JP2020505038A - 幹細胞の生存および増殖を高めるための培地および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
幹細胞研究は、胚発生の研究、疾患モデリング、毒物学的スクリーニングおよび細胞療法と多岐にわたる潜在用途を有する、動きの速い研究分野になってきている。最初のヒト胚性幹細胞株(ESC)の誘導以来、ESCは、再生医療におけるその潜在的な使用のために、幅広い世間の注目を受けている(Thomson et al. 1998)。ESCの一見すると無限の増殖能は、すべての体細胞型に分化するその能力と相まって、ESCを、移植可能なヒト組織の魅力的な再生可能な資源にする。
本開示は、哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための改善された補充物、培養培地および方法に関する。特に、本発明者らは、脂質補充物、例えば脂質強化担体(例えば脂質強化アルブミン)を培養培地に加えることによって、脂質補充物を含まない培養培地と比較して、幹細胞の生存および/または増殖を少なくとも5%〜65%高めることができることを示した。より詳細には、脂質補充物、例えば脂質強化担体(例えば脂質強化アルブミン)を培養培地に加えることによって、幹細胞の生存および/または増殖をおよそ10%〜40%高めることができる。記載される脂質補充物および/または培養培地を使用した場合の平均クローニング効率は、およそ30%である。
a)1つまたは哺乳動物幹細胞を提供する工程;
b)脂質補充物を含む培養培地中で1つまたは複数の哺乳動物幹細胞を培養する工程;
c)1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高める工程;および
d)5%〜65%のクローニング効率を得る工程。
a)1つまたは哺乳動物幹細胞を提供する工程;
b)1つまたは複数の哺乳動物幹細胞を、そのゲル化閾値より低い細胞外マトリックスおよび任意で脂質補充物を含む培養培地中で培養する工程;
c)1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高める工程;および
d)5%〜65%のクローニング効率を得る工程。
本開示は、哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための方法および培地に関する。
本開示の一局面では、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための脂質補充物が提供される。脂質補充物は1種または複数種の脂質を含むことができる。
本開示の一局面では、その中で培養される1つまたは複数の細胞の生存または増殖を高めるための培養培地が提供される。ある特定の態様では、1つまたは複数の細胞は、1つまたは複数の哺乳動物細胞でもよく、より具体的は、1つまたは複数の細胞は、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞でもよい。1つまたは複数の細胞の生存または増殖を高めるための培養培地の様々な態様をさらに以下に記載する。
幹細胞は一般にインビトロで培養される。そのようなインビトロ用途では、特定の培養条件下で幹細胞を培養するのが好ましい。インビトロの幹細胞が特定の培養条件下で培養されない場合、幹細胞は最適以下で成長し得る。ある場合には、最適以下の成長は成長速度の低下を含み得る。他の場合では、最適以下の成長は幹細胞の意図されない分化を含み得る。さらに他の場合では、最適以下の成長は、例えば、アポトーシス、壊死、オートファジーまたはそれ以外による細胞死を含み得る。本発明者らは、脂質補充物を含む培養培地中で幹細胞を培養することが、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めることができることを示した。
