CN111394314B - 一种肠癌类器官的培养基及培养方法 - Google Patents

一种肠癌类器官的培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种肠癌类器官的培养基及培养方法，该培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27、N‑acetylcysteine、EGF、Noggin、R‑spondin 1、Wnt3a、CHIR99021、thiazovivin、Gastrin I、青霉素链霉素混合液、Primocin。采用该培养基进行肠癌类器官的培养，能够维持原发组织的形态结构和基因特征，有效降低肠癌培养中的微生物污染风险，提高肠癌类器官培养的成功率和存活率。

Description

一种肠癌类器官的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及培养基及其应用，更具体涉及一种肠癌类器官的培养基及培养方法。
背景技术
肠癌是我国的十大恶性肿瘤之一，发病率约24/100000，也是近二三十年来发病率上升最快的肿瘤之一。肠癌包括结肠癌和直肠癌，肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端(右半结肠)发展的趋势。肠癌早期无症状，或症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等。随着癌肿发展，症状逐渐出现，表现为大便习惯改变、腹痛、便血、腹部包块、肠梗阻等，伴或不伴贫血、发热和消瘦等全身症状。近年来，欧美肠癌发病率和死亡率出现下降，我国却出现增长趋势。数据显示，我国肠癌患者的5年生存率为52.7％，显著低于欧美和日韩等国。这主要因为我国肠癌的早诊早治率远落后于国外，约60％～70％的患者确诊时已是中晚期。目前，肠癌的治疗仍旧以手术为主，同时辅以放疗及化疗等以巩固治疗效果。虽然近年来业界在肠癌靶向治疗、免疫治疗等综合治疗方面取得了长足的进展，但总体预后并不乐观。
肠癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是环境因素与遗传因素综合作用的结果。肠癌的发生发展机制错综复杂，建立一套科学严谨的研究模型不但有利于肠癌的基础研究，而且有助于肠癌的诊断与治疗，有助于提高肠癌的生存率。类器官是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。
虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养为类器官，但是目前关于肠癌类器官的培养方法的研究及报道较少，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、即培养基配方尚无太多报道。
发明内容
有鉴于此，有必要针对现有技术存在的问题，提供一种肠癌类器官的培养基及培养方法。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种肠癌类器官的培养基，包括基础培养基AdvancedDMEM/F12、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，1-5×；N-acetylcysteine，0.2-5μM；EGF，10-100ng/ml；Noggin，20-500ng/ml；R-spondin 1，100-1000ng/ml；Wnt3a，50-200ng/ml；CHIR99021，1-10μM；thiazovivin，0.5-5μM；Gastrin I，5-50ng/ml；青霉素链霉素混合液，1-2×；Primocin，0.5-5mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
优选的，所述培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，1-2×；N-acetylcysteine，1-2μM；EGF，50-80ng/ml；Noggin，100-200ng/ml；R-spondin1，200-500ng/ml；Wnt3a，100-150ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；Gastrin I，10-20ng/ml；青霉素链霉素混合液，1.2×；Primocin，2mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
进一步的，所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子用无菌水配制成混合母液，然后加入到基础培养基Advanced DMEM/F12中既得。
第二个方面，本发明提供一种肠癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜来源为肠癌的手术切除标本或活检组织进行预处理，得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团后，离心去除上清，细胞团沉淀备用；
2)将上述培养基与基质胶混合均匀后重悬步骤1)得到的细胞团沉淀，获得混有细胞的凝胶，将该凝胶接种；
3)待步骤2)的接种凝胶充分凝固后加入上述培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养；
4)每隔2-3天更换一次上述培养基，培养4-10天，得到肠癌类器官。
本发明的有益效果是：
①本发明的培养基含有肠癌类器官培养所需的最少组分，能够培养来源于结肠、直肠等多来样本源的肿瘤组织。
②本发明的培养基组分中不需要加入细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(FBS)，节约成本的同时降低了FBS中带来的细胞毒性和抑制物。
③本发明的培养基适合肠癌类器官的培养，培养的肠癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
④本发明能够有效降低肠癌培养中的微生物污染风险，提高肠癌类器官培养的成功率和存活率。
附图说明
图1为本发明实施例5中为直肠癌类器官光学显微镜图。
图2为本发明实施例7中为结肠癌类器官光学显微镜图。
图3为本发明实施例9中为直肠癌类器官组织形态结构图。
图4为本发明实施例10中为结肠癌类器官组织形态结构图。
具体实施方式
