CN112841168B

CN112841168B - 一种组织保存液及其应用

Info

Publication number: CN112841168B
Application number: CN202011633153.1A
Authority: CN
Inventors: 陈泽新; 朱宇; 李刚; 黄敏
Original assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112841168A

Abstract

本发明提供一种组织保存液及其应用。所述组织保存液包括基础培养液和添加因子；所述添加因子至少包括以下终浓度的组分：N‑acetylcysteine，0.2‑5μM；吲哚‑3‑乳酸：100‑1000μM；Y‑27632 10‑100μM；GDF11 10‑100ng/ml；青霉素链霉素混合液，1‑5×；Primocin，0.5‑5mg/ml。该组织保存液应用在离体组织进行原代培养前保存中。保存方法包括：将组织离体后完全浸入上述的组织保存液中，于2～8℃保存。本发明的组织保存液对正常组织在离体后的有效保存期超过12小时，肿瘤组织及其细胞在离体后的有效保存期超过48小时，并且经过长时间保存的组织仍然能保持较高的细胞活力并保持细胞发育特征，显著提高原代细胞培养成功率。此外，本发明的组织保存液对于需要较长时间保存的原代培养标本，尤其是珍贵的临床标本具有重要意义。

Description

一种组织保存液及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种组织保存液及其应用。

背景技术

原代培养是重要的研究方法，包括贴壁培养、悬浮培养、3D培养等多种方法。但是原代培养的成功率与来源组织样本活性具有极大的相关性。但由于组织离体后，受到多种因素影响导致细胞活性降低甚至死亡，使得原代培养的预处理过程中无法获得足量具有活性的细胞，进而导致培养失败。例如，细胞离体后由于与体内其他细胞或细胞外机制的接触的丧失，诱导相关凋亡机制的调控，造成失巢凋亡。此外，类器官在离体后，由于失去血供而导致细胞缺氧，造成细胞代谢异常，进而引起细胞凋亡。

人源样本离体后，往往需要在短时间内进行处理及培养以提高成功率，一旦样本立体时间超过4小时，就容易导致培养失败。目前的细胞保存体系主要分为含血清与无血清两种，其中含血清保存液由于血清成分的差异，其保存效果具有不稳定性，且血清中的某些细胞因子会导致细胞的分化，改变原代细胞的发育状态，导致培养后的细胞与来源组织具有较大差异，失去来源个体的代表性。无血清培养基存在体系简单(以基础培养基为主)，无法避免失巢凋亡，组织样本保存时间短等特征。综上，目前的细胞保存体系无法较长期地保留细胞活性与来源组织的特征，成为原代细胞培养成功的重要障碍。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种组织保存液及其应用以解决上述问题。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种组织保存液，包括基础培养液和添加因子；所述添加因子至少包括以下终浓度的组分：N-acetylcysteine，0.2-5μM；吲哚-3-乳酸：100-1000μM；Y-27632 10-100μM；GDF11 10-100ng/ml；青霉素链霉素混合液，1-5×；Primocin，0.5-5mg/ml。

优选地，所述添加因子还包括以下终浓度的组分：EGF，10-100ng/ml；CHIR99021，1-10μM。

优选地，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。

进一步地，所述组织保存液的制备方法为：将添加因子加入到基础培养基中混合均匀即得。

第二个方面，本发明提供上述组织保存液在对离体组织进行原代培养前保存中的应用。

进一步地，所述离体组织包括肿瘤组织及其细胞与常规组织。

第三个方面，本发明提供一种离体组织的保存方法，包括：将组织离体后完全浸入上述的组织保存液中，于2～8℃保存。

进一步地，所述保存方法中，对常规组织的有效保存时间达到12h以上，对肿瘤组织及其细胞的有效保存时间达到48h以上。

本发明的有益效果是：

本发明的组织保存液对正常组织在离体后的有效保存期超过12小时，肿瘤组织及其细胞在离体后的有效保存期超过48小时，并且经过长时间保存的组织仍然能保持较高的细胞活力并保持细胞发育特征，显著提高原代细胞培养成功率。此外，本发明的组织保存液对于需要较长时间保存的原代培养标本，尤其是珍贵的临床标本具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1培养的小鼠肝类器官光学显微镜图片。

图2为本发明对比例1培养的小鼠肝类器官光学显微镜图片。

图3为本发明实施例2和对比例2的基因表达检测结果。

图4为本发明实施例3培养的小鼠肺类器官光学显微镜图片。

图5为本发明实施例6培养的胃癌类器官光学显微镜图片。

具体实施方式

本发明实施例采用的Advanced DMEM/F12培养基购自GIBCO公司。

本发明实施例采用的N-acetylcysteine购自Sigma公司。

本发明实施例采用的吲哚-3-乳酸购自Macklin公司。

本发明实施例采用的Y-27632购自Abmole Bioscience公司。

本发明实施例采用的青霉素链霉素混合液购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

本发明实施例采用的Primocin购自Invivogen公司。

本发明实施例采用的EGF购自Novoprotein公司。

本发明实施例采用的CHIR99021购自Sigma公司。

本发明实施例采用的GDF11购自Neobioscience公司。

此外，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种小鼠肝组织的保存及培养方法，所涉及的组织保存液包括Advanced DMEM/F12培养基和添加因子；所述添加因子包括以下终浓度的组分：N-acetylcysteine，5μM；吲哚-3-乳酸：100μM；Y-27632 100μM；GDF11100ng/ml；青霉素链霉素混合液，5×；Primocin，5mg/ml，将添加因子加入到基础培养基中混合均匀即得。保存及培养方法具体包括以下步骤：