12ウェル培養プレートを0.5mLのクローニングマトリックスまたは細胞外マトリックス(CellAdhere(商標)希釈緩衝液中で1:25希釈)でコーティングし、1時間室温に置いた。次いで、マトリックスを吸引し、1mLの培地(10μΜのY27632、または脂質強化アルブミン、GABA、ピペコリン酸、塩化リチウム、FGF、TGFβ、およびY-27632(今後はクローニング補充物と呼ぶ)を含む培地のいずれかが補充された、mTeSR(商標)1またはTeSR(商標)-E8(商標))を各ウェルに加え、プレートを1時間37℃に置いた。hPSC株を個別の細胞に分離し、予熱したプレート中に25細胞/cm2で播種し、2日間37℃に置いた。次いで、新鮮な培地(10μΜのY-27632またはクローニング補充物のいずれかが補充された、mTeSR(商標)1またはTeSR(商標)-E8(商標))を細胞に供給し、これを2日間37℃に置いた。次いで4日目に、1mLのmTeSR(商標)1またはTeSR(商標)-E8(商標)を添加物なしで細胞に供給し、7日目まで毎日供給した。次いで、4%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、これを、アルカリホスファターゼについて染色した。次いで、未分化コロニーを数え、以下の計算を使用して、クローニング効率を決定した:(7日目の未分化コロニーの数(ウェルあたり)/0日目に播種した細胞の数(ウェルあたり))×100。(エラーバーは3回の生物学的反復の標準偏差を表す)。
96ウェル培養プレートを50μLのクローニングマトリックスまたは細胞外マトリックス(CellAdhere(商標)希釈緩衝液中で1:25希釈)でコーティングし、1時間室温に置いた。次いで、マトリックスを吸引し、100μLの培地(10μΜのY-27632またはクローニング補充物のいずれかが補充されたmTeSR(商標)1)を各ウェルに加え、プレートを1時間37℃に置いた。hPSC株を個別の細胞に分離し、これを、1細胞/ウェルでBD FACSAria(商標)Fusionを使用して分取し、2日間37℃に置いた。次いで、細胞に新鮮な培地(10μΜのY-27632またはクローニング補充物のいずれかが補充されたmTeSR(商標)1)を供給し、これを、2日間37℃に置いた。次いで4日目に、100μLのmTeSR(商標)1を添加物なしで細胞に供給し、7日目まで毎日供給した。次いで、4%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、これを、アルカリホスファターゼについて染色した。次いで、未分化コロニーを数え、以下の計算を使用して、クローニング効率を決定した:(未分化コロニーの数(プレートあたり)/(ウェルあたり1細胞で)播種したウェルの数)×100。(エラーバーは2回の技術的反復のSEMを表す)。
8つの非依存的なWLS-1Cクローンを、(実施例2からの)単一細胞が沈着してから10日後に手動で選び取り、mTeSR(商標)1を使用して5回の継代にわたって拡大させ、Gentle Cell Dissociation Reagentを使用して継代した(完全なプロトコールはstemcell.comで入手可能である)。ウェルあたりの凝集塊の総数を各継代の終わりに数えて、凝集塊継代対照と比較して、クローン化した株の日々の拡大倍率を算出した。日々の拡大倍率は、以下の計算を使用して決定した:(継代の終わりの凝集塊の総数/継代の開始時に播種したコロニー数)/培養日数。(エラーバーは少なくとも2回の生物学的反復からのデータを表す)。
12ウェル培養プレートを0.5mLのクローニングマトリックスまたは細胞外マトリックス(CellAdhere(商標)希釈緩衝液中で1:25希釈)でコーティングし、1時間室温に置いた。次いで、マトリックスを吸引し、1mLの試験培地を各ウェルに加えた。異なる試験培地は、対照培地(10μΜのY-27632が補充されたmTeSR(商標)1)、または脂質増強BSAを用いて作られたクローニング補充物を含む培地が補充されたmTeSR(商標)1、またはエタノールのみ、3種の脂肪酸もしくは5種の脂肪酸のいずれかが脂質ローディングされた脂質除去BSAを有するクローニング補充物が補充されたmTeSR(商標)1からなっていた。次いで、プレートを1時間37℃に置いた。hPSC株を個別の細胞に分離し、予熱したプレート中に25細胞/cm2で播種し、2日間37℃に置いた。次いで、対応する試験培地を細胞に供給し、これを、2日間37℃に置いた。次いで4日目に、1mLのmTeSR(商標)1を添加物なしで細胞に供給し、8日目まで毎日供給した。次いで、4%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、これを、アルカリホスファターゼについて染色した。次いで、未分化コロニーを数え、以下の計算を使用して、クローニング効率を決定した:(7日目の未分化コロニーの数(ウェルあたり)/0日目に播種した細胞の数(ウェルあたり))×100。(エラーバーは3回の技術的反復のSEMを表す)。
アルカリホスファターゼ(近赤外)で染色し、ImageXpress Microを使用して画像化した、実施例4(脂質除去BSA1)のウェルの代表的な画像。
