JP7348608B2 - 改善された分化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養培地および方法、特に、例えばヒト上皮幹細胞などの前駆細胞を分化させるための培養培地および方法の分野に属する。
前駆細胞を分化させるための培地および方法には大きな関心が寄せられている。前駆細胞およびそれらの分化した子孫は、細胞アッセイ、薬物スクリーニングおよび毒性アッセイにおいて使用することができる。前駆細胞およびその分化した子孫はまた、損傷した組織の治療のための再生医療などの、細胞に基づく治療法にも有望である。さらに、効率的な細胞培養培地は、研究目的のための細胞の集団を提供し、維持するために重要である。
基礎培地と、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤とを含む分化培地中で、細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。
基礎培地と、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびGSK-3阻害剤とを含む分化培地中で、細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。
基礎培地と、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびAP-1刺激剤とを含む分化培地中で、細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。
増殖培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の上皮幹細胞を培養する工程であって、好ましくは、増殖培地が、基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、1つまたは複数のWntアゴニスト、TGF-β阻害剤およびcAMP経路活性化剤を含む、工程;ならびに
1つまたは複数の増殖した上皮幹細胞を本発明の分化培地中で培養する工程
を含む、方法を提供する。
増殖培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の肝上皮幹細胞を培養する工程であって、好ましくは、増殖培地が、基礎培地を含み、さらに、EGF、FGF10、HGF、Wntアゴニスト(例えばRスポンジン)、ニコチンアミド、TGF-β阻害剤、フォルスコリンおよびガストリンを含む、工程;ならびにその後、
本発明の分化培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の増殖した肝上皮幹細胞培養する工程
を含む、方法を提供する。
本発明の分化したオルガノイドを候補分子(または候補分子のライブラリ)と接触させる工程;
任意の作用(例えば増殖の減少もしくは喪失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化)またはオルガノイドの変化(例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性)に関して前記オルガノイドを評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、方法。
[本発明1001]
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
[本発明1002]
1つまたは複数のWnt阻害剤が、(1)Wnt分泌の阻害剤、(2)WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との間の相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、(3)Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、(4)Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、(5)分解複合体活性を促進する活性化剤、(6)分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または(7)β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
分化培地がGSK-3阻害剤をさらに含む、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
1つまたは複数のWnt阻害剤が、β-カテニン分解複合体の下流で作用する阻害剤、例えばβ-カテニン標的遺伝子発現を阻害するWnt阻害剤を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびGSK-3阻害剤をさらに含む分化培地中で、前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
[本発明1007]
GSK-3阻害剤が、CHIR99201、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択される、本発明1004~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
分化培地が、β-カテニン分解複合体の下流で作用する少なくとも1つのWnt阻害剤、例えばβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤をさらに含む、本発明1006または本発明1007の方法。
[本発明1009]
β-カテニン標的遺伝子発現のWnt阻害剤が、iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115 584、ZTM000990、PNU 74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、本発明1005または本発明1008の方法。
[本発明1010]
分化培地がAP-1刺激剤をさらに含む、本発明1001~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびAP-1刺激剤をさらに含む分化培地中で、前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
[本発明1012]
AP-1刺激剤がムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、例えばアセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピンから選択されるムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである、本発明1010または本発明1011の方法。
[本発明1013]
1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、RTKクラスI(EGF受容体ファミリー)(ErbBファミリー)のリガンド、RTKクラスIV(FGF受容体ファミリー)のリガンド、およびRTKクラスVI(HGF受容体ファミリー)のリガンドの1つまたは複数、または全部を含む、本発明1001~1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意でDAPTまたはジベンザゼピン(DBZ)またはベンゾジアゼピン(BZ)またはLY-411575である、本発明1001~1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
糖質コルチコイドが、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾンから選択される、本発明1001~1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
TGF-β阻害剤が、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511からなる群より任意で選択されるALK4、ALK5またはALK7の阻害剤である、本発明1001~1017のいずれかの方法。
[本発明1018]
分化培地が、BMP7、BMP4およびBMP2の1つまたは複数から任意で選択されるBMP経路活性化剤をさらに含む、本発明1001~1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
分化培地がガストリンをさらに含む、本発明1001~1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
