CN110462025A - 增强干细胞存活和增殖的培养基和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及改进的补充剂、培养基以及方法，它们用于增强哺乳动物干细胞的存活或增殖。特别地，向培养基中添加脂质补充剂(诸如富含脂质的载体(例如富含脂质的白蛋白))可以将干细胞的存活和/或增殖提高至少5％至65％，这是相比于不含脂质补充剂的培养基。

Description

增强干细胞存活和增殖的培养基和方法
背景技术
干细胞研究已成为一个快速发展的研究领域，具有广泛的潜在应用，包括胚胎发育，疾病建模，毒理学筛选和基于细胞的疗法的研究。自从得到第一个人胚胎干细胞系(ESC)，胚胎干细胞因其在再生医学中的潜在用途而受到广泛关注(Thomson等，1998)。胚胎干细胞看似无限的增殖能力加上它们分化成所有体细胞类型的能力使它们成为可移植人体组织的有吸引力的可再生资源。
此外，由于通过用干细胞转录因子转染细胞可以将分化的体细胞重新编程为ESC样状态的发现，实现了个性化医疗的潜力(Takahashi和Yamanaka 2006)。可以将患者特异性体细胞诱导至多能干细胞(iPSC)系，并移植回患者体内，以降低移植后免疫排斥的风险。
与任何快速发展的研究领域一样，生成iPSC的方法已变得更加有效。此外，随着非整合技术的出现，iPSC已变得更具有临床相关性(Maeder和Gersbach 2016)。这些进展加上最近开发的更易获得的基因编辑技术(ZFN，TALEN，CRISPR等)，就可以在将细胞移植回患者之前为修复疾病特异性突变铺平道路。
基因编辑也是一个快速发展的研究领域，经常发表新的应用和改良。基因编辑后细胞DNA修复机制的不可预测性质(其在大多数情况下导致基因组中特定位置的双链断裂)可导致包含不同插入缺失的靶细胞种群。当试图评估在不同的突变可以显示不同表型时经改变的基因组对细胞有何影响时，这是一个潜在的问题。为了解决该问题，可以通过从一个单细胞克隆衍生出新细胞系来获得含有相同改变的同质种群。
从单细胞获得细胞系的效率可能非常具有挑战性，人多能干细胞是克隆效率可能非常低的一个例子。
与小鼠多能干细胞不同，人多能干细胞难以作为单细胞培养，在低至克隆密度下接种单细胞可导致接种后不久发生大量细胞死亡。这归因于单细胞接种后的某些瓶颈；在初始接种中存活的细胞，其中许多细胞不会重新进入细胞周期，而那些重新进入细胞周期的细胞中许多子细胞不能存活，很少形成长期细胞增殖集落(Barbaric等，2014)。
解决与单个哺乳动物干细胞培养相关的上述问题的方法涉及包含一系列小分子抑制剂的复杂培养基配方。由于制造成本和低效率，这种培养基配方是不合适的。因此，仍然需要培养基和方法来增强体外培养物中哺乳动物干细胞的存活和/或增殖。
发明简述
本公开涉及经改进的补充物、培养基以及方法，它们用于增强哺乳动物干细胞的存活或增殖。特别地，发明人已经表明，向培养基中添加脂质补充剂，诸如富含脂质的载体(例如富含脂质的白蛋白)可以将干细胞的存活和/或增殖提高至少5％至65％(与不含脂质补充剂的培养基相比)。更具体地，向培养基中添加脂质补充剂，例如富含脂质的载体(例如富含脂质的白蛋白)可以将干细胞的存活和/或增殖提高约10％至40％。使用所述脂质补充剂和/或培养基的平均克隆效率为约30％。
在本公开的一个方面，提供了用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的脂质补充剂。在一个实施方案中，脂质补充剂可以包含一种或多种脂质。在另一个实施方案中，脂质补充剂可以在载体存在下包含一种或多种脂质。在进一步的实施方案中，脂质补充剂可以包含富含脂质的载体，例如富含脂质的白蛋白。
在本公开的另一方面，提供了用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的培养基。在一个实施方案中，培养基可以包含脂质补充剂。在一个实施方案中，脂质补充剂可以包含一种或多种脂质。在另一个实施方案中，脂质补充剂可以在载体存在下包含一种或多种脂质。在另一个实施方案中，用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的培养基的脂质补充剂可以包含富含脂质的载体，例如富含脂质的白蛋白。
在一个实施方案中，培养基包含脂质补充剂(诸如富含脂质的白蛋白)，和一种或多种存活因子(诸如一种或多种小分子抑制剂)。
在另一方面，培养基可以包含细胞外基质。在培养基包含细胞外基质的实施方案中，细胞外基质的浓度可以低于其凝胶化阈值(gelation threshold)。在一个实施方案中，细胞外基质包含一种或多种单基质组分。此类培养基可以增强一种或多种干细胞的存活和/或增殖(即，提高克隆效率，增加回收的克隆的数量和/或提高存活率)约5％至约65％。
在另一个实施方案中，包含细胞外基质的培养基可以任选地进一步包含脂质补充剂。
在用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的包含细胞外基质的培养基的另一个实施方案中，培养基还可以进一步包含一种或多种存活因子。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了不含脂质补充剂的培养基，其用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖，其中所述培养基包含细胞外基质。
在一个实施方案中，细胞外基质的浓度低于其凝胶化阈值。在一些实施方案中，细胞外基质包含一种或多种单基质组分。
在另一个实施方案中，不含脂质补充剂的培养基包含一种或多种存活因子，例如一种或多种小分子抑制剂。
另一方面，本公开提供了一种增强哺乳动物干细胞存活或增殖的方法，其包含：在包含富含脂质的白蛋白的培养基中培养干细胞。
在一个实施方案中，培养基可以包含细胞外基质。在另一个实施方案中，细胞外基质的浓度可以低于其凝胶化阈值。
在一个实施方案中，培养包含：将一种或多种哺乳动物干细胞培养为单层。在另一个实施方案中，培养包含：在非粘附条件下培养一种或多种哺乳动物干细胞。
在另一方面，本公开内容提供了增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法。在一个实施方案中，该方法可以包含：在脂质补充剂存在下培养一种或多种哺乳动物干细胞，如本文所述。在另一个实施方案中，该方法可以包含：在培养基存在下培养一种或多种哺乳动物干细胞，如本文所述。在进一步的实施方案中，该方法可以包含：在不含脂质补充剂的培养基中培养干细胞，所述培养基包含细胞外基质。
在一个实施方案中，细胞外基质的浓度可以低于其凝胶化阈值。
在一个实施方案中，培养包含：将一种或多种哺乳动物干细胞培养为单层。在另一个实施方案中，培养包含：在非粘附条件下培养一种或多种哺乳动物干细胞。
在一个实施方案中，用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法可以包含：
a)提供一种或若干哺乳动物干细胞；
b)在包含脂质补充剂的培养基中培养一种或多种哺乳动物干细胞；
c)增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖；以及
d)获得5％-65％的克隆效率。
在另一个实施方案中，用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法可以包含：
a)提供一种或若干哺乳动物干细胞；
b)在包含低于其凝胶化阈值的细胞外基质和任选的脂质补充剂的培养基中培养一种或多种哺乳动物干细胞；
c)增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖；以及
d)获得5％-65％的克隆效率。
从以下详细描述中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，在表明本发明的优选实施例时的详细描述和具体示例仅以说明的方式给出，这是由于在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图的简要说明
图1是柱状图，显示了在不同培养基中培养的各个细胞系的克隆效率％。
图2是显示在不同培养基中培养的各个细胞系的克隆效率％的柱状图。