本実施例の結果を図6に示し、Y-27632と脂質強化アルブミンか0.2%Matrigel(登録商標)かのいずれかとを含む培地において非接着条件下で培養したSTiPS-M001、H7、およびH9 hPSCは、脂質強化アルブミンフリー培地およびY-27632を用いて培養した場合よりも、ウェルあたり多くの数の回収クローンを示すことを示す。これらの結果は、Y-27632、脂質強化アルブミン、および0.2%Matrigel(登録商標)を含む培地が、実質的および相乗的効果を示すことをさらに示し、これらの成分のいずれか1つを含む培地を使用して観察される回収率を合計することによって予想されるであろうよりも、ウェルあたりはるかに多くの数の回収クローンを有していた。
本実施例の結果を図7に示し、Y-27632ならびに脂質強化アルブミンか脂質強化アルブミンおよび0.2%Matrigel(登録商標)かのいずれかを含む培地において非接着条件下で培養したSTiPS-M001、WLS-1C、H7、およびH9 hPSCは、脂質強化アルブミンフリー培地およびY-27632で培養した場合よりも、ウェルあたり高いクローニング効率(播種した細胞の数で割った回収クローンの数)を示すことを示す。
本実施例の結果を図8に示し、単一脂肪酸、2種の脂肪酸または3種の脂肪酸がローディングされた別の脂質欠乏アルブミン(すなわち、実質的に脂質がない)の存在下で培養したWLS-1C、H1、およびSTiPS-F016細胞が、1種または2種の脂肪酸の性質に応じて変動するクローニング効率レベルを示すことを示す。
本実施例の結果を図9に示し、さらなる低脂質(すなわち、脂質フリー、または脂質が低減した)担体を含む培地に遊離脂肪酸を加えることによって、クローニング効率を高めることができることを示す。
本実施例の結果を図10に示し、mTeSR(商標)1(図10a)中であるかTeSR(商標)E8(商標)(図10b)中であるかを問わず、さらなる低脂質担体の存在下で遊離脂肪酸が与えられる場合、遊離脂肪酸を添加することによって、H1、1Cおよび、STiPS-F016 hPSCについてより良好なクローニング効率が達成されることを示す。
本実施例の結果を図11に示し、4つの異なる供給業者由来の2つの異なるアルブミンまたはアルブミンロットを使用した場合のWLS-1CおよびH1細胞のクローニング効率は、2種の遊離脂肪酸とともに該アルブミンを細胞の培養物に与える場合に高められることを示す。
本実施例の結果を図12に示し、担体の存在下における個々の遊離脂肪酸の、H1およびWLS-1C hPSCのクローニング効率に対する効果を示す。
本実施例の結果を図13に示し、ある特定の脂肪酸を担体にローディングすることが、それらに曝露された細胞のクローニング効率に有害であることを示す。
担体の存在下で1種または複数種の脂質を含む、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための脂質補充物。
[本発明1002]
前記1種または複数種の脂質が、ミード酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ミリストレイン酸、リノール酸、ステアリン酸、αリノレン酸、アラキドン酸、コレステロール、DL-α-トコフェリル、およびKolliphor P188からなる群より選択される、本発明1001の脂質補充物。
[本発明1003]
前記1種または複数種の脂質がオレイン酸およびパルミチン酸の一方または両方を含む、本発明1001または1002の脂質補充物。
[本発明1004]
オレイン酸および/またはパルミチン酸の量がαリノレン酸および/またはアラキドン酸の量より多い、本発明1002または1003の脂質補充物。
[本発明1005]
前記生存または増殖を高めることがクローニング効率を高めることを意味する、本発明1001〜1004のいずれかの脂質補充物。
[本発明1006]
前記クローニング効率を高めることが5%〜65%のクローニング効率を得ることを含む、本発明1005の脂質補充物。
[本発明1007]
前記1つまたは複数の哺乳動物幹細胞が多能性幹細胞または成体組織幹細胞である、本発明1001〜1006のいずれかの脂質補充物。
[本発明1008]
前記多能性幹細胞がES細胞またはiPS細胞である、本発明1007の脂質補充物。
[本発明1009]
前記担体が、前記1種または複数種の脂質を前記1つまたは複数の哺乳動物幹細胞に輸送するための作用物質である、本発明1001〜1008のいずれかの脂質補充物。
[本発明1010]