分化培地が、
受容体チロシンキナーゼリガンドとしてのEGF、FGF19およびHGF、
notch阻害剤としてのDAPT、
Wnt阻害剤としてのIWP2およびiCRT3、
糖質コルチコイドとしてのデキサメタゾン、
GSK-3阻害剤としてのCHIR99021、ならびに
AP-1阻害剤としてのカルバコール
を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
分化培地が、B27、レチノイン酸を含まないB27、およびN2からなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む、本発明1001~1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
本発明1001~1021のいずれかの分化培地。
[本発明1023]
上皮幹細胞を培養するための方法であって、
増殖した上皮幹細胞を得るために、上皮幹細胞用の増殖培地の存在下で上皮幹細胞を培養する工程;およびその後、
本発明1021の分化培地中で1つまたは複数の前記増殖した細胞を培養する工程
を含む、方法。
[本発明1024]
細胞を細胞外マトリックスと接触させて培養する、本発明1001~1021および1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
分化した細胞集団または分化したオルガノイドを取得および/または単離する工程をさらに含む、本発明1001~1021および1023~1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前駆細胞が上皮細胞、例えば肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺に由来する上皮細胞である、本発明1001~1021および1023~1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前駆細胞が肝臓または膵臓に由来する、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前駆細胞が哺乳動物前駆細胞、例えばヒト前駆細胞である、本発明1001~1021および1023~1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
分化した肝臓オルガノイドを好ましくは得るために、肝上皮幹細胞を培養するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
増殖培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の肝上皮幹細胞を培養する工程であって、好ましくは前記増殖培地が、基礎培地を含み、かつEGF、FGF10、HGF、Wntアゴニスト(例えばRスポンジン)、ニコチンアミド、TGF-β阻害剤、フォルスコリンおよびガストリンをさらに含む、工程;ならびにその後、
本発明1021の分化培地、好ましくは本発明1020のような分化培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の前記増殖した肝上皮幹細胞を培養する工程。
[本発明1030]
増殖培地中で少なくとも3日間培養した後、培養物を破砕し、分割して、次いで分化培地中で培養する、本発明1022~1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
本発明1001~1021および1023~1029のいずれかの方法によって得ることのできるまたは得られるオルガノイド。
[本発明1032]
肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺に由来する、本発明1031のオルガノイド。
[本発明1033]
ヒト由来であり、かつ少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも99%の細胞が肝細胞マーカーを発現する、本発明1031または1032の肝臓オルガノイド。
[本発明1034]
マウスに由来し、かつ少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも99%の細胞が肝細胞マーカーを発現する、本発明1031~1033のいずれかの肝臓オルガノイド。
[本発明1035]
オルガノイド、例えば本発明1031~1034のいずれかのオルガノイドと、本発明1021の分化培地とを含む、組成物。
[本発明1036]
創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断;組織発生学、細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織損傷および修復に関与する機構の研究;炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または細胞形質転換およびがんの病因の機構の検討における、本発明1031~1035のいずれかに定義されたオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の使用。
[本発明1037]
医療における使用、例えば障害、状態または疾患の治療における使用のための、本発明1031~1034のいずれかのオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞。
[本発明1038]
医療が再生医療である、例えば使用がオルガノイドまたは細胞の患者への移植を含む、本発明1037の使用のためのオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞。
[本発明1039]
1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、デキサメタゾン、TGF-β阻害剤、1つまたは複数のWnt阻害剤、GSK-3阻害剤およびAP-1刺激剤を含む、医薬製剤。
[本発明1040]
治療用または予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法であって、
本発明1031~1034のいずれかの分化したオルガノイドを候補分子(または候補分子のライブラリ)と接触させる工程;
任意の作用(例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化)またはオルガノイドの変化(例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性)について前記オルガノイドを評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を、潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、方法。
様々な組織から前駆細胞を分化させる方法は、これまでに国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号および国際公開公報第2015/173425号に記載されている。本発明者らは、驚くべきことに、Wnt阻害剤を培養培地に添加すると、例えば肝細胞を用いて例示されるように、前駆細胞の分化が改善されることを見出した(実施例1参照)。例えば、培養培地へのWnt阻害剤の添加は、オルガノイド中の細胞集団のより高い割合の分化をもたらすことができる。さらに、Wnt阻害剤の添加は、インビボでの分化した細胞(例えば肝細胞)により密接に類似した分化オルガノイド中の細胞をもたらすことができる。例えば、肝細胞に関連したより高いレベルのCyp3A4発現。パネート細胞の分化はWntを必要とし、成熟肝細胞は活性Wntシグナル伝達を有するので、これは驚くべきことである(例えばFarin et al.(2012)Gastroenterology 143:1518-1529;Yang et al.(2014)Hepatology 60(3):964-976およびGerbal-Chaloin et al.(2014)Molecular Pharmacology 86:624-634参照)。したがって、この経路をブロックすることによって分化を改善することが可能であるというのは驚くべきことである。本発明者らは、Wnt分泌をブロックすることまたはβ-カテニン標的遺伝子発現を阻害することのような、この経路を任意のレベルでブロックすることが有用であることを示した(「Wnt阻害剤」の項におけるさらなる解説参照)。したがって、本発明は、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるためのWnt阻害剤の使用を提供する。