本发明实施例采用的100×青霉素链霉素混合液购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明实施例采用的两性霉素B购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明实施例采用的不含维生素A的B27购自赛默飞世尔科技有限公司。
本发明实施例采用的N-acetylcysteine购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的EGF购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Noggin购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的R-spondin 1购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Wnt3a购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的CHIR99021购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的thiazovivin购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的Gastrin I购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的Primocin购自美国Invivogen公司。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种肠癌类器官的培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，1×；N-acetylcysteine，1.5μM；EGF，50ng/ml；Noggin，200ng/ml；R-spondin 1，200ng/ml；Wnt3a，100ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；Gastrin I，15ng/ml；青霉素链霉素混合液，1.2×；Primocin，2mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例2
本实施例提供一种肠癌类器官的培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，2×；N-acetylcysteine，1μM；EGF，80ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin 1，400ng/ml；Wnt3a，80ng/ml；CHIR99021，2μM；thiazovivin，4μM；Gastrin I，10ng/ml；青霉素链霉素混合液，1×；Primocin，0.5mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例3
本实施例提供一种肠癌类器官的培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，2×；N-acetylcysteine，2μM；EGF，20ng/ml；Noggin，400ng/ml；R-spondin 1，600ng/ml；Wnt3a，150ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；Gastrin I，20ng/ml；青霉素链霉素混合液，1.2×；Primocin，2mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例4
本实施例提供一种肠癌类器官的培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，4×；N-acetylcysteine，4μM；EGF，60ng/ml；Noggin，150ng/ml；R-spondin 1，800ng/ml；Wnt3a，60ng/ml；CHIR99021，8μM；thiazovivin，1μM；Gastrin I，25ng/ml；青霉素链霉素混合液，1.8×；Primocin，4mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例5
本实施例提供一种直肠癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的直肠癌手术切除标本装入准备好的含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的AdvancedDMEM/F12培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。
5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀。
7)红细胞裂解：加入2ml红细胞裂解液至步骤(6)中的细胞团沉淀，轻轻吹打重悬细胞沉淀，室温裂解3-5min。
8)细胞收集：将步骤(6)中的液体1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
9)取适量实施例1的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤8)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
10)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
11)在培养皿内加入实施例1的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
12)每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到直肠癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图1所示。
实施例6
本实施例提供一种直肠癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的直肠癌手术活检组织装入准备好的含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的AdvancedDMEM/F12培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。
5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