前記担体がアルブミン、リポソーム、細胞外小胞、エキソソーム、ナノ構造脂質担体、またはシクロデキストリンである、本発明1001〜1009のいずれかの脂質補充物。
[本発明1011]
前記アルブミンがヒトのものである、本発明1010の脂質補充物。
[本発明1012]
前記アルブミンが組換え型のものである、本発明1010または1011の脂質補充物。
[本発明1013]
前記1種または複数種の脂質の少なくともいくつかが前記担体に結合している、本発明1001〜1012のいずれかの脂質補充物。
[本発明1014]
前記1種または複数種の脂質の濃度が1ng/mL〜35μg/mLの範囲である、本発明1001〜1013のいずれかの脂質。
[本発明1015]
本発明1001〜1014のいずれかの脂質補充物を含む、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための培養培地。
[本発明1016]
1種または複数種の生存因子をさらに含む、本発明1015の培養培地。
[本発明1017]
前記1種または複数種の生存因子が1種または複数種の小分子阻害剤を含む、本発明1016の培養培地。
[本発明1018]
前記1種または複数種の小分子阻害剤が、チアゾビビン、Y-27632、CHIR99021、SB202190、MI-7、ネクロスタチン-1、NS3694、Wnt-C59、NSCI、またはBIPV5を含む、本発明1017の培養培地。
[本発明1019]
前記1種または複数種の小分子阻害剤がRho/Rock経路阻害剤を含む、本発明1017または1018の培養培地。
[本発明1020]
前記Rho/Rock経路阻害剤がY-27632である、本発明1019の培養培地。
[本発明1021]
Y-27632の濃度が1μΜ〜20μΜの範囲である、本発明1021の培養培地。
[本発明1022]
細胞外マトリックスをさらに含む、本発明1015〜1021のいずれかの培養培地。
[本発明1023]
前記細胞外マトリックスの濃度がそのゲル化閾値より低い、本発明1022の培養培地。
[本発明1024]
前記ゲル化閾値が約0.5%以上である、本発明1023の培養培地。
[本発明1025]
前記細胞外マトリックスが天然由来のマトリックス生成物または脱細胞化マトリックスである、本発明1022〜1024のいずれかの培養培地。
[本発明1026]
前記細胞外マトリックスが1種または複数種のモノマトリックス成分を含む、本発明1022〜1025のいずれかの培養培地。
[本発明1027]
前記1種または複数種のモノマトリックス成分が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリンサルフェート、またはプロテオグリカンである、本発明1026の培養培地。
[本発明1028]
前記細胞外マトリックスがMatrigel (商標) である、本発明1022〜1024のいずれかの培養培地。
[本発明1029]
本発明1022〜1028のいずれかの細胞外マトリックスおよび任意で本発明1001〜1014のいずれかの脂質補充物を含む、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための培養培地。
[本発明1030]
1種または複数種の生存因子をさらに含む、本発明1029の培養培地。
[本発明1031]
前記1種または複数種の生存因子が1種または複数種の小分子阻害剤を含む、本発明1030の培養培地。
[本発明1032]
前記1種または複数種の小分子阻害剤がチアゾビビン、Y-27632、CHIR99021、SB202190、MI-7、ネクロスタチン-1、NS3694、Wnt-C59、NSCI、またはBIPV5を含む、本発明1031の培養培地。
[本発明1033]
前記1種または複数種の小分子阻害剤がRho/Rock経路阻害剤を含む、本発明1031または1032の培養培地。
[本発明1034]
前記Rho/Rock経路阻害剤がY-27632である、本発明1033の培養培地。
[本発明1035]
Y-27632の濃度が1μΜ〜20μΜの範囲である、本発明1034の培養培地。
[本発明1036]
1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための、本発明1001〜1014のいずれかの脂質補充物または本発明1015〜1035のいずれかの培養培地の使用。
[本発明1037]
前記哺乳動物幹細胞が多能性である、本発明1036の使用。
[本発明1038]
前記多能性細胞が胚性幹細胞である、本発明1037の使用。
[本発明1039]
