CN109321519A - Cho-k1悬浮驯化培养基及驯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种CHO‑K1悬浮驯化培养基及驯化方法，所述培养基至少包括：CD CHO Medium、IGF‑1、泊洛沙姆188、条件培养基（Condition Medium）。采用上述培养基驯化CHO‑K1细胞使得细胞培养时间短（小于2个月），扩增速度快，细胞不结团且活率高。

Description

CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法
技术领域
本发明涉及一种CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法，属于生物技术领域。
背景技术
CHO，是1957年美国科罗拉多大学Dr.Theodore T.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是生物工程上广泛使用的细胞。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。可形成有活性的二聚体(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO)，CHO为表达复杂生物大分子的理想宿主。
工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。该细胞可从各大保藏中心采购或者各个实验室保存的细胞获得。
该细胞系通常是在10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)中培养。细胞在贴壁培养时，生长数量依赖于培养面积，即使在融合率90％以上，单位面积的细胞密度很难超过105cells/m，而且传统的贴壁培养模式中，需要在培养基中添加10％的优质胎牛血清，一方面增加了培养成本，另一方面由于血清中很容易携带外源病毒、补体等物质而导致细胞的培养效果不稳定或者引入安全风险。所以，在现在生物医药开发中，通常将贴壁血清培养的CHO-K1细胞悬浮驯化至无血清悬浮高密度生长。但由于目前没有效果突出的驯化培养基及驯化方法，导致贴壁悬浮驯化过程漫长(5-10个月)且存在较大的失败概率，即使驯化成功，也容易出现细胞易结团、活率低、倍增时间长等缺点。
因此，提供一种性能优异的培养基及培养方法十分必要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法，用于解决现有技术中CHO-K1培养时间长、易结团、活率低、以及倍增时间长的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种CHO-K1悬浮驯化无血清培养基，所述培养基至少包括以下重量份的组分：
CD CHO Medium：为一款商业化无血清培养基，且化学成分限定(Chemicallydefined)，是目前市场上最常用地CHO-K1细胞悬浮培养基。
IGF-1：为大肠杆菌表达的重组蛋白，为胰岛素的替代物，价格较胰岛素便宜数十倍，且不是动物源成分，无外源病毒引入的风险。
泊洛沙姆188：Poloxamer188，聚氧乙烯聚氧丙烯，为常用药用辅料，被用作乳化剂或者增溶剂。其低浓度下溶液可以有效地减少细胞接团现象。
所述血清为FBS。
条件培养基：Condition Medium(CM)，条件培养基。细胞培养3-4天后，通过离心或者过滤去除细胞后的上清，此上清中含有细胞生长过程中分泌的一些因子，对细胞的生长和分裂有促进作用。所述条件培养基为CHO-K1细胞的条件培养基，制备条件培养基的初始培养基可以为F-12K培养基或者其他适于培养CHO-K1的培养基。
本发明的另外一个方面提供了一种CHO-K1悬浮驯化培养基，所述CHO-K1悬浮驯化培养基为采用上述无血清培养基添加不超过无血清培养基总重量10％的血清获得。
本发明的另一方面，提供了上述培养基的制备方法，包括以下步骤：将各组分按配比混合，即可。
本发明的另一方面，提供了上述两种培养基用于CHO-K1细胞驯化培养的用途。
本发明的另外一个方面提供了一种CHO-K1细胞驯化方法，所述方法至少包括以下步骤：
(1)对CHO-K1细胞贴壁降血清三级培养，降血清三级培养是指对CHO-K1细胞分3次培养，且每次培养时逐次降低培养基中的血清添加量至血清的添加量为培养基总重量的1～3％；
(2)悬浮驯化：将CHO-K1细胞置于如权利要求1所述的培养基中悬浮培养；所述培养基中血清的添加量为无血清培养基重量的1～3％；
(3)悬浮除血清培养：将CHO-K1细胞依次置于血清的添加量为无血清培养基重量的1～3％的如权利要求2所述的培养基、如权利要求1所述的培养基、按权利要求1所述的培养基减除IGF-1、泊洛沙姆188及血清成分配制的M培养基中培养。
所述步骤(1)中三级培养中初级培养时采用添加了常规量血清的培养基培养，第二次培养时，培养基中添加了培养基重量4～8％血清，更优选是5％。
通常情况下，初次培养时采用添加了培养基重量10％血清的培养基。培养基可以采用普通的常用培养基F-12K培养基。
