 7） 、 4 : 7、 1 : 7または 0 : 7の割 合 （各細胞総数 1 8X1 0，） で混合した細胞集団から得られたオルガノイ ドを用い、 それ以外は上記 （1 —3） および （1 —4） と同様の手順で、 ま た上記 （1 _5） に記載したように培養液も変更して、 血液凝固因子 （第VII I因子） および補体因子 （補体第 3成分 （¢3） 、 補体第 5成分 （¢5） 、 1~1因子 および巳因子 8） ） の産生量を測定した。
[0082] （結果）
培養 60日目の培養液 （培養上清） 中に含まれる第VIII因子の濃度 （ 9/|11 _|1レ1（^ 06118） の結果を下記表に示す。 本発明に従ってマトリゲルに包埋さ れ培養されたオルガノイ ドからは第VIII因子が産生されており、 特に培地と してオルガノイ ド用培地 （八） を用いた場合には、 第VIII因子の産生量は多 量であった。
[0083] [表 1]
Figure imgf000024_0002
[0084] また、 培養 30日目の培養液 （培養上清） 中に含まれる補体因子（補体第 3成 分 （¢3） 、 補体第 5成分 （¢5） 、 巳因子 8） および !!因子 ）の濃度 （ \¥0 2020/175594 23 卩(：171? 2020 /007886
Figure imgf000025_0001
06 1 ） の結果を下記表に示す。 本発明に従ってマトリゲルに 包埋され培養された、 非造血性血管内皮細胞および肝臓細胞から形成された オルガノイ ドからは各補体因子が産生されており、 特に培地としてオルガノ イ ド用培地 （八） を用いた場合には、 各補体因子の産生量が高かった。
[0085] [表 2]
Figure imgf000025_0004
4.1」（検出されず）
[0086] [実施例 2 ] 造血性血管内皮細胞 （1~1巳〇） の作製、 および 1~1巳〇からの 血液凝固因子および補体因子の産生
（実験方法）
（2 - 1） ヒト造血性血管内皮細胞 （!~1巳〇 の作製
Figure imgf000025_0002
下、 5 %〇〇2、
Figure imgf000025_0003
細胞コロニー を形成後、 Essential 8培地 (Gibco) (8 nU) に BMP4 (80 ng/ml) % VEGF (80 ng/ml) , CHIR 99021 (2^M) を添加し、 5%C〇2、 37°Cで 2日間培養した 〇 次いで、 Essential 6培地 (Gibco) (8ml) に VEGF (80ng/ml) % FGF2 (25ng/ ml) , SCF (50ng/ml) , SB 431542 (2 /xM) を添加した培地に交換し、 5%C 〇2、 37 °Cでさらに 2日間培養することで側板中胚葉系細胞を誘導した。 そ の後、 Stempro-34 SFM(Gibco) (8ml) に VEGF (80ng/ml) 、 SCF (50ng/ml) 、 FU-3L (50ng/ml) % IL-3 (50ng/ml) % IL-6 (50ng/ml) % TPO (5ng/nU) を 添加した培地に交換し、 5%C〇2、 37°Cで 2日間培養し、 さらに上記組成 の培地から VEGFを除いた培地に交換して、 5%C〇2、 37°Cで 1日間培養す ることで CD34陽性、 CD73陰性の造血性血管内皮細胞を得た。
[0087] (2-2) 細胞外マトリックスへの H ECの包埋およびオルガノイ ドの作 製
上記 (2— 1 ) で作製したヒト造血性血管内皮細胞 (H EC) を、 マトリ ゲル (BD pharmingen)内に 4°Cにて混合したのち 37 °Cまで温度を上げること により、 細胞をマトリゲル内に均一になるように包埋し、 H ECの凝集体 ( オルガノイ ド) を作製した。 次いで、 作製したオルガノイ ド包埋マトリゲル を低吸着培養皿 (Corning) 上で 5%C〇2、 37 °Cにて培養した。 培養培地 は、 オルガノイ ド用培地 (A) を用いた。 培養 21日〜 42日程度までの培養液 を経時的に採取し、 上記 (1 _4) と同様の手順で、 凝固因子 (第 VIII因子 ) および補体因子 (補体第 3成分 (C3) 、 補体第 5成分 (C5) 、 H因子 (FH ) および B因子 (FB) ) の産生量を測定した。
[0088] (結果)
培養 21日目の培養液中に含まれる第 VIII因子の濃度 (p g/mi Uion ceUs ) の結果を下記表に示す。 本発明に従ってマトリゲルに包埋され培養された 、 造血性血管内皮細胞 (H EC) からは、 多量の第 VIII因子が産生された。
[0089] \¥02020/175594 25 卩（：171? 2020 /007886
[表 3]
Figure imgf000027_0001
[0090] また、 培養 21日目の培養液中に含まれる補体因子（補体第 3成分 （¢3） 、 補 体第 5成分 （05） , 巳因子 8） および 1~1因子 ）の濃度 （n 9/（^1110 门 06118） の結果を下記表に示す。 本発明に従ってマトリゲルに包埋され培養 された、 造血性血管内皮細胞 （1~1巳〇 から形成されたオルガノイ ドからは 各補体因子が産生されており、 特に補体第 3因子 （03） および 1~1因子 の産生量が高かった。
[0091] [表 4]
Figure imgf000027_0002