前記哺乳動物幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、本発明1036の使用。
[本発明1040]
1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための方法であって、本発明1001〜1014のいずれかの脂質補充物または本発明1015〜1035のいずれかの培養培地の存在下で、該1つまたは複数の哺乳動物幹細胞を培養する工程を含む、方法。
[本発明1041]
培養する工程が単層として培養することを含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
単層として培養することが、細胞外マトリックス中に前記1つまたは複数の細胞を播種する工程を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
培養する工程が、前記1つまたは複数の細胞を非接着条件下で培養することを含む、本発明1040の方法。
[本発明1044]
前記1つまたは複数の細胞を1細胞/ウェルから最大約1000細胞/cm 2 までの播種密度で播種する工程をさらに含む、本発明1040〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記1つまたは複数の細胞を単一細胞として播種する工程をさらに含む、本発明1040〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記1つまたは複数の細胞について約5%〜約65%の生存率を得ることをさらに含む、本発明1040〜1045のいずれかの方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなると考えられる。しかし、詳細な説明および特定例は本発明の好ましい態様を示してはいるが、本発明の趣旨および範囲内の様々な変化および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかとなると考えられるので、例示という目的でのみ与えられていることを理解されたい。
Claims (46)
- 担体の存在下で1種または複数種の脂質を含む、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための脂質補充物。
- 前記1種または複数種の脂質が、ミード酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ミリストレイン酸、リノール酸、ステアリン酸、αリノレン酸、アラキドン酸、コレステロール、DL-α-トコフェリル、およびKolliphor P188からなる群より選択される、請求項1記載の脂質補充物。
- 前記1種または複数種の脂質がオレイン酸およびパルミチン酸の一方または両方を含む、請求項1または2記載の脂質補充物。
- オレイン酸および/またはパルミチン酸の量がαリノレン酸および/またはアラキドン酸の量より多い、請求項2または3記載の脂質補充物。
- 前記生存または増殖を高めることがクローニング効率を高めることを意味する、請求項1〜4のいずれか一項記載の脂質補充物。
- 前記クローニング効率を高めることが5%〜65%のクローニング効率を得ることを含む、請求項5記載の脂質補充物。
- 前記1つまたは複数の哺乳動物幹細胞が多能性幹細胞または成体組織幹細胞である、請求項1〜6のいずれか一項記載の脂質補充物。
- 前記多能性幹細胞がES細胞またはiPS細胞である、請求項7記載の脂質補充物。
- 前記担体が、前記1種または複数種の脂質を前記1つまたは複数の哺乳動物幹細胞に輸送するための作用物質である、請求項1〜8のいずれか一項記載の脂質補充物。
- 前記担体がアルブミン、リポソーム、細胞外小胞、エキソソーム、ナノ構造脂質担体、またはシクロデキストリンである、請求項1〜9のいずれか一項記載の脂質補充物。
- 前記アルブミンがヒトのものである、請求項10記載の脂質補充物。
- 前記アルブミンが組換え型のものである、請求項10または11記載の脂質補充物。
- 前記1種または複数種の脂質の少なくともいくつかが前記担体に結合している、請求項1〜12のいずれか一項記載の脂質補充物。
- 前記1種または複数種の脂質の濃度が1ng/mL〜35μg/mLの範囲である、請求項1〜13のいずれか一項記載の脂質。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の脂質補充物を含む、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための培養培地。