图3是显示与团块传代对照(clump passaged control)相比，各个WLS-1C人干细胞克隆的每日倍数扩增(Daily fold expansion)的图。
图4是显示hPSC在各种培养基中的克隆效率％的柱状图。
图5显示了用碱性磷酸酶染色的实施例4的孔的代表性图像。
图6是显示在各个培养基中在非粘附条件下培养的hPSC的克隆效率％的柱状图。
图7是柱状图，其显示在各个培养基中在非粘附条件下培养的hPSC的回收克隆数。
图8是柱状图，其显示单独地或与低脂质BSA组合、加载脂质的不同脂肪酸提高了克隆效率。
图9是柱状图，其显示在载体存在下添加脂质增加了克隆效率，并且不必特别加载脂质。
图10是柱状图，其显示脂质不需要通过载体而加入，可以在载体存在下添加，以提高在富含蛋白质的培养基(A)和无蛋白质培养基(B)中的hPSC的克隆效率。
图11是柱状图，其显示通过添加游离脂肪酸可以改善包含来自多个BSA供应商的BSA的培养基的克隆效率。供应商A批次1和2，供应商B批次1和供应商C批次1，这些BSA已包含3000-7000微克/克的总脂肪酸。其余供应商的BSA含有少于400μg/g的总脂肪酸。
图12是柱状图，其显示脂肪酸对克隆效率具有不同的影响，一些是有益的，而另一些是有害的。
图13是柱状图，其显示向富含脂质的BSA添加有害脂肪酸对克隆效率具有负面影响。
发明详述
本公开涉及用于增强哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法和培养基。
当在本文中使用时，“增强了存活或增殖”意指：当在脂质补充剂或细胞外基质或两者存在下培养时增加了一种或多种细胞的存活或增殖，这是与一种或多种依下述培养的细胞相比而言的，即不在脂质补充剂或细胞外基质或两者的存在下进行培养、但其他培养条件相同或基本相同。
当在本文中使用时，“脂质补充剂”意指：一种或多种脂质和/或脂质样物质的制剂。该制剂可以作为游离的一种或多种脂质(或游离的一种或多种脂肪酸)和/或脂质样物质提供。或者，可以在载体存在下提供该制剂。或者，可以将制剂加载到载体上，形成富含脂质的载体。作为非限制性实例，富含脂质的载体可以是富含脂质的白蛋白。在将一种或多种哺乳动物干细胞的细胞培养物暴露于其之前，可以将一种或多种脂质和/或脂质样物质的制剂加载到载体上。或者，在将一种或多种哺乳动物干细胞的细胞培养物暴露于其中之前，可以将一种或多种脂质和/或脂质样物质的制剂与载体组合(或混合)。或者，可以将一种或多种脂质和/或脂质样物质和载体的制剂分开地提供给一种或多种哺乳动物干细胞的细胞培养物。在任何实施方案中，可以将脂质补充剂提供至细胞培养基(诸如干细胞培养基)中的细胞培养。
当在本文中使用时，“载体”意指能够将一些或全部脂质补充剂运输至细胞的生物或非生物制剂、物质、组合物或复合物，无论是在体外还是在体内。更具体地，载体能够将一种或多种脂质运输至细胞，无论是在体外还是在体内。作为非限制性实例，载体可以是白蛋白，胶束，脂质体，细胞外囊泡，外泌体，环糊精，纳米结构脂质载体等。
当在本文中使用时，“哺乳动物干细胞”是指可以细胞分裂后保留自我更新能力并产生至少一种分化的子细胞的细胞。哺乳动物干细胞包括多能干细胞，例如：胚胎干细胞(ESC)；诱导多能干细胞(iPSC)；已经转分化的细胞，生成的细胞借此可以在细胞分裂时保留自我更新的能力并产生至少一个分化的子细胞。在一个具体实施方案中，哺乳动物干细胞还包括成体组织干细胞(adult tissue stem cell)和任何祖细胞，无论其上游还是下游。
脂质补充剂
在本公开的一个方面，提供了用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的脂质补充剂。脂质补充剂可以包含一种或多种脂质。
在脂质补充剂的一些实施方案中，所述一种或多种脂质可以选自包含下述的组：脂肪酸；甘油脂；甘油磷脂；鞘脂；甾醇脂质；孕烯醇酮脂(prenol lipid)；糖脂；或者聚酮化合物。
在脂质补充剂的其他实施方案中，一种或多种脂质可以包括脂质样物质，例如泊洛沙姆。泊洛沙姆可以是KolliphorTM，SynperonicsTM或PluronicsTM。在某些实施方案中，脂质样物质可以是泊洛沙姆188(KolliphorTM P188)。
在脂质补充剂的其他实施方案中，脂质补充剂可以包括非脂质组分，例如维生素或其衍生物或类似物。可以包括在脂质补充剂中的维生素的实例包括维生素A，维生素B，维生素C，维生素D和维生素E。维生素衍生物或类似物的实例可以包括d-α生育酚，d-α生育酚乙酸酯，d-α生育酚琥珀酸酯，DL-α-生育酚和LA2P。
在脂质补充剂的其他实施方案中，所述一种或多种脂质可选自：脂肪酸；甘油脂；甘油磷脂；鞘脂；甾醇脂质；孕烯醇酮脂；糖脂；或者聚酮化合物，也可以包括脂质样物质，例如泊洛沙姆。泊洛沙姆可以是KolliphorTM，SynperonicsTM或PluronicsTM。在某些实施方案中，脂质样物质可以是KolliphorTM P188。
此外，脂质补充剂可以包括非脂质组分，例如维生素或其衍生物或类似物。可以包括在脂质补充剂中的维生素的实例包括维生素A，维生素B，维生素C，维生素D和维生素E。维生素衍生物或类似物的实例可以包括d-α生育酚，d-α生育酚乙酸酯，d-α生育酚琥珀酸酯，DL-α-生育酚和LA2P。
在脂质补充剂的优选实施方案中，一种或多种脂质包括至少一种脂肪酸。在一个具体实施方案中，一种或多种脂质包括多于一种脂肪酸。至少一种脂肪酸可以是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。或者，多于一种脂肪酸可以包括多种饱和脂肪酸，多种不饱和脂肪酸，或至少一种饱和脂肪酸和至少一种不饱和脂肪酸的组合。
在其中一种或多种脂质包括至少一种脂肪酸的脂质补充剂的实施方案中，所述至少一种脂肪酸可以选自包含下述的饱和脂肪酸的组：丙酸，丁酸，戊酸，己酸，庚酸，辛酸，壬酸，癸酸，十一烷酸，月桂酸，十三烷酸，肉豆蔻酸，十五烷酸，棕榈酸，珠光脂酸，硬脂酸，十九烷酸，花生酸，二十一烷酸(heneicosylic acid)，山萮酸，二十三烷酸(tricosylicacid)，二十四烷酸(lignoceric acid)，二十五烷酸(pentacosylic acid)，蜡酸，二十七烷酸(heptacosylic acid)，褐煤酸，二十九烷酸(nonacosylic acid)，峰花酸，三十一烷酸(henatriacontylic acid)，三十二烷酸，叶虱酸，三十四烷酸，三十五烷酸(ceroplasticacid)，三十六烷酸(hexatriacontylic acid)，三十七烷酸(heptatriacontanoic acid)或三十八烷酸，和/或选自包含下述的不饱和脂肪酸的组：α-亚麻酸，十八碳四烯酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸，亚油酸，γ-亚麻酸，二高-γ-亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳四烯酸，棕榈油酸，异油酸，二十烯酸(paullinic acid)，油酸，反油酸，巨头鲸酸，芥酸，神经酸或米德酸(mead acid)。
在脂质补充剂的实施方案中，其中一种或多种脂质包括多于一种脂肪酸，多种饱和脂肪酸可以选自下述的组：丙酸，丁酸，戊酸，己酸，庚酸，辛酸，壬酸，癸酸，十一烷酸，月桂酸，十三烷酸，肉豆蔻酸，十五烷酸，棕榈酸，珠光脂酸，硬脂酸，十九烷酸，花生酸，二十一烷酸，山萮酸，二十三烷酸，二十四烷酸，二十五烷酸，蜡酸，二十七烷酸，褐煤酸，二十九烷酸，峰花酸，三十一烷酸，三十二烷酸，叶虱酸，三十四烷酸，三十五烷酸，三十六烷酸，三十七烷酸，三十八烷酸；或多种不饱和脂肪酸可选自α-亚麻酸，十八碳四烯酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸，亚油酸，γ-亚麻酸，二高-γ-亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳四烯酸，棕榈油酸酸，异油酸，二十烯酸，油酸，反油酸，巨头鲸酸，芥酸，神经酸或米德酸；或者，至少一种饱和脂肪酸和至少一种不饱和脂肪酸的组合可选自包含下述的组：丙酸，丁酸，戊酸，己酸，庚酸，辛酸，壬酸，癸酸，十一烷酸，月桂酸，十三烷酸，肉豆蔻酸，十五烷酸，棕榈酸，珠光脂酸，硬脂酸，十九烷酸，花生酸，二十一烷酸，山萮酸，二十三烷酸，二十四烷酸，二十五烷酸，蜡酸，二十七烷酸，褐煤酸，二十九烷酸，峰花酸，三十一烷酸，三十二烷酸，叶虱酸，三十四烷酸，三十五烷酸，三十六烷酸，三十七烷酸，三十八烷酸，α-亚麻酸，十八碳四烯酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸，亚油酸，γ-亚麻酸，二高-γ-亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳四烯酸，棕榈油酸，异油酸，二十烯酸，油酸，反油酸，巨头鲸酸，芥酸，神经酸或米德酸。