Claims

\¥02020/175594 26 卩（：171? 2020 /007886 請求の範囲
[請求項 1] 以下の工程を含む、 血液凝固疾患および/または補体異常疾患の治 療用組成物の製造方法：
（ 1） 血管内皮細胞、 または
血管内皮細胞および肝臓細胞、
から作製されたオルガノイ ド、
を細胞外マトリックスに包埋する工程；
（2） 前記細胞外マトリックスを培養する工程；および
（3） 前記工程 （2） で培養した培養物から培養上清を回収する工程
[請求項 2] 請求項 1記載の方法により得られた培養上清。
[請求項 3] 請求項 2記載の培養上清を含む、 血液凝固疾患および/または補体 異常疾患の治療用組成物。
[請求項 4] 以下から選択される 2以上の成分を含む、 血液凝固疾患および/ま たは補体異常疾患の治療用組成物：
1 0X 1 0 -6重量％〜 1 000X 1 0_6重量％の第 II因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第 V因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第 VII因子、
1 X 1 0 -6重量％〜 1 00X 1 0 -6重量％の第 VIII因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第 IX因子、
〇. 1 X 1 0_6重量％〜 1 0 X 1 0_6重量％の第 X因子、
〇. 01 X 1 0_6重量％〜 1 X 1 0_6重量％の第 XI因子、
1 X 1 0_6重量％〜 1 00X 1 0- 6重量％のアンチトロンビン、 1 0X 1 0-6重量％〜 1 000 X I 〇-6重量％の補体第 3成分 （〇 3） 、
1 0X 1 0-6重量％〜 1 00 X I 〇-6重量％の補体第 5成分 （〇5
Figure imgf000028_0001
1 0X 1 0_6重量％〜 1 00X 1 0_6重量％の巳因子 （ 巳） 、 お \¥02020/175594 27 卩（：17 2020 /007886
よび
1 〇〇 X 1 〇 -6重量％〜 1 000X 1 0- 6重量％の !!因子 （ !!）
PCT/JP2020/007886 2019-02-28 2020-02-27 血液凝固および／または補体異常疾患の治療用組成物 WO2020175594A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20762621.9A EP3932486A4 (en) 2019-02-28 2020-02-27 COMPLEMENT FOR THE TREATMENT OF BLOOD COAGULATION AND/OR COMPLEMENT DISORDERS
JP2021502350A JP7501875B2 (ja) 2019-02-28 2020-02-27 血液凝固および／または補体異常疾患の治療用組成物
US17/434,635 US20220088085A1 (en) 2019-02-28 2020-02-27 Composition for treating blood coagulation and/or complement disorders

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-036542 2019-02-28
JP2019036542 2019-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020175594A1 true WO2020175594A1 (ja) 2020-09-03