一般地，所述步骤(1)、(2)以及(3)中每次培养细胞至细胞传代2～3次后进入后续步骤。
较佳地，所述步骤(2)中培养时培养基中血清含量与步骤(1)中第三级培养时培养基中血清含量相同。
较佳地，所述步骤(2)中培养时培养基中血清重量含量为2.5％。
进一步地，所述步骤(1)中培养条件为36～38℃，体积分数为5～8％CO2，pH为7.0～7.4，培养箱静置培养，所述步骤(2)中培养条件为36～38℃，体积分数为5～8％CO2，pH为7.0～7.4，置于摇床中培养，转速为110～130rpm，所述步骤(3)中培养条件为36～38℃，体积分数为5～8％CO2，pH为7.0～7.4，置于摇床中培养，转速为110～130rpm。
较佳地，所述步骤(2)中培养时，当细胞密度低于5×105cells/ml或者细胞活率低于50％，应加入细胞至活细胞数不低于10×105cells/ml。
进一步地，所述步骤(3)还包括将细胞在M培养基培养之后置于CD CHO Medium中培养。
进一步地，所述步骤(2)以及(3)中培养时向培养基中添加L-glutamine，所述L-glutamine的添加终浓度为4～8mmol/L。
如上所述，本发明的CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法，具有以下有益效果：
采用本申请的培养基使得细胞培养时间短(小于2个月)，扩增速度快，细胞不结团且活率高。
附图说明
图1显示为阶段I中细胞在含10％FBS的F-12K培养基中状态图。
图2显示为阶段I中细胞在含5％FBS的F-12K培养基中状态图。
图3显示为阶段I中细胞在含2.5％FBS的F-12K培养基中状态图。
图4显示为阶段I中细胞密度、细胞活率和倍增时间曲线图。
图5显示为阶段II中细胞密度、细胞活率和倍增时间曲线图。
图6显示为阶段III中细胞密度、细胞活率和倍增时间曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1
一、材料与方法
1.1实验试剂与细胞株
品名 品牌 货号 级别
CHO-K1 ATCC CCL-61 NA
CD CHO Medium Gibco 10743 细胞培养级
重组表达IGF-1 PrimerGenen 105-03 细胞培养级
泊洛沙姆188 Sigma P2164009 分析纯
FBS Gibco 10099 NA
L-glutamine Gibco 25030 细胞培养级
F-12K ATCC 30-2004 细胞培养级
1.2主要仪器设备
1.4实验方法
1.4.1阶段I：贴壁降血清
将CHO-K1细胞在含有10％FBS的F-12K培养基中培养，当细胞汇合度到70～80％时，加胰酶消化，缓慢吹打混匀，以0.4×105cells/ml的密度接种至10ml含10％FBS的F-12K培养基中传代，并观察细胞状态(图1)。此阶段培养条件为37℃，体积分数为8％CO2培养箱，静止培养。当细胞汇合度到70～80％，加胰酶消化并以同样的密度接种至10ml含5％FBS的F-12K培养基中。培养两代后(见图2)，用同样的方法将血清逐步降低至2.5％，培养3代，随着血清含量降低，起初细胞生长变慢，待细胞轮廓清晰、伸展状态良好之后，开始下一步降血清处理，通常细胞适应2-3代后，在血清降至2.5％之前，细胞都可以很快地扩增(图3)。
细胞密度、细胞活率和倍增时间曲线见图4。
表1贴壁降血清培养阶段活细胞密度、细胞活率和倍增时间
1.4.2阶段II悬浮驯化
条件培养基(Condition Medium，CM)制备：细胞在含有2.5％FBS的F-12K培养基2-3天后，收集培养上清200g离心5分钟后，用0.22um的无菌滤膜过滤后待用。
细胞在含有2.5％FBS的F-12K培养基中培养3代，细胞汇合度到70～80％时，用PBS洗两遍，加入胰酶消化，消化30秒后弃去胰酶，待细胞消化变圆以后，加入完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使细胞从壁上脱落。缓慢吹打混匀，室温下，200g水平离心5mins，收集细胞(上清可保留用于制备CM)。将细胞接种到含有2.5％FBS的培养基(含重量比例为48.5％CD CHO Medium，1％IGF-1，0.5％的泊洛沙姆188，50％的条件培养基和6mM L-glutamine)的125ml摇瓶(Shake Flask,SF)中，接种密度为10×105cells/ml，培养体积为30ml。将摇瓶置于37℃，8％CO2，120转/分钟(round per minute,rpm)的细胞培养摇床中进行培养。
每天取样计数，观察活细胞数(Viable Cell Density，VCD)和细胞活率(Viability)。如果出现细胞密度低于5×105cells/ml或者细胞活率低于50％，应将原培养条件下贴壁细胞消化后加入细胞至活细胞数至10×105cells/ml，一起培养。活细胞数增加至10×105cells/ml以上，则以8×105cells/ml接种含有2.5％FBS的培养基(含重量比例为48.5％CD CHOMedium，1％IGF-1，0.5％的洛沙姆188，50％的条件培养基和6mM L-glutamine)传代，传代2次。活细胞密度和细胞活率曲线见图5