(1)将小鼠处死后，在生理盐水中浸泡10min，在酒精中浸泡30s，解剖后取肝脏，用手术剪剪切为约2mm³的小块，将这些小块置于前述的组织保存液中，于4℃保存12小时；

(2)然后在步骤(1)的组织保存液中加入10ml胶原酶重悬，转移至37℃、220rpm摇床消化20min，用100um细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。取5ml红细胞裂解液重悬细胞5min。然后离心(4℃，200g,5min)，去除上清，加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。细胞计数，混合matrigel，20000个细胞每40ul，滴于48孔孔正中，放置培养皿于37℃、5％CO₂条件下10min，凝固Martrigel。每孔加入150μl条件培养基，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养7天，培养过程中每3-4天更换条件培养基，持续进行镜下观察类器官形成及增殖。对比例1为本实施例的对比试验案例，两组各观察7天后，图1为实施例1小鼠肝类器官的结果，图2为对比例1小鼠肝类器官的结果，两者基本无差异。从图中可以看出，保存12小时后，小鼠肝组织仍能培养出正常的肝类器官。

实施例2

本实施例提供一种小鼠肠癌组织的保存及培养方法，所涉及的组织保存液包括Advanced DMEM/F12培养基和添加因子；所述添加因子包括以下终浓度的组分：N-acetylcysteine，2μM；吲哚-3-乳酸：500μM；Y-27632 50μM；青霉素链霉素混合液，3×；Primocin，2mg/ml；EGF，50ng/ml；CHIR99021，5μM；GDF11 40ng/ml将添加因子加入到基础培养基中混合均匀即得。保存及培养方法具体包括以下步骤：

(1)取肠癌PDX小鼠模型一只，处死后解剖获取肿瘤组织。手术剪剪碎为2mm³的小块，将这些小块置于前述的组织保存液中，于4℃保存48小时；

(2)通过爬片法分离肿瘤细胞，收集肿瘤细胞后使用DMEM/F12培养基重悬，细胞计数，并计算细胞获率，然后将细胞接种至48孔板中，每孔加入150μl条件培养基，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养7天，培养过程中每3-4天更换条件培养基，持续镜下观察细胞增殖及细胞状态。对比例2为本实施例的对比试验案例，两组培养7天后，收集细胞进行qPCR基因表达分析，分析实施例2和对比例2的细胞与来源组织的同源性。如图3所示，从结果可以看出，用本发明保存液保存后培养的类器官维持了原组织的基因表达特性，且与对比例2未保存的组织基因表达特性基本相同。

实施例3

本实施例提供一种小鼠肺组织的保存及培养方法，所涉及的组织保存液包括Advanced DMEM/F12培养基和添加因子；所述添加因子包括以下终浓度的组分：N-acetylcysteine，0.2μM；吲哚-3-乳酸：1000μM；Y-27632 10μM；GDF1110ng/ml；青霉素链霉素混合液，1×；Primocin，0.5mg/ml，将添加因子加入到基础培养基中混合均匀即得。保存及培养方法具体包括以下步骤：

(1)将小鼠处死后，在生理盐水中浸泡10min，在酒精中浸泡30s，解剖后取肺，并尽量剥离支气管，收获肺实质组织，用手术剪剪切为约1mm³的小块，将这些小块置于前述的组织保存液中，于4℃保存12小时；

(2)然后在步骤(1)的组织保存液中加入10ml胶原酶重悬，转移至37℃、220rpm摇床消化20min，用100um细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。取5ml红细胞裂解液重悬细胞5min。然后离心(4℃，200g,5min)，去除上清，加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。细胞计数，混合matrigel，20000个细胞每40ul，滴于48孔孔正中，放置培养皿于37℃、5％CO₂条件下10min，凝固Martrigel。每孔加入150μl条件培养基，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养7天，培养过程中每3-4天更换条件培养基，图4为培养得到的小鼠肺类器官，结构形态良好。

实施例4

本实施例提供一种人肺癌组织的保存及培养方法，所涉及的组织保存液包括Advanced DMEM/F12培养基和添加因子；所述添加因子包括以下终浓度的组分：N-acetylcysteine，2μM；吲哚-3-乳酸：500μM；Y-27632 50μM；青霉素链霉素混合液，3×；Primocin，2mg/ml；EGF，10ng/ml；CHIR99021，10μM；GDF11 80ng/ml将添加因子加入到基础培养基中混合均匀即得。保存及培养方法具体包括以下步骤：