在脂质补充剂的一个具体实施方案中，所述一种或多种脂质选自包含下述的组：米德酸(Mead’s acid)，花生酸，棕榈油酸，油酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，肉豆蔻酸，亚油酸，硬脂酸，α-亚麻酸，花生四烯酸，胆固醇，DL-α-生育酚，泊洛沙姆188(Kolliphor P188)。
在脂质补充剂的更具体的实施方案中，一种或多种脂质包括棕榈酸，硬脂酸，油酸，亚油酸和α-亚麻酸中的三种或更多种。
在脂质补充剂的更具体的实施方案中，脂质补充剂的一种或多种脂质包括棕榈酸和油酸。
在脂质补充剂可以包括多于一种脂肪酸的实施方案中，多于一种脂肪酸可以包括饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，或两者。多于一种脂肪酸可以选自包含下述的组：丙酸，丁酸，戊酸，己酸，庚酸，辛酸，壬酸，癸酸，十一烷酸，月桂酸，十三烷酸，肉豆蔻酸，十五烷酸，棕榈酸，珠光脂酸，硬脂酸，十九烷酸，花生酸，二十一烷酸，山萮酸，二十三烷酸，二十四烷酸，二十五烷酸，蜡酸，二十七烷酸，褐煤酸，二十九烷酸，峰花酸，三十一烷酸，三十二烷酸，叶虱酸，三十四烷酸，三十五烷酸，三十六烷酸，三十七烷酸，三十八烷酸，α-亚麻酸，亚麻油酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸，亚油酸，γ-亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳四烯酸，棕榈油酸，异油酸，二十烯酸，油酸，反油酸，巨头鲸酸，芥酸，神经酸或米德酸。
在脂质补充剂的一个具体实施方案中，一种或多种脂质不是花生四烯酸或α-亚麻酸，或两者。
在脂质补充剂的不同实施方案中，脂质补充剂仅包含一种脂质。唯一一种脂质可以选自包含下述的组：脂肪酸；甘油脂；甘油磷脂；鞘脂；甾醇脂质；孕烯醇酮脂；糖脂；或者聚酮化合物。
在脂质补充剂的其他实施方案中，仅一种脂质可以包括脂质样物质，例如泊洛沙姆。泊洛沙姆可以是KolliphorTM，SynperonicsTM或PluronicsTM。在某些实施方案中，脂质样物质可以是KolliphorTM P188。
在脂质补充剂的具体实施方案中，仅一种脂质可以是脂肪酸。在这样的实施方案中，脂肪酸可以是饱和脂肪酸。饱和脂肪酸可以选自包含下述的组：丙酸，丁酸，戊酸，己酸，庚酸，辛酸，壬酸，癸酸，十一烷酸，月桂酸，十三烷酸，肉豆蔻酸，十五烷酸，棕榈酸，珠光脂酸，硬脂酸，十九烷酸，花生酸，二十一烷酸，山酸，二十三烷酸，二十四烷酸，pentacosylicacid，蜡酸，二十七烷酸，褐煤酸，nonacosylic acid，峰花酸，三十一烷酸，三十二烷酸，叶虱酸，三十四烷酸，三十五烷酸，三十六烷酸，三十七烷酸或三十八烷酸。
在不同的这样的实施方案中，脂肪酸可以是不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸可以选自包含下述的组：α-亚麻酸，十八碳四烯酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸，亚油酸，γ-亚麻酸，二高-γ-亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳四烯酸，棕榈油酸，异油酸酸，二十烯酸，油酸，反油酸，巨头鲸酸，芥酸，神经酸或米德酸。
在脂质补充剂的一个具体实施方案中，仅一种脂质可以选自包含下述的组：米德酸，花生酸，棕榈油酸，油酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，肉豆蔻酸，亚油酸，硬脂酸，α-亚麻酸，花生四烯酸，胆固醇，DL-α-生育酚，泊洛沙姆188。
在脂质补充剂的更具体的实施方案中，仅一种脂质可以选自包含下述的组：棕榈酸，硬脂酸，油酸，亚油酸和α-亚麻酸。
在脂质补充剂的更具体的实施方案中，仅一种脂质是棕榈酸或油酸。
在脂质补充剂的一个具体实施方案中，仅一种脂质不是花生四烯酸或α-亚麻酸。
某些脂质特征可能更适合某些细胞类型的培养。在一个实施方案中，油酸，棕榈酸和亚油酸中比硬脂酸和α-亚麻酸更高的脂质特征可以增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖。在相同或不同的实施方案中，用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的脂质特征(lipid profile)包含油酸，棕榈酸，亚油酸，硬脂酸和/或α-亚麻酸中的一种或多种，其水平高于任何一种或多种脂质中的其他脂质。
本领域技术人员会理解，使用常规试验和错误，可以为在脂质补充剂中使用而鉴别出有益的或有害的一种或多种脂质(无论是单独的还是组合的)以增强一种或多种细胞的存活或增殖。
可能还希望将一种或多种脂质中的每一种以相同或不同的浓度加载到载体上。例如，可以将一种或多种脂质加载到载体上至浓度范围为1ng/mL至35μg/mL。替选地，可以根据表1中所示的变窄的浓度范围将一种或多种脂质加载到载体上。
为了增强一种或多种哺乳动物干细胞的增殖或存活，可能需要载体将一些或所有脂质补充剂运输到这些细胞，无论是在体外还是在体内。因而，用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的脂质补充剂可以在载体存在下包含一种或多种脂质。
这种载体可以是能够将一些或全部脂质补充剂运输到细胞的任何生物或非生物制剂，物质，组合物或复合物。更具体地，载体能够将脂质补充剂的一种或多种脂质转运至细胞。
作为非限制性实例，载体可以是白蛋白，胶束，脂质体，细胞外囊泡，外泌体，环糊精，纳米结构脂质载体等。
在载体是白蛋白的实施方案中，白蛋白可以来自任何来源。许多类型的白蛋白在细胞培养领域中是已知的。此外，特定的白蛋白可能更适合培养干细胞。不同类型的白蛋白可以根据因素而变化，诸如它们的来源。例如，白蛋白可以是牛白蛋白(BSA)，人白蛋白(HSA)或其他。或者，白蛋白可以是重组白蛋白。例如，重组白蛋白可以是重组人白蛋白(rHA)或重组牛白蛋白(rBA)。
在载体是脂质体或细胞外囊泡(例如外泌体)的实施方案中，一种或多种脂质可以存在于其脂质双层内，或作为包装在由其脂质双层界定的内部空间内的货物(cargo)。
本公开的载体可以从商业实体购买，或者可以使用市售产品或试剂分离/合成得来。对于天然存在的载体，例如细胞外囊泡(包括外泌体)，脂质体，胶束和白蛋白，例如，可以使用任何已建立/可用的方案分离这种天然存在的载体。对于不一定天然存在但易于合成的载体，例如脂质体，胶束，环糊精，纳米结构脂质载体或其它，可以使用任何已建立/可用的方案合成这种非天然存在的载体。
可以从商业实体购买一些或所有载体。具体地，粉末状或溶解的白蛋白可以从任何供应商购买，诸如ThermoFisher Scientific，Sigma-Aldrich等。
无论是分离的，制造的还是购买的，本公开的载体可以从一开始就包含一种或多种脂质或脂肪酸。这样的一种或多种脂质或脂肪酸可以以可观的水平或以非常接近检测限或低于检测限的水平存在，因此基本上处于不可检测的水平。
当需要特定的脂质特征来影响所希望的后果时，如果例如脂质特征不适合影响所希望的后果，则一开始就与载体结合的一种或多种脂质或脂肪酸的存在可能是有问题的。因此，在某些实施方案中，可能希望从载体中除去或消除这些一种或多种脂质或脂肪酸中的一些或全部。