Wntシグナル伝達経路は、活性化された場合、典型的にはβ-カテニン分解を防止し、β-カテニン媒介性シグナル伝達を増強する。この経路は、Frizzled受容体およびLRP5/6を含む細胞表面Wnt受容体複合体が、通常、Wntファミリーのメンバーなどの細胞外シグナル伝達分子によって活性化された場合に生じる一連の事象によって定義される。これは、細胞内β-カテニンを分解するタンパク質の分解複合体を阻害するDishevelledファミリータンパク質の活性化をもたらす。分解複合体は、カゼインキナーゼCK1α、δおよびεならびにGSK-3が動員される、APCおよびアキシンを含む構造成分から形成される。分解複合体は、β-カテニンをリン酸化し、それをユビキチンリガーゼ、β-TrCPに曝露すると考えられる。次いで、β-カテニンのユビキチン化は、プロテアソームにおけるその分解をもたらす。
(1)Wnt分泌の阻害剤(例えばLGK974、IWP-1またはIWP-2などのPorcの阻害剤)、
(2)WntまたはRスポンジンとそれらのそれぞれの受容体との間の相互作用の競合的および非競合的阻害剤(例えばOMP-18R5、OMP54F28)、
(3)LRP(例えばニクロサミド)ならびにZnrf3および/もしくはRnf43などのRスポンジン受容体の分解を促進する因子またはZnrf3および/もしくはRnf43を活性化する因子などの、Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する因子、
(4)Frizzled受容体および/もしくは分解複合体の成分へのDishevelledファミリータンパク質の結合を減少させる阻害剤(例えばDapperファミリータンパク質、FJ9、スリンダク、3289-8625、J01-017a、NSC668036)またはDishevelledファミリータンパク質の発現を下方調節する阻害剤(例えばニクロサミド)などの、Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、
(5)(a)アキシンおよび/またはAPCなどの分解複合体の成分を脱リン酸化するホスファターゼ(例えばPP1、PP2Aおよび/またはPP2C)の阻害剤(例えばオカダ酸またはトートマイシン)ならびに(b)GSK-3をリン酸化するキナーゼ(例えばp38 MAPK、PKA、PKB、PKC、p90RSKまたはp70S6K)の阻害剤(例えばSB239063、SB203580またはRp-8-Br-cAMP)を含む、分解複合体活性を促進する因子、
(6)タンキラーゼ1および/または2の阻害剤(例えばXAV939、IWR1、JW74、JW55、2-[4-(4-フルオロフェニル)ピペラジン-1-イル]-6-メチルピリミジン-4(3H)-オンまたはPJ34)などの、分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、ならびに
(7)β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤(例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14またはFH535)などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤(例えばカンビノール)を含む、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤。
上記で論じたように、本発明者らは、驚くべきことに、分化培地中にWnt阻害剤を含めることにより、上皮幹細胞の分化を増強し得ることを見出した。予想外に、本発明者らはまた、GSK-3阻害剤(実施例1のCHIR99021)を含めることも上皮幹細胞の分化を改善することを見出した。上記で説明したように、GSK-3はβ-カテニン分解複合体の成分である。GSK-3活性を阻害するとβ-カテニンの分解の減少をもたらすので、GSK-3阻害剤はWntアゴニストである。GSK-3阻害剤を分化培地に含めることによって誘発される増強された分化は、分解複合体の下流でTCF/LEF媒介転写を阻害するWnt阻害剤(iCRT3)の添加によって大きく増加した(図2E参照)。したがって、本発明者らは、Wntアゴニスト(CHIR99021)およびWnt阻害剤(iCRT3)の両方が分化培地中に含まれる場合、肝細胞マーカー(アルブミンおよびCyp3A4)の発現に顕著な改善が生じることを見出した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではいが、本発明者らは、GSK-3阻害剤が上皮幹細胞における分化の刺激と阻害の両方を行う(刺激が阻害よりも強い)と考える。GSK-3阻害剤による分化の阻害は、β-カテニン分解の促進によって起こると考えられる。対照的に、GSK-3阻害剤による分化の促進は、別個のエフェクター機構によって起こると考えられる。したがって、本発明者らは、GSK-3阻害剤を含有する分化培地中に、分解複合体の下流でTCF/LEF媒介転写を阻害するWnt阻害剤を含めることが、GSK-3阻害剤の分化阻害作用に対抗すると考える。分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤には、上記のクラス(7)のWnt阻害剤、すなわち、β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤(例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14またはFH535)およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤(例えばカンビノール)を含む、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤が含まれる。
上記で説明したように、本発明者らは、意外にも、WntアゴニストCHIR99021を分化培地に含めると分化を促進することを見出した。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、CHIR99021またはCHIR99021アゴニストを含む。CHIR99021アゴニストは、本明細書では、CHIR99021と1つまたは複数の生物学的活性を共有する作用物質であると定義される。
活性化タンパク質1(AP-1)複合体は、Fosタンパク質ファミリー、Jun、ATFおよびJDPファミリーに属するタンパク質からなるヘテロ二量体である転写因子である。この転写因子は、サイトカイン、増殖因子、ストレス、細菌感染およびウイルス感染を含む様々な刺激に応答して遺伝子発現を調節する。
上記で説明したように、本発明者らは、予想外に、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、すなわちカルバコールを分化培地に含めると分化を促進することを見出した。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを含む。
上記で説明したように、本発明者らは、予想外に、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、すなわちカルバコールを分化培地に含めると分化を促進することを見出した。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、カルバコールまたはカルバコールアゴニストを含む。カルバコールアゴニストは、本明細書では、カルバコールと1つまたは複数の生物学的活性を共有する作用物質であると定義される。
受容体チロシンキナーゼ(RTK)は、ポリペプチド成長因子、サイトカインおよびホルモンに対する高親和性細胞表面受容体である。RTKは、細胞の維持、成長および発達の鍵となる調節因子であり、また多くの種類のがんの発症および進行においても重要な役割を果たす。本発明の分化培地は、好ましくは1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドを含む。本発明に関連して、受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKを活性化する任意のリガンドである。多くの受容体チロシンキナーゼリガンドは分裂促進性成長因子である。したがって、いくつかの態様では、分化培地中の1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、1つまたは複数の分裂促進性成長因子を含む。
EGFは、様々な培養された外胚葉および中胚葉細胞の強力な分裂促進性成長因子であり、インビボおよびインビトロでの特定の細胞の分化ならびに細胞培養下のいくつかの線維芽細胞の分化に重要な影響を及ぼす。EGF前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する53アミノ酸のペプチドホルモンを生成する膜結合分子として存在する。
