CN104164405A

CN104164405A - 一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系

Info

Publication number: CN104164405A
Application number: CN201410394557.8A
Authority: CN
Inventors: 郑敦武; 莫筱萦; 罗晴燕; 梁心田; 杨燕燕; 胡红; 姜莎莎; 徐文静
Original assignee: Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2014-11-26

Abstract

本发明涉及一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系，所述的无血清培养体系包含以下各成分：基础培养基a-MEM、细胞因子、激素与蛋白、不饱和脂肪酸、抗氧化物、能量物质、氨基酸添加物、维生素、金属添加物。本发明的无血清培养体系成分简单清晰，无病原体的危害；无批次之间的差异，重复性好；可在短时间获得大量优质的人脐带间充质干细胞，且传代稳定性高，因此可应用于科学研究，还可作为细胞治疗中的配套体系，为细胞治疗提供高纯度和有活力的细胞。

Description

一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系

技术领域

本发明涉及一种生物培养基，具体地说，涉及一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系。

背景技术

近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作领域扩展到研究和商业利用等多个方面。许多生物技术研究和产品都离不开细胞培养。在细胞培养发展史中，培养基的发展占有重要位置。间充质干细胞是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。大量实验证明，长期培养后的间充质干细胞具有广泛的分化潜能，形成的终末组织包括脑、视网膜、肝、肠、脾、骨髓、血液、皮肤、软骨等。说明间充质干细胞具有跨胚层分化的能力，且在适当的培养环境下，能诱导多种细胞分化。

对于间充质干细胞的培养，目前还没有统一的方案。程范军等采用低糖DMEM培养基，根据添加胎牛血清浓度的不同而分为2%和10%血清组，得出的结论是采用低浓度血清培养体系可有效避免间充质干细胞丧失增殖分化潜力。总之，不同培养基、不同批次的血清、不同的pH值、不同的种植密度都会影响间充质干细胞的生长。

目前，间充质干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，常用的是胎牛血清（FBS）。血清在细胞的体外培养体系中是必不可少的，它虽能提供生长因子、结合蛋白、激素，并起一定的保护作用，但其具有以下缺陷：① 成分复杂，且含有一些不利于细胞生长的因子或毒性物质，可能会影响研究结果；② 还可能存在病原体，对临床应用构成威胁；③ 不同批次之间存在差异，导致培养结果出现差异。

尽管目前已有很多无血清培养基，但还是含有少量的动物血清。市场上可以购买到少数几种人间充质干细胞无血清培养基，但基本都为国外进口，其价格昂贵（>6元/mL），培养效果不理想，且仅供研究应用，不能用于人的诊断及治疗。中国专利文献CN201210350602.0，公开日2012.12.19，公开了一种间充质干细胞无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、Hepes、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人白蛋白、2-巯基乙醇、原儿茶酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、氢化可的松、维生素C、粘接胺或重组人纤连蛋白、黄体酮、腐胺、肝素、血清素、EGF、b-FGF、PDGF-BB、IGF-I。该发明所述无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养间充质干细胞结果显示其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子均正常。然而，一方面，上述培养基成分较多，氨基酸包含L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸；维生素包含泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、内消旋肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺；脂质包含花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸、硬脂酸；微量元素包含Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ni、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ba、K，成分过于复杂，造成制备上的不便；另一方面，培养基要能够保证细胞传代的稳定性，以满足科研的需要，关于上述培养基传代的稳定性尚不清楚。

综上所述，亟需一种成分简明、传代稳定性好的间质干细胞无血清培养基。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系，所述的无血清培养体系包含以下质量比的各成分：

优选地，所述的无血清培养体系包含以下质量比的各成分：

更优选地，所述的无血清培养体系包含以下质量比的各成分：

优选地，所述的基础培养基a-MEM为OriCell^TM MEM极限必需培养基。

优选地，所述的非必需氨基酸的成分为：

。

更优选地，所述的非必需氨基酸的成分为：

。

所述的无血清培养体系pH：7.0-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素：<0.5EU/mL。

本发明优点在于：

1、成分简单清晰，无病原体的危害；

2、无批次之间的差异，重复性好；

3、可在短时间获得大量优质的人脐带间充质干细胞，且传代稳定性高。

可见本发明的培养体系能应用在科学研究，还可作为细胞治疗中的配套体系，为细胞治疗提供高纯度和有活力的细胞。

【附图说明】

附图1是A组和B组每代细胞的增殖倍数。

附图2是A组和B组每代细胞理论总数。

附图3是A组和B组细胞倍增时间。

附图4是A组和B组细胞形态。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的无血清培养体系各组分及各组分的含量可以在下表所示的范围内：

。

所述的基础培养基a-MEM为动物细胞培养常规基础培养基，以下实施例中具体使用的是赛业(广州)生物科技有限公司（Cyagen）的产品：OriCell^TM Minimum Essential Medium，OriCell^TM MEM极限必需培养基，Cat. No. ME-10001-500。

产品描述：OriCell^TMMinimum Essential Medium (MEM)极限必需培养基，是动物细胞培养中的常用培养基之一，主要应用于贴壁细胞的培养，经改良也可应用于悬浮细胞的培养。OriCell^TM MEM极限必需培养基可用于培养多种细胞系，包括Hela、BHK-21、HEP-2和某些原代细胞等。OriCell^TMMEM极限必需培养基内含多类细胞培养所需的氨基酸，维生素，无机盐及其他成分；但不含蛋白质，或任何生长因子；此产品需要搭配血清或无血清添加物使用。本产品仅用于非临床科研用途，不用于诊断、治疗、临床或其他用途。