在另一个实施方案中，一种或多种脂质可以加载到无脂质或脂质减少的载体上，例如白蛋白。无论载体是否是无脂质的，脂质减少的或其他方式，载体可以加载有所希望的一种或多种类型的脂质，产生具有限定的脂质标记的富含脂质的载体。
在其他实施方案中，无论是分离的，合成的还是购买的，载体可以不含脂质或脂肪酸或基本上不含脂质或脂肪酸。
在增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的一个实施方案中，可以将一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质样物质预先加载到载体上。可以使用本领域已知的任何常规技术将一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质预加载到载体上。例如，将一种或多种脂质和/或脂质物质预加载到载体上可以如下进行：通过用所希望的量的载体组合所希望量的每种所希望的一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质，并将这种组合物温育足够的时间以使一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质与载体达到平衡，或基本上达到平衡。使一种或多种哺乳动物干细胞暴露于预加载有一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质的如此制备的载体可以增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖。
在另一个实施方案中，一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质可以组合，而不必预先加载到载体上。例如，将一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质与载体组合可以如下进行：通过组合所需量的每种所需的一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)，和/或带有所希望的量的载体的脂质物质，其不允许载体和一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质达到平衡。可以温育一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和载体的这种组合，而不使组合达到平衡。使一种或多种哺乳动物干细胞暴露于如此组合的载体和一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质可以增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖。
在另一个实施方案中，一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质可以与载体分开地提供给一种或多种哺乳动物干细胞的细胞培养物。与载体分开的将一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质提供给一种或多种哺乳动物干细胞的细胞培养物可以以任何顺序完成。例如，载体可能已经存在于细胞培养物中，并且之后添加一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质。或者，一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质可能已经存在于细胞培养物中，然后添加载体。或者，载体和一种或多种脂质和/或脂质物质都不存在于培养物中，并且两种组分可以以任何顺序添加，这是在细胞培养物的添加步骤之间没有任何时间延迟地进行。
在某些实施方案中，游离的一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质可以加入已经包含载体的细胞培养物中。加入游离的一种或多种脂质和/或脂质物质可以使用任何数量和/或游离的一种或多种脂质的组合来实现，条件是加入的一种或多种脂质和/或脂质物质不会对细胞培养物中一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖有害。优选地，加入的游离的一种或多种脂质和/或脂质物质增强细胞培养物中一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖。
在另一个实施方案中，将额外的载体与游离的一种或多种脂质(或至少一种脂肪酸)和/或脂质物质一起加入细胞培养物中可能是有利的。
培养基
在本公开的一个方面，提供了一种培养基，其增强了在其中培养的一种或多种细胞的存活或增殖。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞可以是一种或多种哺乳动物细胞，更具体地，所述一种或多种细胞可以是一种或多种哺乳动物干细胞。下面进一步描述用于增强一种或多种细胞的存活或增殖的培养基的各种实施方案。
在一个实施方案中，培养基包含如本文所述的脂质补充剂。例如，脂质补充剂可以包含一种或多种脂质和/或脂质物质，一种或多种脂质，其包括至少一种脂肪酸，一种或多种脂质，其包括一种以上脂肪酸，或仅一种脂质。
在相同的实施方案或培养基的不同实施方案中，脂质补充剂可以在载体存在下包含：一种或多种脂质和/或脂质物质，一种或多种脂质，其包括至少一种脂肪酸，一种或多种脂质，其包括多于一种脂肪酸，或仅一种脂质。
在培养基的一个具体实施方案中，在载体(富含脂质的载体)存在下，一种或多种脂质和/或脂质物质，一种或多种脂质，其包括至少一种脂肪酸，一种或多种脂质，其包括多于一种脂肪酸，或仅一种脂质。富含脂质的载体可以是富含脂质的白蛋白。
在培养基的脂质补充剂的一个实施方案中，所述一种或多种脂质和/或脂质物质，所述一种或多种脂质包括至少一种脂肪酸，所述一种或多种脂质包括多于一种脂肪酸，或在将细胞暴露于培养基之前或之后，只有一种脂质可以预加载到载体上并添加到培养基中。富含脂质的载体，例如富含脂质的白蛋白，可以使用已知方法制备，其中粉末状或溶解的载体可以根据下面的描述加载一种或多种脂质。
在培养基的脂质补充剂的另一个实施方案中，一种或多种脂质，一种或多种脂质包括至少一种脂肪酸，一种或多种脂质包括多于一种脂肪酸，或者仅一种脂质可以在将细胞暴露于培养基之前，与培养基中的、或在分开溶液中的载体组合。或者，可以在将培养基添加至细胞后，将一种或多种脂质，包括至少一种脂肪酸的一种或多种脂质，包括一种以上脂肪酸的一种或多种脂质，或仅一种脂质，以及载体各自分开地加入培养基中。
在一个实施方案中，培养基包含如本文所述的脂质补充剂和一种或多种存活因子。一种或多种存活因子可以是增强培养的哺乳动物干细胞存活的任何分子，化合物或其他。反过来，具有增强的存活的哺乳动物干细胞也可以在所公开的培养基中显示出增强的增殖。
在一个实施方案中，一种或多种存活因子可以包含一种或多种小分子抑制剂。在某些实施方案中，一种或多种小分子抑制剂可以包含Thiazovivin，Y-27632，CHIR99021，SB202190，Ml-7，程序性坏死特异性抑制剂-1(Necrostatin-1)，NS3694，Wnt-C59，NSCI或BIPV5中的一种或多种。在其他实施方案中，一种或多种小分子抑制剂可以包含Rho/Rock途径抑制剂。常见的Rho/Rock抑制剂的一个例子是Y-27632。
所公开的培养基的一种或多种存活因子可以以1nM至1mM的浓度存在。在一个具体实施方案中，一种或多种存活因子如Y-27632以10μM的浓度存在。
在另一个实施方案中，用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的培养基可以进一步包含细胞外基质。细胞外基质可以是天然来源的基质产物，例如作为非限制性实例，由细胞或组织分泌的产物。或者，细胞外基质可以是脱细胞基质。
在一些实施方案中，细胞外基质可以包含一种或多种单基质组分。单基质组分的非限制性实例包括：单独或组合的纤连蛋白，胶原蛋白，层粘连蛋白，弹性蛋白，玻连蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素或蛋白多糖。在其他实施方案中，细胞外基质可以是MatrigelTM。