FGFファミリーメンバーは、広範な分裂促進活性および細胞生存活性を有し、胚発生、細胞増殖、形態形成、組織修復、腫瘍増殖および浸潤を含む様々な生物学的過程に関与する。FGFは、細胞表面チロシンキナーゼ受容体(FGFR)と相互作用することによって細胞を刺激する。密接に関連する4つの受容体(FGFR1~FGFR4)が同定されている。FGFR1~FGFR3遺伝子は複数のアイソフォームをコードすることが示されており、これらのアイソフォームは、リガンド特異性を決定する上で重要であり得る。いくつかの態様では、FGFは、FGF1~10のいずれか1つである。
肝細胞増殖因子/分散因子(HGF/SF)は、がん原性c-Met受容体に結合した後、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化することによって細胞増殖、細胞運動および形態形成を調節する形態形成因子である。任意の適切なHGF、例えばPeprotechから入手されるHGFを使用し得る。いくつかの態様では、HGFは、HGF受容体を活性化する化合物で置換される。したがって、いくつかの態様では、HGFは、HGR受容体アゴニストで置換される。
Notchは、複数のタンパク質分解的切断を通して活性化され得る膜貫通表面受容体であり、そのうちの1つは、γ-セクレターゼと称される、プロテアーゼ活性を有するタンパク質の複合体による切断である。γ-セクレターゼは、膜内でその切断活性を実行するプロテアーゼである。γ-セクレターゼは多成分酵素であり、少なくとも4つの異なるタンパク質、すなわちプレセニリン(プレセニリン1または2)、ニカストリン、PEN-2およびAPH-1から構成される。プレセニリンはγ-セクレターゼの触媒中心である。リガンドに結合すると、Notch受容体は、メタロプロテアーゼであるADAMプロテアーゼの作用を介してエクトドメインシェディングを可能にする立体配座変化を受ける。これに続いて直ちに、Notch細胞内ドメイン(NICD)の放出をもたらすγ-セクレターゼ複合体の作用が生じる。NICDは核に移行し、そこでCSL(C-プロモータ結合因子/組換えシグナル配列結合タンパク質Jκ/Supressor-of-Hairless/Lagl)と相互作用する。NICDの結合は、CSLを転写リプレッサーから活性化因子に変換し、Notch標的遺伝子の発現をもたらす。
糖質コルチコイドは、ステロイドホルモンの1つのクラスである、コルチコステロイドのクラスである。糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体に結合するコルチコステロイドである。コルチゾールは最も重要なヒト糖質コルチコイドである。ヒドロコルチゾンはコルチゾールの合成版である。関連する構造を有する多くの他の合成糖質コルチコイド(例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾン)が存在する。糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体を活性化するために様々な効力を有する。これは糖質コルチコイド効力と呼ばれ、通常、コルチゾールと比較して測定される。様々な糖質コルチコイドの生化学、薬理学および作用機序は、例えばCecil Textbook of Medicine(1988),pages 128-130およびThe Science and Practice of Pharmacy 20th Edition(2000),pages 1363-1370に総説されている。
TGF-βシグナル伝達は、細胞増殖、細胞運命およびアポトーシスを含む多くの細胞機能に関与する。シグナル伝達は、典型的には、I型受容体を動員してリン酸化するII型受容体へのTGF-βスーパーファミリーリガンドの結合から始まる。次いで、I型受容体はSMADをリン酸化し、これが核内の転写因子として働き、標的遺伝子発現を調節する。
いくつかの態様では、分化培地はBMP経路活性化剤を含む。いくつかの態様では、BMP経路活性化剤は、BMP7、BMP4およびBMP2から選択される。BMP7が好ましい。BMP7は、SMAD1およびSMAD5のリン酸化を誘導する。したがって、いくつかの態様では、BMP経路活性化剤は、SMAD1およびSMAD5のリン酸化を誘導することができる任意の化合物である。さらに、BMP7が言及される場合、SMAD1またはSMAD5のリン酸化を誘導する任意の化合物をBMP7の代わりに使用することができる。
いくつかの態様では、本発明の分化培地はガストリンを含む。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01~500nM、0.1~100nM、1~100nM、1~20nMまたは5~15nMの濃度のガストリンを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約10nMの濃度のガストリンを含む。
本発明の方法において使用される分化培地は基礎培地を含む。基礎培地は、本明細書で提供される制限に従う、動物またはヒト細胞用の任意の適切な基礎培地である。
本発明はまた、上記の本発明の局面のいずれか1つによる細胞および/またはオルガノイドを含む組成物または細胞培養容器、ならびに上記の本発明の局面のいずれか1つによる分化培地を提供する。例えば、そのような組成物または細胞培養容器は、上記の分化培地中に、本発明の方法に従って培養された任意の数の細胞またはオルガノイドを含み得る。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択されるALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、ならびに
(iv)1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、(a)好ましくは0.01~150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または(b)好ましくは0.05~150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤
を含む。
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、ならびに
(iv)GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01~150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤
を含む。
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
(iv)1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、(a)好ましくは0.01~150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または(b)好ましくは0.05~150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤、ならびに
(v)GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01~150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤
を含む。
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
(iv)GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01~150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤、ならびに
(v)β-カテニン分解複合体の下流で作用する1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、好ましくは0.05~150μMの濃度の、例えば iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤などの、β-カテニン分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤
を含む。
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、ならびに