7)取适量实施例2的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤6)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
8)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
9)在培养皿内加入实施例1的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
10)每隔2天更换一次培养基，培养10天后可得到直肠癌类器官。
实施例7
本实施例提供一种结肠癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的结肠癌手术切除标本装入准备好的含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的AdvancedDMEM/F12培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。
5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀。
7)红细胞裂解：加入2ml红细胞裂解液至步骤(6)中的细胞团沉淀，轻轻吹打重悬细胞沉淀，室温裂解3-5min。
8)细胞收集：将步骤(6)中的液体1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
9)取适量实施例3的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤8)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
10)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
11)在培养皿内加入实施例1的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
12)每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到结肠癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图2所示。
实施例8
本实施例提供一种结肠癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的结肠癌手术活检组织装入准备好的含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的AdvancedDMEM/F12培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的Advanced DMEM/F12培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。
5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
7)取适量实施例2的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤6)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
8)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
9)在培养皿内加入实施例41的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
10)每隔2天更换一次培养基，培养10天后可得到结肠癌类器官。
实施例9
直肠癌类器官形态鉴定
将实施例5获得直肠癌类器官进行石蜡包埋切片制备。将包埋好的类器官进行切片，然后进行HE染色观察。
1)类器官收集与固定：投入预先配好的固定液中(4％的甲醛固定)固定2小时。
完成固定后1200rpm离心5分钟，弃去福尔马林固定液。
2)梯度脱水：将固定后的类器官依次浸入85％酒精、95％酒精和100％酒精各30分钟。
3)透明浸蜡：加入二甲苯没过类器官处理20分钟，重复两次；然后加入石蜡，在60℃浸蜡1.5小时。
4)包埋切片：用包埋模具包类器官，然后切片机切成4-6μm的切片贴于防脱载玻片。
5)烤片：将载玻片放置在玻片架上，放入烘箱中，65℃，30min，将载玻片上的水分烤干、石蜡烤融即可。
6)脱蜡：使用二甲苯脱蜡三次，每次10分钟；然后用100％酒精浸洗三次，每次1分钟；最后用流水浸洗1分钟。
7)H&E染色：先用苏木素染色8min，然后水洗1min，接着用1％盐酸酒精分化1-2秒钟，然后再用流水冲洗30min，再接着用1％伊红浸染1-2min，最后用流水冲洗1min。
8)染色后固定：依次浸入95％酒精和100％酒精，每种试剂各两次，每次2分钟。
9)透明及封固：使用二甲苯透明2min，取出晾干后用中性树胶封固。
10)在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图3所示。
实施例10
结肠癌类器官形态鉴定
将实施例7获得结肠癌类器官进行石蜡包埋切片制备。将包埋好的类器官进行切片，然后进行HE染色观察。
1)类器官收集与固定：投入预先配好的固定液中(4％的甲醛固定)固定2小时。
完成固定后1200rpm离心5分钟，弃去福尔马林固定液。
2)梯度脱水：将固定后的类器官依次浸入85％酒精、95％酒精和100％酒精各30分钟。
3)透明浸蜡：加入二甲苯没过类器官处理20分钟，重复两次；然后加入石蜡，在60℃浸蜡1.5小时。
4)包埋切片：用包埋模具包类器官，然后切片机切成4-6μm的切片贴于防脱载玻片。
5)烤片：将载玻片放置在玻片架上，放入烘箱中，65℃，30min，将载玻片上的水分烤干、石蜡烤融即可。
6)脱蜡：使用二甲苯脱蜡三次，每次10分钟；然后用100％酒精浸洗三次，每次1分钟；最后用流水浸洗1分钟。
7)H&E染色：先用苏木素染色8min，然后水洗1min，接着用1％盐酸酒精分化1-2秒钟，然后再用流水冲洗30min，再接着用1％伊红浸染1-2min，最后用流水冲洗1min。
8)染色后固定：依次浸入95％酒精和100％酒精，每种试剂各两次，每次2分钟。
9)透明及封固：使用二甲苯透明2min，取出晾干后用中性树胶封固。
10)在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图4所示。
对比例1