在培养基包含细胞外基质的实施方案中，细胞外基质的浓度可以低于其凝胶化阈值。凝胶化阈值可以根据添加到培养基中的细胞外基质(或一种或多种单基质组分的基质)的类型而变化。尽管如此，细胞外基质(无论是由一种单基质组分构成还是包含一种或多种单基质组分)的凝胶化阈值是培养基形成固体或基本上固溶体而非液体或半固溶体的的点。在细胞外基质是MatrigelTM的实施方案中，凝胶化阈值为约0.5％v/v或更高。
另一方面，本发明提供了用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的培养基，所述培养基包含细胞外基质组分或任选地包含如本文所述的脂质补充剂。
根据这种培养基的一个实施方案，细胞外基质可以是天然来源的基质产物，例如作为非限制性实例，由细胞或组织分泌的产物。或者，细胞外基质可以是脱细胞基质。
在一些实施方案中，细胞外基质可以包含一种或多种单基质组分。单基质组分的非限制性实例包括：单独或组合的纤连蛋白，胶原蛋白，层粘连蛋白，弹性蛋白，玻连蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素或蛋白多糖。在其他实施方案中，细胞外基质可以是MatrigelTM。
在培养基包含细胞外基质的实施方案中，细胞外基质的浓度可以低于其凝胶化阈值。凝胶化阈值可以根据添加到培养基中的细胞外基质(或一种或多种单基质组分的基质)的类型而变化。尽管如此，细胞外基质(无论是由单基质组分构成还是包含一种或多种单基质组分)的凝胶化阈值是培养基形成固体或基本上固溶体而非液体或半固溶体的点。在细胞外基质是MatrigelTM的实施方案中，凝胶化阈值为约0.5％v/v或更高。
在一个实施方案中，培养基可以进一步包含一种或多种存活因子。一种或多种存活因子可以是增强培养的哺乳动物干细胞存活的任何分子，化合物或其他。反过来，具有增强的存活的哺乳动物干细胞也可以在所公开的培养基中显示出增强的增殖。
可以从上文的描述中收集一个或多个存活因子的进一步细节。
培养基还含有干细胞生长和存活所必需的其他因子。适用于培养特定类型的哺乳动物干细胞的培养基配方或基础培养基配方是可商购的。任何此类培养基配方或基础培养基配方可以用于配制本文公开的培养基，并用于实施本文公开的方法。
在一个实施方案中，培养基可以包含支持哺乳动物细胞培养的生长因子。
在适用于hPSC的特定实施方案中，生长因子可以包括但不限于干细胞因子(SCF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子β(TGFβ)，成纤维细胞生长因子(FGF)，白血病抑制因子(LIF)和骨成型蛋白质(BMP)。
培养基还可以包含支持哺乳动物干细胞培养的其他添加剂。在适用于人干细胞的另一个实施方案中，其他添加剂可以包括但不限于4-氨基丁酸，BSA，哌啶酸和氯化锂。
方法
干细胞通常在体外培养。在这种体外应用中，优选在特定培养条件下培养干细胞。如果体外干细胞不在特定培养条件下培养，则干细胞可能以次优方式生长。在一些情况下，次优生长可以包含降低的生长速率。在其他情况下，次优生长可以包含干细胞的非预期分化。在其他情况下，次优生长可以包含细胞死亡，诸如通过细胞凋亡，坏死，自噬等。发明人已经表明，在包含脂质补充剂的培养基中培养干细胞可以增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖。
在一个方面，本公开内容提供了增强哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法，其包含在包含如本文所述的脂质补充剂的培养基中培养干细胞。
在一个实施方案中，本公开提供增强哺乳动物干细胞存活或增殖的方法包含：在包含如本文所述的富含脂质的载体的培养基中培养干细胞。
在更具体的实施方案中，本公开提供了增强哺乳动物干细胞存活或增殖的方法，其包含：在包含富含脂质的白蛋白的培养基中培养干细胞。
在另一个实施方案中，培养基还可以包含其他因子，例如本文所述的一种或多种存活因子。
在另一个实施方案中，本公开提供增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法，其包含：在进一步包含细胞外基质组分的培养基中培养干细胞。
另一方面，本发明提供增强哺乳动物干细胞存活或增殖的方法，其包含：在包含细胞外基质组分或任选的如本文所述的脂质补充剂的培养基中培养干细胞。
在具体的实施方案中，细胞外基质组分在其凝胶化阈值以下提供。
在一个实施方案中，培养基还可以包含其他因子，例如本文所述的一种或多种存活因子。
因此，本公开提供了在根据如上所述的成分的培养基中增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法。可以通过本领域已知的任何技术计算增强的存活或增殖，其包括但不限于：通过用由输入细胞或其团块/集群的数量生成的集落/克隆的数量来除以确定克隆效率％。在某些实施方案中，增强的存活或增殖包含获得5％-65％的克隆效率。或者，可以通过表明从输入的细胞或其团块/集群中回收的克隆/集落的数量来参比增强的存活或增殖。
干细胞可以是任何希望培养以增强细胞存活和增殖的哺乳动物干细胞。
在本公开中，干细胞可以是任何哺乳动物干细胞。在一个实施方案中，干细胞是非啮齿动物的。例如，非啮齿动物哺乳动物干细胞可以是猪的干细胞。或者，非啮齿动物哺乳动物干细胞可以是灵长类干细胞。在另一个替代方案中，灵长类干细胞可以是人干细胞。
技术人员还将意识到哺乳动物干细胞可以对应于哺乳动物的任何发育阶段。例如，哺乳动物干细胞可以是胚胎来源，例如胚胎干细胞(ESC)。或者，哺乳动物干细胞可以源自成年哺乳动物的组织或器官。或者，哺乳动物干细胞可以是诱导多能干细胞(iPSC)，其中iPSC可以使用本领域已知的任何技术生成。ESC和iPSC共同称为多能干细胞(PSC)。
鉴于体外培养的哺乳动物干细胞的潜在下游应用，特别是通过将一种或多种哺乳动物干细胞以单细胞接种而培养的那些，可能希望哺乳动物干细胞具有正常的核型。可能进一步希望该正常核型是稳定的。正常核型可以通过适当数量的物种特征的染色体来表征。另外地或替选地，正常核型可以通过适当的染色特征来表征，使用本领域已知的任何染色用于染色体的条带分析，诸如用Giemsa。在进一步补充或进一步替选的方案中，正常核型可以通过适当大小的染色体来表征。
在另一个实施方案中，哺乳动物干细胞是基因工程改造的。可以使用本领域已知的任何技术对哺乳动物干细胞进行基因工程改造。例如，哺乳动物干细胞可以使用基因编辑技术进行基因工程改造。基因编辑技术可以包括但不限于：CRISPR技术，锌指核酸酶技术，TALEN技术或ARCUS技术。
当希望对哺乳动物干细胞进行基因工程改造时，与哺乳动物干细胞的扩增和/或存活相关的问题变得凸显。例如，当一种或多种哺乳动物干细胞经历基因编辑技术时，很可能没有两种哺乳动物干细胞经过相同的遗传工程改造。然而，如果这种基因工程哺乳动物干细胞将用于下游应用，无论该应用是在体内还是在体外，优选使用所获得的其克隆种群，例如通过以单细胞接种一个或多个的哺乳动物干细胞。
所公开的方法可以包含：提供哺乳动物干细胞的种群或培养物。或者，所公开的方法可以包含：提供一种或多种哺乳动物干细胞。所提供的哺乳动物干细胞可以保持在本领域已知的任何培养基中。用于维持哺乳动物干细胞的培养基类型将取决于哺乳动物干细胞的性质。如上所述，哺乳动物干细胞可以起源于胚胎。替选地，哺乳动物干细胞可以源自成体组织或器官。在另一个替选方案中，哺乳动物干细胞可能已经从合适的亲代细胞中诱导或转分化。用于维持哺乳动物干细胞的培养基类型也取决于哺乳动物干细胞来源的物种。例如，人PSC(hPSC)可以保持在mTeSRTM培养基配方中。
在一个实施方案中，干细胞在传代后培养6-8天，然后解离成单细胞并接种到包含脂质补充剂和任选的一种或多种存活因子的培养基中。在一个具体实施方案中，细胞以1个细胞/孔至1000个细胞/孔的密度接种。然后在第2天再次用含有脂质补充剂和任选的一种或多种存活因子的培养基喂养细胞，然后在第4天用常规生长培养基喂养(用克隆补充剂(即脂质补充剂)总共4天)。然后可以每天喂养细胞直至收获集落，诸如约7-12天。