(iv)AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001~300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660(1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート)、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343(4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド)、77-LH-218-1(1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン)およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択されるALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
(iv)1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、(a)好ましくは0.01~150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または(b)好ましくは0.05~150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤、ならびに
(v)AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001~300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660(1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート)、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343(4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド)、77-LH-218-1(1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン)およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
(iv)GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01~150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤、ならびに
(v)AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001~300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660(1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート)、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343(4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド)、77-LH-218-1(1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン)およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
(i)1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1~200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI(例えばEGF)のリガンド、RTKクラスIV(例えばFGF)のリガンドおよびRTKクラスVI(例えばHGF)のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
(ii)1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM~200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択されるALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
(iii)Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001~100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン(DBZ)、ベンゾジアゼピン(BZ)およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
(iv)1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、(a)好ましくは0.01~150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または(b)好ましくは0.05~150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤、
(v)GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01~150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤、ならびに
(vi)AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001~300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660(1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート)、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343(4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド)、77-LH-218-1(1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン)およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
本発明者らは、驚くべきことに、より小さなオルガノイドを分化培地中で培養すると、分化が改善されることを見出した。特に、本発明者らは、オルガノイドを分化培地に添加する前に肝臓オルガノイド培養物を分割すると、より高い分化効率をもたらすことを見出した(図2F参照)。したがって、細胞集団のより大きな割合が肝細胞マーカー(例えばアルブミンおよびCyp3A4)を示し、分化した細胞はより高いレベルの肝細胞マーカーを示した。
1個の上皮細胞、上皮細胞の集団または単離された組織断片を増殖培地で培養して、増殖した細胞集団を得る工程(好ましくは、1つまたは複数のオルガノイドを得る工程);
増殖培地での少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間または少なくとも7日間の培養後に増殖培養物を分割する工程;および
増殖した細胞集団または1つもしくは複数のオルガノイドを分化培地で培養する工程
を含む。
いくつかの態様では、細胞を培養するための方法、例えば細胞を増殖させるおよび/または分化させるための方法は、細胞を細胞外マトリックス(ECM)と接触させて培養する工程を含む。任意の適切なECMを使用し得る。細胞は、好ましくは、前記細胞が天然に存在する細胞のニッチを少なくとも部分的に模倣する微小環境下で培養される。細胞のニッチは、一部には、細胞によっておよび前記ニッチ内の細胞によって分泌されるECMによって決定される。細胞のニッチは、インテグリンなどの細胞膜タンパク質との相互作用を提供する生体材料または合成材料の存在下で前記細胞を培養することによって模倣され得る。したがって、本明細書に記載のECMは、例えばインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって、インビボでの細胞のニッチを模倣する任意の生体材料または合成材料またはそれらの組み合わせである。
本分化方法は前駆細胞に有用である。前駆細胞は、本明細書では、分化能を有する任意の細胞と定義される。したがって、「前駆細胞」という用語は、成体幹細胞、胚性幹細胞およびiPS細胞を含むがこれらに限定されるわけではない幹細胞を包含する。前駆細胞は、例えば初代幹細胞または増殖幹細胞または部分分化幹細胞であり得る。いくつかの態様では、前駆細胞は初代細胞であり、生きている組織から直接得られたことを意味する。他の態様では、前駆細胞は二次細胞、すなわち培養および/または継代された細胞である。いくつかの態様では、前駆細胞は増殖細胞である。「増殖された」という用語は、細胞が、分化よりも細胞の拡大(例えば増殖)を促進する培養培地においてインビトロで培養されたことを意味する。