表2细胞悬浮驯化中活细胞密度、细胞活率和倍增时间
1.4.3阶段III悬浮除血清
待细胞在含2.5％FBS的CD CHO培养基中倍增后，以6×105cells/ml的密度接种于含1％FBS的培养基(含重量比例为48.5％CD CHO Medium，1％IGF-1，0.5％的泊洛沙姆188，50％的条件培养基和6mM L-glutamine)。
取1％FBS条件下细胞培悬液以200g水平离心5mins，收集上清，经0.22μM的一次性过滤器过滤，作为此阶段条件培养基，备用。
培养1代以后，细胞以8×105cells/ml培养密度，接种于无血清的培养基(含重量比例为48.5％CD CHO Medium，1％IGF-1，0.5％的泊洛沙姆188，50％的条件培养基和6mML-glutamine)，培养体积为30ml，培养2代。此阶段培养环境：37℃，8％CO2摇床，120rpm(转每分钟)培养。以5×105cells/ml接种于培养基(含重量比例为48.5％CD CHO Medium，含50％的条件培养基和6mM L-glutamine)。培养2天后，以4×105cells/ml接种于培养基(含重量比例为48.5％CD CHO Medium，6mM L-glutamine)细胞可以正常稳定悬浮培养，培养2代后，倍增时间为18.37小时。待细胞折光性好、呈光滑圆形等状态良好之后，开始下一步操作。通常细胞适应2-3代后，细胞都可以良好地生长。
活细胞密度和细胞活率曲线见图6.
表3细胞悬浮除血清中活细胞密度、细胞活率和细胞倍增时间
可见，经过42天驯化培养，CHO-K1由在含10％FBS血清的F-12K培养基中贴壁培养驯化至在无血清的CD CHO Medium中悬浮培养，细胞活率维持在90％以上，细胞倍增时间(PDT)约18小时，无细胞结团现象。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种CHO-K1悬浮驯化无血清培养基，其特征在于，所述培养基至少包括以下重量份的组分：
2.一种CHO-K1悬浮驯化培养基，其特征在于，所述CHO-K1悬浮驯化培养基为将权利要求1所述无血清培养基添加不超过无血清培养基总重量10％的血清获得。
3.一种CHO-K1细胞驯化方法，所述方法至少包括以下步骤：
(1)对CHO-K1细胞贴壁降血清三级培养，降血清三级培养是指对CHO-K1细胞分3次培养，且每次培养时逐次降低培养基中的血清添加量至血清的添加量为无血清培养基总重量的1～3％；
(2)悬浮驯化：将CHO-K1细胞置于如权利要求2所述的培养基中悬浮培养；所述培养基中血清添加量为无血清培养基重量的1～3％；
(3)悬浮除血清培养：将CHO-K1细胞依次置于血清添加量为无血清培养基重量的1～3％的如权利要求2所述的培养基、权利要求1所述的培养基、按权利要求1所述的培养基减除IGF-1、泊洛沙姆188成分配制的M培养基中培养。
4.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中三级培养中初级培养时采用添加了常规量血清的培养基培养，第二次培养时，培养基中添加了无血清培养基重量4～8％血清。
5.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)以及(3)中每次培养细胞至细胞传代2～3次后进入后续步骤。
6.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中培养条件为36～38℃，体积分数为5～8％CO2，pH为7.0～7.4，培养箱中静置培养，所述步骤(2)中培养条件为36～38℃，体积分数为5～8％CO2，pH为7.0～7.4，置于摇床中培养，转速为110～130rpm，所述步骤(3)中培养条件为36～38℃，体积分数为5～8％CO2，pH为7.0～7.4，置于摇床中培养，转速为110～130rpm。
7.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中培养时，当细胞密度低于5×105cells/ml或者细胞活率低于50％，应加入细胞至活细胞数不低于10×105cells/ml。
8.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法，其特征在于：所述步骤(3)还包括将细胞在M培养基中培养之后置于CD CHO Medium中培养。
9.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法，其特征在于：所述步骤(2)以及(3)中培养时向培养基中添加L-glutamine，所述L-glutamine的添加终浓度为4～8mmol/L。
10.如权利要求1所述的CHO-K1悬浮驯化无血清培养基以及如权利要求2所述的CHO-K1悬浮驯化培养基用于CHO-K1细胞驯化培养的用途。
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