在另一个实施方案中，干细胞可以在传代后培养6-8天，然后解离成单细胞并接种到包含脂质补充剂或细胞外基质组分中的一个或两者(以及任选地一种或多种生存因子)的培养基中。在一个具体实施方案中，细胞可以以1个细胞/孔至1000个细胞/孔的密度接种。然后可以在第2天再次喂养细胞，其中培养基包含脂质补充物或细胞外基质组分中的一个或两者，并且任选地在第4天用常规生长培养基喂养一种或多种存活因子(用克隆补充剂(即脂质补充剂)总共4天)。然后可以每天喂养细胞直至收获集落，诸如约6-12天。
本领域技术人员将意识到，将一种或多种哺乳动物干细胞暴露于脂质补充剂和/或细胞外基质组分或组分的天数仅仅是一个指导原则并且可以容易地改变。这种暴露的持续时间可能比上面提到的2天更长或更短。例如，这种暴露可以少于2天，例如约36小时，24小时，18小时，12小时，8小时，6小时，4小时，2小时，1小时或更短。或者，此类暴露可能超过2天。例如，长于2天的暴露可以达到一种或多种哺乳动物干细胞可以在相同培养基中培养的总时间，而不经历培养基的变化。
此外，一种或多种哺乳动物干细胞暴露于脂质补充剂和/或细胞外基质组分可以出现任何次数。例如，一种或多种哺乳动物干细胞可能仅需要单次暴露于脂质补充剂和/或细胞外基质组分。如上所述，这种单次暴露可以持续任何适当的时间。或者，一种或多种哺乳动物干细胞可能需要两次或更多次暴露于脂质补充剂和/或细胞外基质组分。
在另一个具体实施方案中，可以在第2天通过补料喂养进行日常喂养细胞，这里使用常规生长培养基或下述培养基，其包含脂质补充剂或细胞外基质组分的一个或两者，或任选的一种或多种存活因子。然后可以每天喂养细胞直至收获集落，诸如约4-10天。
一旦哺乳动物干细胞达到阈值汇合，可以对提供的哺乳动物干细胞进行传代培养。或者，所提供的哺乳动物干细胞可以根据集落健康所要求的那样进行传代培养，例如可以通过集落外观、大小或形态来确定。
可以使用适合于干细胞培养领域中已知的哺乳动物干细胞的特定培养的任何技术进行所提供的哺乳动物干细胞的传代培养。例如，一旦hPSC达到约70％的汇合，可能希望将细胞传代培养到不同的培养容器中。
通常，可以通过施用合适的制剂从培养容器中分离出适当水平汇合的和/或具有特定集落大小的hPSC培养物。该制剂可以包含本领域已知的消化酶或化学物质以分离集落。如果使用消化酶，可能希望通过添加第二灭活溶液来灭活消化酶。为了进一步解聚分离的哺乳动物干细胞，可能需要将它们暴露于激动势力下，例如通过重复向上和向下移液或由技术人员机械地撞击培养容器。
在充分搅拌后，分离的、解聚的哺乳动物干细胞可以作为单细胞悬浮液或具有所希望的尺寸的集群存在，其可以包含所希望的细胞数范围。通过将一种或多种哺乳动物干细胞接种在合适的培养容器中，可以以所希望的细胞密度对充分解聚的细胞进行传代培养。
可以使用任何已知方法进行：以所希望的细胞密度铺板一种或多种哺乳动物干细胞。可以使用常规技术铺板哺乳动物细胞的单细胞悬浮液或细胞集群的悬浮液。例如，在确定悬浮液的细胞密度后，可以使用适当体积的悬浮液来接种培养容器或其孔或微孔。或者，可以使细胞悬浮液经历荧光活化细胞分选，并且可以将分选的哺乳动物细胞以适当的细胞数适当地分配到培养容器或其孔或微孔中。
在某些应用中，可能希望通过仅将单个哺乳动物细胞接种到培养容器或其孔或微孔中来接种哺乳动物干细胞。或者，可能希望通过将足够低密度的单个哺乳动物细胞接种到培养容器或其孔或微孔中来接种哺乳动物干细胞。在这种情况下，希望细胞密度足够低以使所铺板的哺乳动物细胞聚集的趋势最小化，诸如通过确保培养容器中的细胞或其孔或微孔之间的足够间隔。而且，这种足够的间隔可以使培养容器或其孔或微孔中的哺乳动物干细胞之间的旁分泌信号传导最小化。
在一个实施方案中，可以将单个hPSC接种在培养容器的单个孔或微孔中。在确定分离的、解聚的hPSC种群的细胞密度并铺板适当的体积后，可以对单个hPSC铺板。或者，可以使用细胞分选技术(例如荧光活化细胞分选)来铺板单个hPSC。在另一个实施方案中，可以在相对较大的培养容器或其孔中以克隆密度铺板一个或多个hPSC。例如，克隆密度可以包含：1个细胞/孔至1000个细胞/cm2之间的密度。
总之，本发明公开的方法可以涵盖：将本公开的培养基中的一种或多种哺乳动物干细胞培养为单层(即贴壁培养物)或非粘附培养物(即悬浮液)。无论一种或多种哺乳动物干细胞是以单层还是以非贴壁培养物接种，所公开的方法可以进一步包含：以1个细胞/孔至高达约1000个细胞/cm2的接种密度接种一个或多个细胞)。在一些实施方案中，可以以单细胞接种一种或多种哺乳动物干细胞。
在其中以单层培养一种或多种哺乳动物干细胞的实施方案中，以单层培养可以包含：在细胞外基质中接种一个或多个细胞。
在另一个实施方案中，可以以单细胞或以集群铺板哺乳动物干细胞，以便将一种或多种铺板的哺乳动物细胞培养为悬浮物或贴壁培养物。
当可能需要将哺乳动物干细胞培养为悬浮培养物时，无论是以单细胞还是以集群，可能希望以细胞团块(cluster)或单细胞悬浮物直接接种哺乳动物细胞至生物反应器，旋转瓶，悬浮培养板或其他促进悬浮干细胞生长的容器中。还可能希望使用微孔板或任何其他此类方法预聚集干细胞，以在将干细胞接种到上述容器中之前产生相同大小的聚集体。还可能希望在微载体存在下培养细胞以支持干细胞在悬浮液中的生长。
在可能希望将哺乳动物干细胞培养为贴壁培养物时，无论是以单细胞还是以集群，可能希望将一种或多种哺乳动物干细胞在合适的基质上铺板。基质可以是支持一种或多种哺乳动物干细胞培养的任何基质。基质还可以促进一种或多种哺乳动物干细胞的附着。例如，基质可以包含：支持一种或多种哺乳动物干细胞培养的细胞外基质蛋白。包含细胞外基质蛋白的各种基质可商购获得，诸如Matrigel。本公开中考虑的一些细胞外基质蛋白的实例包括层粘连蛋白，胶原蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白或巢蛋白。本公开内容中考虑的基质可以进一步包含：已知量的细胞外基质蛋白质的组合，例如层粘连蛋白，胶原蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白，巢蛋白等。
经铺板的一种或多种哺乳动物干细胞，无论是在悬浮液中培养还是作为贴壁培养物，都应补充有支持其培养的培养基，诸如本发明的培养基。如上所述，培养条件可以根据哺乳动物干细胞的性质和特征而改变。本领域技术人员将理解，用于支持哺乳动物干细胞培养的培养基应当包含：适合于哺乳动物干细胞的性质和特征的基础培养基配方。
在一个实施方案中，hPSC可以维持并在mTeSRTM制剂中传代培养，诸如mTeSRTM1，mTeSRTM2，TeSRTM-E8或mTeSRTM3D。mTeSRTM配方非常适合hPSC的标准培养。在其他实施方案中，hPSC可以在基于敲除血清替代(KOSR)的培养基，StemMACSTMiPS-Brew(MiltenyiBiotec)iPS-Brew，Essential 8TM培养基(Thermo Fisher Scientific)，Essential-8，StemFlex培养基(Thermo Fisher Scientific)，DEF-CSTM(Takara)或其他支持干细胞生长的培养基中维持和传代培养。
在另一个实施方案中，可以在例如MesenCultTM-XF，MesenCultTM-ACF或MesenCultTM-PL中维持并传代培养成人干细胞，诸如间充质干细胞。
在另一个实施方案中，例如可以在NeuroCultTM，BrainPhysTM或Xcell NeuralMedium中维持并传代培养成人干细胞，诸如神经干细胞。
通过用包含富含脂质的白蛋白和任选的一种或多种存活因子的培养基培养一个或多个非啮齿动物哺乳动物细胞，对于用该培养基培养的一个或多个细胞，可以获得5％至65％的存活率。
表1：富含脂质的白蛋白上的脂肪酸浓度。
以下的非限制性实施例用于说明本发明：
实施例
实施例1
用0.5mL克隆基质或细胞外基质(在CellAdhereTM稀释缓冲液中1:25稀释)包被12孔培养板，并在室温下放置1小时。然后吸出基质和1mL培养基(mTeSRTM1或TeSRTM-E8TM，补充10μM的Y27632或包含富含脂质的白蛋白，GABA，哌啶酸，氯化锂，FGF，TGFβ和Y-27632的培养基(将此后称为克隆补充剂)加入每个孔中，将板置于37℃1小时。将hPSC细胞系解离成单细胞，以25个细胞/cm2接种到预热的培养板中，并在37℃放置2天。然后给细胞喂养新鲜培养基(mTeSRTM1或TeSRTM-E8TM，补充以10μM的Y-27632或克隆补充剂)并在37℃放置两天。在第4天，然后给细胞喂养1mL不含添加剂的mTeSRTM1或TeSRTM-E8TM，并且每天喂养直至第7天。然后用4％的多聚甲醛固定细胞并为碱性磷酸酶染色。然后计数未分化的集落，并使用以下计算确定克隆效率:(第7天的未分化集落数(每孔)/第0天(每孔)接种的细胞数)×100。(误差棒代表三个生物学复本的标准偏差)。