- 1種または複数種の生存因子をさらに含む、請求項15記載の培養培地。
- 前記1種または複数種の生存因子が1種または複数種の小分子阻害剤を含む、請求項16記載の培養培地。
- 前記1種または複数種の小分子阻害剤が、チアゾビビン、Y-27632、CHIR99021、SB202190、MI-7、ネクロスタチン-1、NS3694、Wnt-C59、NSCI、またはBIPV5を含む、請求項17記載の培養培地。
- 前記1種または複数種の小分子阻害剤がRho/Rock経路阻害剤を含む、請求項17または18記載の培養培地。
- 前記Rho/Rock経路阻害剤がY-27632である、請求項19記載の培養培地。
- Y-27632の濃度が1μΜ〜20μΜの範囲である、請求項21記載の培養培地。
- 細胞外マトリックスをさらに含む、請求項15〜21のいずれか一項記載の培養培地。
- 前記細胞外マトリックスの濃度がそのゲル化閾値より低い、請求項22記載の培養培地。
- 前記ゲル化閾値が約0.5%以上である、請求項23記載の培養培地。
- 前記細胞外マトリックスが天然由来のマトリックス生成物または脱細胞化マトリックスである、請求項22〜24のいずれか一項記載の培養培地。
- 前記細胞外マトリックスが1種または複数種のモノマトリックス成分を含む、請求項22〜25のいずれか一項記載の培養培地。
- 前記1種または複数種のモノマトリックス成分が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリンサルフェート、またはプロテオグリカンである、請求項26記載の培養培地。
- 前記細胞外マトリックスがMatrigel(商標)である、請求項22〜24のいずれか一項記載の培養培地。
- 請求項22〜28のいずれか一項記載の細胞外マトリックスおよび任意で請求項1〜14のいずれか一項記載の脂質補充物を含む、1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための培養培地。
- 1種または複数種の生存因子をさらに含む、請求項29記載の培養培地。
- 前記1種または複数種の生存因子が1種または複数種の小分子阻害剤を含む、請求項30記載の培養培地。
- 前記1種または複数種の小分子阻害剤がチアゾビビン、Y-27632、CHIR99021、SB202190、MI-7、ネクロスタチン-1、NS3694、Wnt-C59、NSCI、またはBIPV5を含む、請求項31記載の培養培地。
- 前記1種または複数種の小分子阻害剤がRho/Rock経路阻害剤を含む、請求項31または32記載の培養培地。
- 前記Rho/Rock経路阻害剤がY-27632である、請求項33記載の培養培地。
- Y-27632の濃度が1μΜ〜20μΜの範囲である、請求項34記載の培養培地。
- 1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための、請求項1〜14のいずれか一項記載の脂質補充物または請求項15〜35のいずれか一項記載の培養培地の使用。
- 前記哺乳動物幹細胞が多能性である、請求項36に記載の使用。
- 前記多能性細胞が胚性幹細胞である、請求項37に記載の使用。
- 前記哺乳動物幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項36に記載の使用。
- 1つまたは複数の哺乳動物幹細胞の生存または増殖を高めるための方法であって、請求項1〜14のいずれか一項記載の脂質補充物または請求項15〜35のいずれか一項記載の培養培地の存在下で、該1つまたは複数の哺乳動物幹細胞を培養する工程を含む、方法。
- 培養する工程が単層として培養することを含む、請求項40記載の方法。
- 単層として培養することが、細胞外マトリックス中に前記1つまたは複数の細胞を播種する工程を含む、請求項41記載の方法。
- 培養する工程が、前記1つまたは複数の細胞を非接着条件下で培養することを含む、請求項40記載の方法。
- 前記1つまたは複数の細胞を1細胞/ウェルから最大約1000細胞/cm2までの播種密度で播種する工程をさらに含む、請求項40〜43のいずれか一項記載の方法。
- 前記1つまたは複数の細胞を単一細胞として播種する工程をさらに含む、請求項40〜44のいずれか一項記載の方法。
- 前記1つまたは複数の細胞について約5%〜約65%の生存率を得ることをさらに含む、請求項40〜45のいずれか一項記載の方法。
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