Family

ID=72240079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/007886 WO2020175594A1 (ja) 2019-02-28 2020-02-27 血液凝固および／または補体異常疾患の治療用組成物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220088085A1 (ja)
EP (1) EP3932486A4 (ja)
JP (1) JP7501875B2 (ja)
WO (1) WO2020175594A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022191171A1 (ja) * 2021-03-09 2022-09-15 国立大学法人 東京医科歯科大学 細胞クラスターの製造方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013047639A1 (ja) * 2011-09-27 2013-04-04 公立大学法人横浜市立大学 組織及び臓器の作製方法
WO2014199622A1 (ja) 2013-06-10 2014-12-18 株式会社クラレ 組織構造体及びその作製方法
WO2017110724A1 (ja) * 2015-12-24 2017-06-29 公立大学法人横浜市立大学 血液細胞を用いた組織・臓器の作製方法
WO2018011558A1 (en) * 2016-07-11 2018-01-18 Cellesce Limited Methods for culturing organoids
WO2018091677A1 (en) * 2016-11-18 2018-05-24 ECOLE POLYTECHNIQUE FéDéRALE DE LAUSANNE Organoid tissue engineering

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1446150A1 (en) * 2001-11-09 2004-08-18 Novo Nordisk Health Care AG Pharmaceutical composition comprising factor vii polypeptides and protein c inhibitors
US20150017140A1 (en) * 2011-12-23 2015-01-15 Anthrogenesis Corporation Organoids comprising decellularized and repopulated placental vascular scaffold
JP6330026B2 (ja) * 2013-03-15 2018-05-23 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子ポリペプチド製剤

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013047639A1 (ja) * 2011-09-27 2013-04-04 公立大学法人横浜市立大学 組織及び臓器の作製方法
WO2014199622A1 (ja) 2013-06-10 2014-12-18 株式会社クラレ 組織構造体及びその作製方法
WO2017110724A1 (ja) * 2015-12-24 2017-06-29 公立大学法人横浜市立大学 血液細胞を用いた組織・臓器の作製方法
WO2018011558A1 (en) * 2016-07-11 2018-01-18 Cellesce Limited Methods for culturing organoids
WO2018091677A1 (en) * 2016-11-18 2018-05-24 ECOLE POLYTECHNIQUE FéDéRALE DE LAUSANNE Organoid tissue engineering