取人肺癌手术标本，用手术剪剪碎为2mm³的小块，将这些小块分成多管置于前述的组织保存液中，于4℃保存，在第0、12、24、36、48、60和72小时分别取组织消化成细胞悬液，并通过细胞计数仪统计单位重量的组织收获的细胞数及活率，结果如表1所示。从结果可以看出，离体后，活细胞比例在不断下降，但是在本发明保存液中肿瘤细胞在离体后的有效保存期超过48小时。

表1不同保存时间下人肺癌细胞总量及活细胞比例

实施例5

本实施例提供实施例1的组织保存液在不同时间段对大鼠肠组织的细胞数及活率考察，具体试验过程如下：

取大鼠的肠组织，将组织剪碎至2mm³大小后，将这些小块分成多管置于实施例1的组织保存液中，于4℃保存，在第0、12、18、24、30和36小时分别取组织消化成细胞悬液，并通过细胞计数仪统计活细胞比率。结果如表2所示，从结果可以看出，在本发明保存液中正常组织在离体后的有效保存期超过24小时。

表2不同保存时间下大鼠肠组织细胞的活细胞比例

分组	保存时间	活细胞比例
			1	0	94.12％
2	12h	92.38％
			3	18h	90.84％
4	24h	87.38％
			5	30h	74.27％
6	36h	70.24％

实施例6

本实施例提供实施例2的组织保存液用于人胃癌组织的保存和培养测试，具体试验过程如下：

保存及培养方法具体包括以下步骤：

取人胃癌手术标本，用手术剪剪碎为2mm³的小块，将这些小块置于实施例2的组织保存液中，于4℃保存48小时后，通过爬片法分离肿瘤细胞，收集肿瘤细胞后使用DMEM/F12培养基重悬，细胞计数，并计算细胞获率，然后将细胞接种至48孔板中，每孔加入150μl条件培养基，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，培养过程中每3-4天更换条件培养基，培养8天后得到胃癌类器官如图5所示，结构形态良好。

对比例1

本对比例提供一种小鼠肝组织的培养方法，与实施例1的区别在于未采用组织保存液保存，而是直接将2mm³的组织小块进行步骤(2)的过程。

对比例2

本对比例提供一种小鼠肠癌组织的培养方法，与实施例2的区别在于未采用组织保存液保存，而是直接将2mm³的组织小块进行步骤(2)的过程。培养7天后收集细胞进行qPCR基因表达检测，分析实施例1和对比例1的细胞与来源组织的同源性。结论见实施例2部分。

对比例3

本对比例提供一种小鼠肝组织的培养方法，与实施例1的区别在于采用组织保存液保存去掉吲哚-3-乳酸，其他组分一样，在本对比例保存液4℃保存12小时后按实施例1的方法进行小鼠肝类器官培养，结果培养7天后，无法观察到正常的小鼠肝类器官，细胞基本死亡。这说明吲哚-3-乳酸对维持组织细胞活性有关键作用。

对比例4

本对比例提供一种人肺癌组织的培养方法，与实施例4的区别在于采用组织保存液保存去掉GDF11，其他组分一样，在本对比例保存液4℃保存48小时后按实施例4的方法进行细胞活率测定，结果活细胞比例为62.35％，显著低于实施例4的86.95％。这说明GDF11对维持组织细胞活性有明显作用。

综上，本发明组织保存液的特点如下：

①本发明的组织保存液可以使离体组织较长期地在2-8℃环境下保存并保留其活性与分化特征。

②组分中不需要常见的组织保存体系中所需要的胎牛血清(FBS)，从而降低了血清的批间不稳定性导致的效果差异以及血清中的特异性因子引起的细胞分化。

③本发明可用于多种组织的保存并用于原代培养用途，包括正常消化道、呼吸道、实体脏器组织及多种肿瘤组织，并在不同组织的保存效果上未见差异。

④本发明能够有效降低原代培养中的微生物污染风险，提高原代培养的成功率和存活率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种组织保存液，其特征在于：包括基础培养基和添加因子；所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基；所述添加因子至少包括以下终浓度的组分： N-acetylcysteine，0.2-5μM；吲哚-3-乳酸：100-1000μM；Y-27632 10-100μM；GDF11 10-100ng/ml；青霉素链霉素混合液，1-5×；Primocin，0.5-5mg/ml；所述组织包括离体肿瘤组织及其细胞与离体常规组织。

2.根据权利要求1所述的一种组织保存液，其特征在于：所述添加因子还包括以下终浓度的组分：EGF，10-100 ng/ml；CHIR99021，1-10μM。

3.根据权利要求1或2所述的一种组织保存液，其特征在于：所述组织保存液的制备方法为：将添加因子加入到基础培养基中混合均匀即得。

4.权利要求1~3任意一项所述的一种组织保存液在对离体组织进行原代培养前保存中的应用，所述离体组织包括肿瘤组织及其细胞与常规组织。

5.一种离体组织的保存方法，其特征在于：包括：将组织离体后完全浸入权利要求1~3任意一项所述的组织保存液中，于2~8℃保存，所述离体组织包括肿瘤组织及其细胞与常规组织。

6.根据权利要求5所述的一种离体组织的保存方法，其特征在于：所述保存方法中，对常规组织的有效保存时间达到12h以上，对肿瘤组织及其细胞的有效保存时间达到48h以上。