本発明は、前駆細胞を分化させるための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の分化培地中で細胞を培養する工程を含む。好ましい態様では、細胞を、本明細書に記載のようにECMと接触させて培養する。
1個の上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片を増殖培地で培養して、増殖した細胞集団を提供する工程;および
増殖した細胞集団を分化培地で培養する工程
を含む。
1個の前駆細胞または前駆細胞の集団を分化培地で培養する工程
を含む。
本発明はさらに、分化したオルガノイドまたは1つもしくは複数の分化した細胞の集団を提供する。
(1)標準物質または試料100μlを指定のウェルに添加する。各標準物質または試料を二重に検定する。
(2)プレートを覆い、室温(20~25℃)で1時間インキュベートする。
(3)プレートを4回洗浄する。
(4)抗アルブミン検出抗体100μlを各ウェルに添加する。
(5)プレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。
(6)プレートを4回洗浄する。
(7)HRP溶液A 100μlを各ウェルに添加する。
(8)プレートを覆い、室温で30分間インキュベートする。
(9)プレートを4回洗浄する。
(10)TMB基質溶液100μlを各ウェルに添加する。
(11)暗所にてプレートを室温で30分間インキュベートする。
(12)停止液100μlを各ウェルに添加して反応を停止させる。
(13)450nmのプレートリーダーで吸光度を測定する。
本明細書に記載のオルガノイドおよびオルガノイドに由来する細胞の使用も同様に提供される。この項でオルガノイドに言及する場合、これらは本発明に従う分化したオルガノイドである。用途の多くが本発明の方法によって得られるおよび/または得ることのできる分化細胞の集団にも適用できることは、当業者に理解されるであろう。本発明の方法によって得られるおよび/または得ることのできる分化細胞の集団のそのような使用も提供される。
オルガノイドのさらなる重要な用途は、粘膜ワクチン接種の開発における使用である。粘膜ワクチンは、粘膜を介して投与されるワクチンである。これは、鼻、口または直腸などの任意の粘膜表面であり得る。粘膜ワクチンは、吸入器、スプレーまたは他の外部補助器具を介して投与することができる。これには、ワクチンの投与に医療スタッフが必要でないなどの、注射に比べていくつかの明確な利点があり、これは、例えば発展途上国において重要であり得る。
好ましくはハイスループットの目的のために、本発明の前記オルガノイドは、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレートなどのマルチウェルプレートで培養される。前記オルガノイドに影響を及ぼす分子を同定するために、分子のライブラリが使用される。好ましいライブラリには、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ(例えばLOPAP(商標)、Sigma Aldrich)、脂質ライブラリ(BioMol)、合成化合物ライブラリ(例えばLOP AC(商標)、Sigma Aldrich)または天然化合物ライブラリ(Specs、TimTec)が含まれる。さらに、幹細胞の子孫において1つまたは複数の遺伝子の発現を誘導するまたは抑制する遺伝子ライブラリを使用することができる。これらの遺伝子ライブラリには、cDNAライブラリ、アンチセンスライブラリおよびsiRNAまたは他の非コードRNAライブラリが含まれる。細胞は、好ましくは、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。曝露期間の終わりに、培養物を評価する。「影響を及ぼす」という用語は、増殖の減少または消失、形態変化および細胞死を含むがこれらに限定されるわけではない、細胞の任意の変化をカバーするために使用される。本発明の前記オルガノイドは、上皮がん細胞を特異的に標的とするが、本発明の前記オルガノイドは標的としない薬物を同定するためにも使用できる。
分化した細胞集団またはオルガノイドを候補分子(または候補分子のライブラリ)と接触させる工程;
前記分化細胞集団またはオルガノイドを任意の作用(例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化)またはオルガノイドの変化(例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性)について評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む。
分化した細胞集団またはオルガノイドを候補分子(または候補分子のライブラリ)と接触させる工程;
前記分化細胞集団またはオルガノイドを任意の作用(例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化)またはオルガノイドの変化(例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性)について評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む。
(a)患者における関心対象の病的組織から生検材料を得る工程;
(b)生検材料を培養してオルガノイドを得る工程;
(c)本発明のスクリーニング方法を用いて適切な薬物をスクリーニングする工程;および
(d)工程(c)で得られた薬物により前記患者を治療する工程
を含む、方法が提供される。
いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは標的発見のために使用することができる。健常組織または病的組織に由来するオルガノイドの細胞は、標的同定のために使用し得る。本発明のオルガノイドは、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患(クローン病など)、がん腫、腺腫、腺がん、結腸がん、糖尿病(I型またはII型など)、バレット食道、ゴーシェ病、α-1-アンチトリプシン欠乏症、レッシュ-ナイハン症候群、貧血、シュバッハマン-ボディアン-ダイアモンド症候群、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、糖原病、家族性高コレステロール血症、クリグラー-ナジャー症候群、遺伝性高チロシン血症、ポンペ病、進行性家族性胆汁うっ滞、ハーラー症候群、SCIDまたは漏出SCID、オーメン症候群、軟骨毛髪形成不全症、単純ヘルペス脳炎、強皮症、骨形成不全症、ベッカー型筋ジストロフィ、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、先天性角化異常症等についての薬物標的の発見のために使用し得る。本発明の培地および方法に従って培養されたオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表すと考えられる。この理由から、前記オルガノイドは、特定の疾患における新規(分子)標的を見出すためのツールとなり得る。
病的および/または正常組織から得られた患者特異的オルガノイドは、ハイスループットスクリーニングで同定された分子の標的検証のために使用することができる。同じことが、ハイスループットスクリーニングにおいて可能性のある治療薬として同定された化合物の検証にも当てはまる。オルガノイド培養系で分化させた一次患者材料の使用は、ハイスループット創薬細胞株試験からの偽陽性等を試験するのに有用であり得る。
肝臓、腸オルガノイドまたは膵臓オルガノイドなどの前記分化幹細胞集団(例えば本発明のオルガノイド)は、さらに、潜在的な新規薬物または公知もしくは新規の栄養補助食品の毒性アッセイにおいてCaco-2細胞などの細胞株の使用に取って代わることができる。
さらに、本発明のオルガノイドは、現在適切な組織培養または動物モデルが存在しないノロウイルスなどの病原体の培養に使用することができる。
本発明は、再生医療および/または移植におけるオルガノイドの使用を提供する。本発明はまた、動物またはヒトにオルガノイドを移植することを含む治療方法を提供する。
いくつかの態様では、分化したオルガノイドまたは分化したオルガノイドに由来する細胞の人工臓器における使用が提供される。人工臓器は、他の場所で説明される方法によってインビボで移植され得る。あるいは、人工臓器はエクスビボであり得る。いくつかの態様では、エクスビボ人工臓器は、例えば血液供給を介して患者に接続され得る。例えば、分化したオルガノイドを含む人工臓器は、透析装置の一部として使用し得る。したがって、分化したオルガノイドは、病的または損傷上皮組織を有する患者を支援するために使用することができる。