此实施例的结果示于图1中，并显示了以克隆密度(25个细胞/cm2)铺板的每个hPSC系(H1，H7，WLS-1C，STiPS-M001)显示出增强的克隆效率，这是在mTeSRTM1或TeSRTM-E8TM中生长，当mTeSRTM1和TeSRTM-E8TM被补充以克隆补充剂时，而不是在TeSRTM-E8TM中生长，单独补充以Rock抑制剂时。
实施例2
用50μL克隆基质或细胞外基质(在CellAdhereTM稀释缓冲液中1:25稀释)包被96孔培养板，并在室温下放置1小时。然后抽吸基质并向每个孔中添加100μL培养基(mTeSR TM 1补充有10μM的Y-27632或克隆补充剂，并将板置于37℃1小时)，hPSC细胞系解离成单细胞并以1个细胞/孔使用BD FACSAria Fusion进行分选并在37℃放置2天。然后给细胞喂养新鲜培养基(补充有10μM的Y-27632或克隆补充剂的mTeSR TM 1)并在37℃放置两天。在第4天，然后给细胞喂养不含添加剂的100μL的mTeSRTM 1，并且每天喂养直至第7天。然后用4％的多聚甲醛固定细胞并为碱性磷酸酶染色。然后计数未分化的集落，并使用以下计算确定克隆效率:(未分化的集落数(每个板)/接种的孔数(每孔1个细胞))×100。(误差棒代表两个技术复本的SEM)。
此实施例的结果示于图2中，并显示了当在mTeSRTM1或TeSR-E8中生长时，以每孔一个细胞的密度铺板的每个hPSC系(H1，H7，WLS-1C，STiPS-M001)显示出增强的克隆效率，这是当mTeSR 1和TeSRTM-E8TM补充克隆补充剂时，而不是在mTeSRTM1中或TeSRTM-E8TM中生长，单独添加Rock抑制剂时。
实施例3
在单细胞沉积(来自实施例2)后10天手动挑选8个独立的WLS-1C克隆，并使用mTeSRTM1扩增5代，并使用轻柔细胞解离试剂(Gentle Cell Dissociation Reagent)(完整方案自stemcell.com获得)传代。在每次传代结束时计数每孔的团块总数，以确定与团块传代对照相比克隆细胞系的每日扩增倍数。使用以下计算确定每日扩增倍数:(传代结束时的团块总数/传代开始时接种的集落数)/培养天数。(误差棒代表来自至少两个生物学复本的数据)。
此实施例的结果示于图3中，并显示了在实施例2中描述的条件下形成的八个独立的WLS-1C克隆表现出与作为团块常规培养的hPSC相当的每日扩增倍数。
实施例4
用0.5mL克隆基质或细胞外基质(在CellAdhereTM稀释缓冲液中1:25稀释)包被12孔培养板，并在室温下放置1小时。然后吸出基质并向每个孔中添加1mL的测试培养基。不同的测试培养基由下述组成：对照培养基(补充有10μM的Y-27632的mTeSRTM1)或补充有包含用脂质增强的BSA制备的克隆补充剂的培养基的mTeSRTM1或补充有具有脱除了脂质的BSA的克隆补充剂的mTeSRTM1，其或者仅用乙醇，用三种脂肪酸或用五种脂肪酸加载脂质。然后将板置于37℃1小时。将hPSC细胞系解离成单细胞，以25个细胞/cm2接种到预热的培养板中，并在37℃放置2天。然后将细胞用相应的测试培养基喂养并在37℃放置两天。在第4天，然后向细胞中加入1mL不含添加剂的mTeSRTM1，并每天喂养直至第8天。然后用4％的多聚甲醛固定细胞并为碱性磷酸酶染色。然后计数未分化的集落，并使用以下计算确定克隆效率:(第7天的未分化集落数(每孔)/第0天(每孔)接种的细胞数)×100。(误差棒代表来自三次技术复本的SEM)。
此实施例的结果示于图4中，并显示H1hPSC在mTeSRTM1中生长，其补充有Rock抑制剂和脱除了脂质的BSA，其加载有油酸，棕榈酸和亚油酸(3FA)或油酸，棕榈酸，亚油酸，硬脂酸以及600μg/g(每个脂肪酸)的α-亚油酸(5FA)，这里表现出与购买的脂质增强BSA相当的增强的克隆效率，而加载有乙醇的脂质脱除BSA(对照)则没有。
实施例5
来自实施例4(脱除了脂质的BSA 1)的孔的代表性图像用碱性磷酸酶(Far Red)染色并使用ImageXpress Micro成像。
此实施例的结果显示，实施例4中产生的集落显示出与市售脂质增强的BSA中生成的集落相当的集落大小/形态。
实施例6
此实施例的结果示于图6中，并显示在非贴壁条件下在包含Y-27632和富含脂质的白蛋白或0.2％Matrigel的培养基中培养的STiPS-M001，H7和H9hPSC表现出更高的每孔回收克隆数，这是相比于当用富含脂质的无白蛋白培养基和Y-27632培养时。这些结果进一步表明，包含Y-27632，富含脂质的白蛋白和0.2％Matrigel的培养基表现出显著的协同效应，每孔的回收克隆数量远高于增加含有这些组分中的任何单个的培养基观察到的回收率所预期的。
实施例7
此实施例的结果示于图7中，并显示了STiPS-M001，WLS-1C，H7和H9hPSC在非贴壁条件下在包含Y-27632和富含脂质的白蛋白或富含脂质的白蛋白和0.2％的培养基中培养，相比于在用富含脂质的无白蛋白培养基和Y-27632培养时，这里表现出了更高的每孔克隆效率(回收的克隆数除以接种的细胞数)。
实施例8
此实施例的结果示于图8中，并显示了WLS-1C，H1和STiPS-F016细胞在已经加载单个脂肪酸、两种脂肪酸或三种脂肪酸的其他脂质贫乏的白蛋白(即基本上不含脂质)存在下培养，取决于一种或两种脂肪酸的性质，这里表现出不同水平的克隆效率。
特别地，将一种或多种脂肪酸中的每一种与白蛋白一起温育，浓度为600μg每种脂肪酸/克白蛋白。随后将这种温育的产物以6ng/mL的终浓度添加至培养基中。
与H1，WLS-1C和STiPS-F016hPSC与加载3脂肪酸的白蛋白相比，当用油酸或棕榈酸或两者处理时显示出相当的克隆效率(如图8所示)。
值得注意的是，仅加载亚油酸会降低WLS-1C和H1hPSC中的克隆效率，低于对照水平和油酸和/或棕榈酸两者。
实施例9
此实施例的结果示于图9中，并显示了通过向包含另外的低脂质(即无脂质或脂质还原的)载体的培养基中添加游离脂肪酸可以提高克隆效率。
在三种游离脂肪酸(棕榈酸，油酸和亚油酸)加上载体或加载有三种脂肪酸(棕榈酸，油酸和亚油酸)的白蛋白存在下培养的WLS-1C，H1和STiPS-F016细胞表现出相当的克隆效率水平。
特别地，温育每克白蛋白600μg每种脂肪酸以产生富含脂质的白蛋白。或者，将每克另外的低脂白蛋白600μg的每种游离脂肪酸加入细胞培养物中。在这些条件下培养4天后(第2天培养基更换)，然后在标准mTeSRTM1中培养7天，评估每种培养条件下每种细胞系的克隆效率。
值得注意的是，在没有额外的低脂质载体的情况下提供三种游离脂肪酸也可以产生可观的克隆效率水平。
实施例10
此实施例的结果如图10所示，并显示了无论是在mTeSR 1(图10a)还是在TeSR E8TM(图10b)中，当在另外的低脂质载体存在下提供游离脂肪酸时，加入游离脂肪酸都能实现更好的H1，1C和STiPS-F016hPSC的克隆效率。
具体而言，当使用蛋白质减少的培养基(例如TeSRTME8TM)时，必须包含额外的载体以提高暴露于游离脂肪酸的细胞的克隆效率。
实施例11
此实施例的结果示于图11中，并显示了当将所述白蛋白与两种游离脂肪酸一起提供给细胞培养时，使用来自4个不同供应商的两种不同白蛋白或白蛋白批次的WLS-1C和H1细胞的克隆效率得到增强。
值得注意的是，当提供所述白蛋白和两种游离脂肪酸时，使用来自一个供应商的白蛋白(A1和A2)的克隆效率没有增强。进一步注意，即使不存在另外的两种游离脂肪酸，白蛋白A1和A2也产生最低的克隆效率。由于许多脂肪酸的总体水平高和/或存在一种或多种对克隆效率有害的脂肪酸，会出现这种观察结果。
实施例12
此实施例的结果示于图12中，并显示在载体存在下单个游离脂肪酸对H1和WLS-1ChPSC的克隆效率的影响。
在此实验中，将600μg所示的游离脂肪酸掺入培养基(mTeSRTM1加10μM的Y-27632)/克载体中，所述载体也加入培养基中。例如，如实施例1中所述计算克隆效率。