本对比例提供的培养基中基础培养基Advanced DMEM/F12替换成DMEM，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例5方法进行直肠癌细胞类器官培养。
结果在步骤(12)培养4天后，在普通光学显微镜下随机挑选中间区域10个视野进行类器官数量与尺寸大小测定。实施例5的类器官在数量与平均尺寸上显著优于对比例1，这说明采用Advanced DMEM/F12作为基础培养基较比采用DMEM更适宜肠癌类器官的生长。
对比项 类器官数量 平均尺寸
实施例5 78个 40-45μm
对比例1 64个 25-30μm
对比例2
本对比例提供的培养基中不添加Gastrin I，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例5方法进行直肠癌细胞类器官培养。
结果在步骤(12)培养4天后发现直肠癌类器官生长缓慢，6天后将细胞进行收集，然后用台盼蓝染色计数，细胞总数量、活细胞比例显著少于实施例5。这说明特异性添加剂Gastrin I有利于肠癌类器官细胞生长。
对比项 活细胞数量 细胞总数 活细胞比例
实施例5 4.9×10<sup>7</sup> 5.3×10<sup>7</sup> 92.45％
对比例1 8.8×10<sup>6</sup> 1.2×10<sup>7</sup> 73.33％
对比例3
本对比例提供的培养基中不添加青霉素链霉素混合液和Primocin，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例5方法进行10皿直肠癌类器官培养。
结果在步骤(12)培养6天后，有2个培养皿出现培养基变浑浊，出现些许白色漂浮物，在普通光学显微镜下观察到细胞间出现灰白色细小菌落，培养失败。培养10天后，有2个培养皿出现生长缓慢，破碎细胞多导致培养失败的情况，取样用支原体检测试剂盒进行支原体检测，结果为阳性。这说明青霉素链霉素混合液和Primocin的添加有效降低肠癌类器官培养中的微生物污染风险，提高肠癌类器官培养的成功率和存活率。
对比例4
本对比例提供的培养基中不添加CHIR99021和thiazovivin，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例5方法进行直肠癌细胞类器官培养。
结果在步骤(12)培养6天后，培养的细胞出现大面积死亡的情况，无法形成正常的分化状球形或管状类器官结构。这说明CHIR99021和thiazovivin对肠癌类器官形态结构的维持是不可或缺的。
对比例5
将实施例1的培养基用于胃癌类器官的培养，参照实施例5)培养10天后，胃癌细胞生长缓慢，在普通光学显微镜下只能看到少量细胞，无法观察到正常胃癌类器官结构。
综上，本发明的培养基适用广泛，能够培养来源于结肠、直肠和胃等多来样本源的肿瘤组织；组分中不需要加入细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(FBS)，节约成本的同时降低了FBS中带来的细胞毒性和抑制物。本发明的培养基适合肠癌类器官的培养，培养的肠癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。此外，本发明的培养基能够有效降低肠癌培养中的微生物污染风险，提高肠癌类器官培养的成功率和存活率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种肠癌类器官的培养基，其特征在于：由基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水组成；其中，所述基础培养基Advanced DMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子的组成为：不含维生素A的B27，1-5×；N-acetylcysteine，0.2-5μM；EGF，10-100ng/ml；Noggin，20-500ng/ml；R-spondin 1，100-1000ng/ml；Wnt3a，50-200ng/ml；CHIR99021，1-10μM；thiazovivin，0.5-5μM；Gastrin I，5-50ng/ml；青霉素链霉素混合液，1-2×；Primocin，0.5-5mg/ml；所述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
2.根据权利要求1所述的一种肠癌类器官的培养基，其特征在于：所述培养基由基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水组成；其中，所述基础培养基AdvancedDMEM/F12和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子的组成为：不含维生素A的B27，1-2×；N-acetylcysteine，1-2μM；EGF，50-80ng/ml；Noggin，100-200ng/ml；R-spondin1，200-500ng/ml；Wnt3a，100-150ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；Gastrin I，10-20ng/ml；青霉素链霉素混合液，1.2×；Primocin，2mg/ml；所述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
3.根据权利要求1或2所述的一种肠癌类器官的培养基，其特征在于：所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子用无菌水配制成混合母液，然后加入到基础培养基AdvancedDMEM/F12中即得。
4.一种肠癌类器官的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将新鲜来源为肠癌的手术切除标本或活检组织进行预处理，得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团后，离心去除上清，细胞团沉淀备用；
2)将权利要求1～3任意一项所述的培养基与基质胶混合均匀后重悬步骤1)得到的细胞团沉淀，获得混有细胞的凝胶，将该凝胶接种；
3)待步骤2)的接种凝胶充分凝固后加入权利要求1～3任意一项所述的培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养；
4)每隔2-3天更换一次权利要求1～3任意一项所述的培养基，培养4-10天，得到肠癌类器官。
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