本発明の方法を用いて得られる肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、様々な用途を有する。例えば、本発明は、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;肝臓発生学、肝細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;肝臓の損傷および修復に関与する機構の研究;肝臓の炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または肝細胞形質転換および肝臓がんの病因の機構の検討における、本明細書記載の肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団の使用を提供する。
膵臓細胞を培養するための方法は、国際公開公報第2010/090513号に記載されている。本発明の分化培地および方法は、膵臓から得られる上皮幹細胞の分化を増強すると想定される。
β-TrCP:β-トランスデューシンリピート含有タンパク質
GSK-3:グリコーゲンシンターゼキナーゼ3
LGR:ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体
LRP:低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質
PP1:プロテインホスファターゼ1
PP2A:プロテインホスファターゼ2A
PP2C:プロテインホスファターゼ2C
本明細書で使用される場合、「含む」という動詞およびその活用形は、この語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されないことを意味する非限定的な意味で用いられる。さらに、「からなる」という動詞は、必要に応じて、本明細書で定義される産物が、具体的に特定される成分以外のさらなる成分(1つまたは複数)を含んでもよいことを意味する「から本質的になる」に置き換えることができ、前記のさらなる成分は本発明の固有の特徴を変化させない。さらに、本明細書で定義される方法は、具体的に特定される工程以外のさらなる工程(1つまたは複数)を含んでもよく、前記のさらなる工程は本発明の固有の特徴を変化させない。さらに、不定冠詞「1つの(「a」または「an」)」によるある要素への言及は、文脈上要素の1つだけが存在することが明確に要求されない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「1つの」は、通常、「少なくとも1つ」を意味する。
本発明者らは、ヒト肝臓オルガノイドを両能性幹細胞から肝細胞状態に分化させる能力を有意に改善した。以前に確立された(旧)分化プロトコル(DM)を基にして、本発明者らは、4つのさらなる分化因子による処理と、分化工程における変更された分割プロトコルとを組み合わせた新しい改良された手順(DM+)を開発した(図1AおよびB)。以前の分化培地および改良された分化培地中の成分を以下の表に要約する。DM+プロトコルは、試験したすべての肝細胞マーカーの発現を増加させ、分化工程の間の胆管運命拘束を減少させる。最も注目すべきは、DM+が、肝細胞における薬物代謝の重要な酵素であるシトクロムの発現および活性の有意な改善(例えば初代肝細胞のレベルのCyp3A4)をもたらすことである。したがって、DM+は、ヒト肝臓オルガノイドを毒性アッセイおよび創薬などの商業用途に適合させるための大きな前進である。
Claims (56)
- 肝前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤、1つまたは複数のWnt阻害剤、およびGSK-3阻害剤をさらに含む分化培地中で、前記細胞を培養する工程
を含み、かつ
1つまたは複数のWnt阻害剤が、β-カテニン分解複合体の下流で作用する阻害剤を含む、
前記方法。 - 分化培地が、(1)Wnt分泌の阻害剤、(2)WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との間の相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、(3)Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、(4)Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、(5)分解複合体活性を促進する活性化剤、(6)分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または(7)β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択される1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤を含む、請求項2記載の方法。
- Wnt分泌の阻害剤が、IWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤である、請求項3記載の方法。
- GSK-3阻害剤が、CHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択される、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。
- β-カテニン分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤が、β-カテニン標的遺伝子発現のWnt阻害剤である、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。
- β-カテニン標的遺伝子発現のWnt阻害剤が、iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115 584、ZTM000990、PNU 74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、請求項6記載の方法。
- 分化培地がAP-1刺激剤をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項記載の方法。
- AP-1刺激剤がムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである、請求項8記載の方法。
- ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストが、アセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピンから選択される、請求項9記載の方法。
- 1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、RTKクラスI(EGF受容体ファミリー)(ErbBファミリー)のリガンド、RTKクラスIV(FGF受容体ファミリー)のリガンド、およびRTKクラスVI(HGF受容体ファミリー)のリガンドの1つまたは複数、または全部を含む、請求項1~10のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤である、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。
- γ-セクレターゼ阻害剤が、DAPTまたはジベンザゼピン(DBZ)またはベンゾジアゼピン(BZ)またはLY-411575である、請求項13記載の方法。
- 糖質コルチコイドが、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾンから選択される、請求項1~14のいずれか一項記載の方法。
- TGF-β阻害剤が、ALK4、ALK5またはALK7の阻害剤である、請求項1~15のいずれか一項記載の方法。
- ALK4、ALK5またはALK7の阻害剤が、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
- 分化培地が、BMP経路活性化剤をさらに含む、請求項1~17のいずれか一項記載の方法。
- BMP経路活性化剤が、BMP7、BMP4およびBMP2の1つまたは複数から選択される、請求項18記載の方法。
- 分化培地がガストリンをさらに含む、請求項1~19のいずれか一項記載の方法。
- 分化培地が、
受容体チロシンキナーゼリガンドとしてのEGF、FGF19およびHGF、