尽管至少油酸，棕榈酸，肉豆蔻酸，硬脂酸和胆固醇可能有助于增强H1和WLS-1ChPSC的存活和增殖，但似乎至少花生四烯酸和α-亚麻酸的存在可能是有害的。
实施例13
此实施例的结果示于图13中，并显示了向载体中加载某些脂肪酸对于暴露于其中的细胞的克隆效率是有害的。
在图13所示的实验中，将300μg/g的花生四烯酸或α-亚麻酸加载到特定的BSA样品上，并添加到包含H1，WLS-1C和H9hPSC的培养物中。每种加载的脂肪酸降低了经测试的BSA样品的克隆效率。
虽然已经参考目前被认为是优选实施例的内容描述了本发明，但应理解本发明不限于所公开的实施例。相反，本发明意欲涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的各种改进和等同设置。
所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体地且单个地表示出以通过引用整体并入。

Claims (46)

1.一种用于增强一种或多种哺乳动物干细胞存活或增殖的脂质补充剂，其在载体存在下包含一种或多种脂质。
2.根据权利要求1所述的脂质补充剂，其中所述一种或多种脂质选自：米德酸，花生酸，棕榈油酸，油酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，肉豆蔻酸，亚油酸，硬脂酸，α-亚麻酸，花生四烯酸，胆固醇，DL-α-生育酚和泊洛沙姆188。
3.根据权利要求1或2所述的脂质补充剂，其中所述一种或多种脂质包括油酸和棕榈酸中的一种或两种。
4.根据权利要求2或3所述的脂质补充剂，其中油酸和/或棕榈酸的量大于α-亚麻酸和/或花生四烯酸的量。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的脂质补充剂，其中增强存活或增殖是指提高克隆效率。
6.根据权利要求5所述的脂质补充剂，其中提高克隆效率包括：获得5％至65％的克隆效率。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的脂质补充剂，其中所述一种或多种哺乳动物干细胞是多能干细胞或成体组织干细胞。
8.根据权利要求7所述的脂质补充剂，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的脂质补充剂，其中所述载体是用于将所述一种或多种脂质转运至所述一种或多种哺乳动物干细胞的制剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的脂质补充剂，其中所述载体是白蛋白、脂质体、细胞外囊泡、外泌体、纳米结构脂质载体或环糊精。
11.根据权利要求10所述的脂质补充剂，其中所述白蛋白是人白蛋白。
12.根据权利要求10或11所述的脂质补充剂，其中所述白蛋白是重组白蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的脂质补充剂，其中所述一种或多种脂质中的至少一部分与所述载体结合。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的脂质补充剂，其中所述一种或多种脂质的浓度范围为1ng/mL至35μg/mL。
15.一种用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的培养基，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的脂质补充剂。
16.根据权利要求15所述的培养基，其还包含一种或多种存活因子。
17.根据权利要求16所述的培养基，其中所述一种或多种存活因子包含一种或多种小分子抑制剂。
18.根据权利要求17所述的培养基，其中所述一种或多种小分子抑制剂包括：Thiazovivin、Y-27632、CHIR99021、SB202190、Ml-7、程序性坏死特异性抑制剂-1、NS3694、Wnt-C59、NSCI或BIPV5。
19.根据权利要求17或18所述的培养基，其中所述一种或多种小分子抑制剂包括Rho/Rock途径抑制剂。
20.根据权利要求19所述的培养基，其中Rho/Rock途径抑制剂是Y-27632。
21.根据权利要求21所述的培养基，其中Y-27632的浓度范围为1μM至20μM。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的培养基，其还包含细胞外基质。
23.根据权利要求22所述的培养基，其中所述细胞外基质的浓度低于其凝胶化阈值。
24.根据权利要求23所述的培养基，其中所述凝胶化阈值为约0.5％或更高。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的培养基，其中细胞外基质是天然来源的基质产物或脱细胞基质。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的培养基，其中所述细胞外基质包含一种或多种单基质组分。
27.根据权利要求26所述的培养基，其中所述一种或多种单基质组分是纤连蛋白，胶原蛋白，层粘连蛋白，弹性蛋白，玻连蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素或蛋白多糖。
28.根据权利要求22至24中任一项所述的培养基，其中所述细胞外基质是MatrigelTM。
29.一种用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的培养基，其包含根据权利要求22至28中任一项所述的细胞外基质，和任选的根据权利要求1至14中任一项所述的脂质补充剂。
30.根据权利要求29所述的培养基，其还包含一种或多种存活因子。
31.根据权利要求30所述的培养基，其中所述一种或多种存活因子包括一种或多种小分子抑制剂。
32.根据权利要求31所述的培养基，其中所述一种或多种小分子抑制剂包含Thiazovivin、Y-27632、CHIR99021、SB202190、Ml-7、程序性坏死特异性抑制剂-1、NS3694、Wnt-C59、NSCI或BIPV5。
33.根据权利要求31或32所述的培养基，其中所述一种或多种小分子抑制剂包括Rho/Rock途径抑制剂。
34.根据权利要求33的培养基，其中Rho/Rock途径抑制剂是Y-27632。
35.根据权利要求34所述的培养基，其中Y-27632的浓度范围为1μM至20μM。
36.根据权利要求1至14中任一项所述的脂质补充剂或根据权利要求15至35中任一项所述的培养基的用途，其用于增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述哺乳动物干细胞是多能干细胞。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述多能细胞是胚胎干细胞。
39.根据权利要求36所述的用途，其中所述哺乳动物干细胞是人诱导多能干细胞。
40.一种增强一种或多种哺乳动物干细胞的存活或增殖的方法，该方法包括：
在根据权利要求1至14中任一项的脂质补充剂或根据权利要求15至35中任一项所述的培养基的存在下培养一种或多种哺乳动物干细胞。
41.根据权利要求40所述的方法，其中培养包含：以单层培养。
42.根据权利要求41所述的方法，其中以单层培养包含：将一个或多个细胞接种在细胞外基质中。
43.根据权利要求40所述的方法，其中培养包含：在非粘附条件下培养所述一个或多个细胞。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其还包含：以1个细胞/孔的接种密度接种所述一个或多个细胞直至约1000个细胞/cm2。
45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其还包含：以单细胞接种所述一个或多个细胞。
46.根据权利要求40至45中任一项所述的方法，其还包含：针对所述一个或多个细胞获得约5％至约65％的存活率。
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