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELL REP, vol. 21, no. 10, 2017, pages 2661 - 2670
CELL REP., vol. 21, no. 10, 2017, pages 2661 - 2670
CELL REPORTS, vol. 2, 2012, pages 553 - 567
K. SI-TAIYEB ET AL., HEPATOLOGY, vol. 51, no. 1, 2010, pages 297 - 305
KLEINMAN, HYNDA K. ET AL.: "Matrigel uses in cell biology and for the identification of thymosin beta4, a mediator of tissue regeneration", APPLIED BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 61, no. 6, 2018, pages 703 - 708, XP036647359, DOI: 10.1007/s13765-018-0400-6 *
MCGUIGAN, ALISON P. ET AL.: "Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 103, no. 31, 2006, pages 11461 - 11466, XP055179620, DOI: 10.1073/pnas.0602740103 *
MIZUGUCHI, AKIHIRO: "Coagulation factor VIII in liver disease", JOURNAL OF JAPANESE SOCIETY OF GASTROENTEROLOGY, vol. 82, no. 6, pages 1533 - 1542 *
NAKAGAWA, KAZUNORI ET AL.: "Finding secret of vascular endothelium, vascular endothelium as biological defense position, vascular endothelium as antithrombotic factor", MOLECULAR CARDIOVASCULAR MEDICINE, vol. 4, pages 376 - 384 *
NAT CELL BIOL, vol. 17, no. 8, 2015, pages 994 - 1003
NATURE CELL BIOLOGY, vol. 18, 2016, pages 246 - 254
NORIKAZU SAEKI, YASUNORI NIO, TADAHIRO SHINOZAWA, TAKANORI TAKEBE: "S3-2: Development of innovative therapeutic method for blood coagulation defect by human liver organoid technology", ORGAN BIOLOGY, vol. 26, no. 3, 20 October 2019 (2019-10-20) - 9 November 2019 (2019-11-09), JP, pages 55, XP009530220, ISSN: 1340-5152, DOI: 10.11378/organbio.26.277 *
PLOS ONE, vol. 8, no. 4, 2013, pages e59243
R. PETERS ET AL., PLOS ONE, vol. 5, no. 12, 2010, pages e15689
SCI REP, vol. 6, 2016, pages 35680
See also references of EP3932486A4
T. TOUBOUL ET AL., HEPATOLOGY, vol. 51, no. 5, pages 1754 - 65
TANIGUCHI, HIDEKI: "Artificial organs - Recent advance artificial organs - Technology for creating human liver organoid", JINKO ZOKI *
TANIGUCHI, HIDEKI: "Regenerative medicine - Frontiers of clinical application - 8. New development of human and organoid technology using iPS cells", vol. 37, no. 5, pages 565 - 569 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022191171A1 (ja) * 2021-03-09 2022-09-15 国立大学法人 東京医科歯科大学 細胞クラスターの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20220088085A1 (en) 2022-03-24
EP3932486A1 (en) 2022-01-05
JP7501875B2 (ja) 2024-06-18
EP3932486A4 (en) 2022-11-30
JPWO2020175594A1 (ja) 2020-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pill et al. Vascularization mediated by mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue: a comparison
Strieter et al. The role of circulating mesenchymal progenitor cells (fibrocytes) in the pathogenesis of pulmonary fibrosis
Liu et al. Vasculogenic and osteogenesis-enhancing potential of human umbilical cord blood endothelial colony-forming cells
Wang et al. Platelet-derived growth factor receptor beta identifies mesenchymal stem cells with enhanced engraftment to tissue injury and pro-angiogenic property
Katakai et al. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes
Rufaihah et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells exhibit functional heterogeneity
Costa et al. SOX7 regulates the expression of VE-cadherin in the haemogenic endothelium at the onset of haematopoietic development
Li et al. Cardiospheres recapitulate a niche-like microenvironment rich in stemness and cell-matrix interactions, rationalizing their enhanced functional potency for myocardial repair
Silzle et al. Tumor‐associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue
Fan et al. Tethered epidermal growth factor provides a survival advantage to mesenchymal stem cells
Lee et al. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing
Sordi et al. Bone marrow mesenchymal stem cells express a restricted set of functionally active chemokine receptors capable of promoting migration to pancreatic islets
Onitsuka et al. Characterization and functional analyses of hepatic mesothelial cells in mouse liver development
Revoltella et al. Granulocyte–macrophage colony-stimulating factor as an autocrine survival-growth factor in human gliomas
Mallet et al. TGFβ1 induces vasculogenesis and inhibits angiogenic sprouting in an embryonic stem cell differentiation model: respective contribution of ALK1 and ALK5
Murga et al. Derivation of endothelial cells from CD34− umbilical cord blood
Iurlaro et al. Rat aorta-derived mural precursor cells express the Tie2 receptor and respond directly to stimulation by angiopoietins
Clover et al. Allogeneic mesenchymal stem cells, but not culture modified monocytes, improve burn wound healing
US20160244719A1 (en) Generating arterial endothelial cell populations
Matsushima et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes
Secchiero et al. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand promotes migration of human bone marrow multipotent stromal cells
He et al. Effects of Notch ligand Delta1 on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells in vitro
Kim et al. Notch ligand Delta-like 1 promotes in vivo vasculogenesis in human cord blood–derived endothelial colony forming cells
Xu et al. Human breast adipose-derived stem cells transfected with the stromal cell-derived factor-1 receptor CXCR4 exhibit enhanced viability in human autologous free fat grafts
Mayer et al. Pro-angiogenic CD14++ CD16+ CD163+ monocytes accelerate the in vitro endothelialization of soft hydrophobic poly (n-butyl acrylate) networks

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20762621

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021502350

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020762621

Country of ref document: EP

Effective date: 20210928