产品特性：

OriCell^TM MEM极限必需培养基配方如下表所示：

。

但本领域技术人员应当知晓，凡是a-MEM基础培养基均可用于本发明，并不限于OriCell^TM MEM极限必需培养基。

所述的NEAA为非必需氨基酸，以下实施例具体使用的是赛业（苏州）生物科技有限公司的产品，其具体成分优选为：

但不仅限于此，只要在下述范围内均可：

。

其他组分，包括细胞因子、激素与蛋白、不饱和脂肪酸、抗氧化物、能量物质、维生素、金属添加物均为现有技术已有试剂，可以通过生物试剂公司购买得到，所述的GlutaMAX-I 100×购买于Gibco公司，货号为35050-061。

本发明培养基的各参数如下：

pH：7.0-7.4；

渗透压：260-320mOsm/kg；

细菌、真菌检测：阴性；

衣原体、支原体检测：阴性；

内毒素：<0.5EU/mL。

实施例1 本发明的无血清培养体系（一）

实施例2 本发明的无血清培养体系（二）

所述的无血清培养体系配方如下表所示：

。

实施例3 本发明的无血清培养体系（三）

所述的无血清培养体系配方如下表所示：

。

对比例1

实施例4 本发明的无血清培养体系的效果实验

1、试验材料

① 实施例1的无血清培养体系，简称D7；

② 灭活的人血浆，简称HS（用于培养某患者的细胞，那么血浆就由该患者自身采集得到）；

③ 脐带干细胞完全培养基（LD），购于赛业（苏州）生物科技有限公司，具体成分如下：

；

④ PBS；

⑤ 胰酶替代物；

⑥ 人脐带间质干细胞；

⑦ 无血清细胞培养六孔板，Corning Cellbind。

、试验方法

表1 实验分组

注：HS浓度为体积浓度。

实验步骤如下：

① 复苏1管人脐带间质干细胞，接种于T25细胞培养瓶中，采用脐带干细胞完全培养基（B组培养基）培养；

② 待细胞长满后，消化并收集离心，用PBS洗两遍后取样进行计数；

③ 根据计数结果，取2.5×10⁵cells接种到无血清细胞培养六孔板中的1孔，共接种2孔，每孔分别采用上述A组和B组培养基进行培养；

④ 培养次日，每孔细胞换液，每天更换一次；

⑤ 培养3-4d后即当B组细胞密度达到90%以上，拍照；其后采用胰酶替代物分别消化各孔细胞并收集，取样计数；

⑥ 根据计数结果，每组均取2.5×10⁵cells接种至新的无血清细胞培养六孔板中继续培养；

⑦ 重复上述培养和计数方法，连续培养五代以上。

、实验结果

连续培养七代，每代细胞的增殖倍数、理论总数和倍增时间结果见图1-3，细胞形态见图4。

从图1可以看出，A组与B组每代的细胞增殖倍数并无显著性差异。

从图2可以看出，A组细胞总数稳定，基本能与B组的传代节奏一致；且最终也能达到临床要求的10⁸的细胞量。

从图3可以看出，A组与B组的倍增时间均保持相对稳定。虽然A组部分大于24小时，但也符合低于72小时的产品标准。

从图4可以看出，更换培养基七代后，人脐带间质干细胞在A组依然能增殖，而且效果与B组接近。

、实验结论

本发明的无血清培养体系对于细胞生长和活性与有血清培养基相比并无显著性差异。

实施例5 本发明的无血清培养体系与其它无血清培养基的对比实验

比较实施例1-2制备的无血清培养体系与对比例1制备的无血清培养体系、专利文献CN201210350602.0的无血清培养基的优选配方培养人脐带干细胞的效果。

具体实验方法同实施例4。实施例1组使用实施例1制备的无血清培养体系+HS（5%），实施例2组使用实施例2制备的无血清培养体系+HS（5%），对比例1组使用对比例1制备的无血清培养体系+HS（5%），CN201210350602.0组使用专利文献CN201210350602.0中的最优选配方。

统计每组每代的细胞增殖倍数，结果如表2所示。实施例1和2在第1、3、5、7代的增殖倍数均高于对比例1和专利文献CN201210350602.0的无血清培养基，且差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明本发明的无血清培养体系更加有利于细胞生长繁殖，且传代稳定性高。

表2 每组每代的细胞增殖倍数（）

另外，本发明的实验重复了三次，所用的培养基及各种试剂为不同批次购买的，而得出的实验结果之间没有差异，表明其重复性好。

综上所述可见，本发明的无血清培养体系具备以下优点：1、成分简单清晰，无病原体的危害；2、无批次之间的差异，重复性好；3、可在短时间获得大量优质的人脐带间充质干细胞，且传代稳定性高。可见本发明的无血清培养体系能应用在科学研究，还可作为细胞治疗中的配套体系，为细胞治疗提供高纯度和有活力的细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系，其特征在于，所述的无血清培养体系包含以下质量比的各成分：

。

2.根据权利要求1所述的无血清培养体系，其特征在于，所述的无血清培养体系包含以下质量比的各成分：

。

3.根据权利要求2所述的无血清培养体系，其特征在于，所述的无血清培养体系包含以下质量比的各成分：

。

4.根据权利要求1-3任一所述的无血清培养体系，其特征在于，所述的基础培养基a-MEM为OriCell^TM MEM极限必需培养基。

5.根据权利要求1-3任一所述的无血清培养体系，其特征在于，所述的非必需氨基酸的成分为：

。

6.根据权利要求5所述的无血清培养体系，其特征在于，所述的非必需氨基酸的成分为：

。

7.根据权利要求1-3任一所述的无血清培养体系，其特征在于，所述的无血清培养体系pH：7.0-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素：<0.5EU/mL。