notch阻害剤としてのDAPT、
Wnt阻害剤としてのIWP2およびiCRT3、
糖質コルチコイドとしてのデキサメタゾン、
GSK-3阻害剤としてのCHIR99021、ならびに
AP-1刺激剤としてのカルバコール
を含む、請求項20記載の方法。 - 分化培地が、B27、レチノイン酸を含まないB27、およびN2からなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む、請求項1~21のいずれか一項記載の方法。
- 基礎培地、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤、1つまたは複数のWnt阻害剤、およびGSK-3阻害剤を含み、該1つまたは複数のWnt阻害剤が、β-カテニン分解複合体の下流で作用する阻害剤を含む、肝前駆細胞を分化させるための分化培地。
- (1)Wnt分泌の阻害剤、(2)WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との間の相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、(3)Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、(4)Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、(5)分解複合体活性を促進する活性化剤、(6)分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または(7)β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択される1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む、請求項23記載の分化培地。
- 1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤を含む、請求項24記載の分化培地。
- Wnt分泌の阻害剤が、IWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤である、請求25記載の分化培地。
- GSK-3阻害剤が、CHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択される、請求項23~26のいずれか一項記載の分化培地。
- β-カテニン分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤が、β-カテニン標的遺伝子発現のWnt阻害剤である、請求項23~27のいずれか一項記載の分化培地。
- β-カテニン標的遺伝子発現のWnt阻害剤が、iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115 584、ZTM000990、PNU 74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、請求項28記載の分化培地。
- AP-1刺激剤をさらに含む、請求項23~29のいずれか一項記載の分化培地。
- AP-1刺激剤がムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである、請求項30記載の分化培地。
- ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストが、アセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピンから選択される、請求項31記載の分化培地。
- 1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、RTKクラスI(EGF受容体ファミリー)(ErbBファミリー)のリガンド、RTKクラスIV(FGF受容体ファミリー)のリガンド、およびRTKクラスVI(HGF受容体ファミリー)のリガンドの1つまたは複数、または全部を含む、請求項23~32のいずれか一項記載の分化培地。
- 1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される、請求項33記載の分化培地。
- Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤である、請求項23~34のいずれか一項記載の分化培地。
- γ-セクレターゼ阻害剤が、DAPTまたはジベンザゼピン(DBZ)またはベンゾジアゼピン(BZ)またはLY-411575である、請求項35記載の分化培地。
- 糖質コルチコイドが、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾンから選択される、請求項23~36のいずれか一項記載の分化培地。
- TGF-β阻害剤が、ALK4、ALK5またはALK7の阻害剤である、請求項23~37のいずれか一項記載の分化培地。
- ALK4、ALK5またはALK7の阻害剤が、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511からなる群より選択される、請求項38記載の分化培地。
- BMP経路活性化剤をさらに含む、請求項23~39のいずれか一項記載の分化培地。
- BMP経路活性化剤が、BMP7、BMP4およびBMP2の1つまたは複数から選択される、請求項40記載の分化培地。
- ガストリンをさらに含む、請求項23~41のいずれか一項記載の分化培地。
- 受容体チロシンキナーゼリガンドとしてのEGF、FGF19およびHGF、
notch阻害剤としてのDAPT、
Wnt阻害剤としてのIWP2およびiCRT3、
糖質コルチコイドとしてのデキサメタゾン、
GSK-3阻害剤としてのCHIR99021、ならびに
AP-1刺激剤としてのカルバコール
を含む、請求項42記載の分化培地。 - B27、レチノイン酸を含まないB27、およびN2からなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む、請求項23~43のいずれか一項記載の分化培地。
- 細胞を細胞外マトリックスと接触させて培養する、請求項1~22のいずれか一項記載の方法。
- 分化した細胞集団または分化したオルガノイドを取得および/または単離する工程をさらに含む、請求項1~22および45のいずれか一項記載の方法。
- 肝前駆細胞が哺乳動物肝前駆細胞である、請求項1~22および45~46のいずれか一項記載の方法。
- 肝前駆細胞が肝上皮幹細胞である、請求項1~22および45~47のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1~22および45~48のいずれか一項記載の方法によって得ることのできるまたは得られるオルガノイド。
- ヒト由来であり、かつ少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも99%の細胞が肝細胞マーカーを発現する、請求項49記載のオルガノイド。
- マウスに由来し、かつ少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも99%の細胞が肝細胞マーカーを発現する、請求項49記載のオルガノイド。
- 請求項49~51のいずれか一項記載のオルガノイドと、請求項23~44のいずれか一項記載の分化培地とを含む、組成物。
- 創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断;組織発生学、細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織損傷および修復に関与する機構の研究;炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または細胞形質転換およびがんの病因の機構の検討における、請求項49~51のいずれか一項に定義されたオルガノイドの使用。
- 医療における使用のための、請求項49~51のいずれか一項記載のオルガノイド。
- 医療が再生医療である、請求項54記載の使用のためのオルガノイド。
- 治療用または予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法であって、
請求項49~51のいずれか一項記載の分化したオルガノイドを候補分子(または候補分子のライブラリ)と接触させる工程;
作用またはオルガノイドの変化について前記オルガノイドを評価する工程;および
前記作用を生じさせる候補分子を、潜在的な薬物または化粧品として同定する工程
を含む、方法。
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