WO2022173058A1 - 三次元組織体の製造方法及び脂肪由来幹細胞の分化促進方法 - Google Patents

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adipose
stem cells
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史朗 北野
典弥 松▲崎▼
フィオナ ルイス
善弘 素輪
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国立大学法人大阪大学
京都府公立大学法人
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    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional tissue and a method for promoting differentiation of adipose-derived stem cells.
  • a three-dimensional tissue is formed by arranging cells coated with a film containing collagen three-dimensionally to form a three-dimensional tissue.
  • Patent Document 1 comprising mixing cells with a cationic substance and an extracellular matrix component to obtain a mixture, collecting cells from the obtained mixture, and forming cell aggregates on a substrate.
  • Patent Document 2 A method for producing a three-dimensional cell tissue (Patent Document 2) is known.
  • Patent Document 3 the present inventors have found a method for producing a large-sized three-dimensional tissue with a thickness of 1 mm or more with a relatively small number of cells by contacting cells with fragmented exogenous collagen
  • a three-dimensional tissue which is an aggregate of cells artificially produced by cell culture.
  • three-dimensional tissues containing adipocytes are expected to be used as substitutes for experimental animals, transplant materials, etc.
  • differentiation of adipose-derived stem cells is expected.
  • a method to facilitate is desired.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and aims to provide a method for promoting the differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes in the production of three-dimensional tissues containing mature adipocytes.
  • the present inventors have found that incubation of adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor and/or a specific fatty acid promotes the differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes. The inventors have found that it is possible to do so, and have completed the present invention.
  • the present invention includes, for example, the following inventions.
  • [1] Incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of one or more fatty acids selected from the group consisting of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid.
  • a method for producing a three-dimensional tissue containing mature adipocytes comprising: [2] The production method of [1], which comprises incubating the cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • Incubating in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor means incubating in a medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, the manufacturing method according to [2].
  • [5] The production method according to any one of [1] to [4], wherein the adipose-derived stem cells are bovine-derived.
  • [6] The production method according to any one of [1] to [5], wherein the incubation is performed for 96 hours or more and 384 hours or less.
  • a method for promoting differentiation of adipose-derived stem cells comprising: [12] The method of [11], comprising incubating the cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • Incubating in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor means incubating in a medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less.
  • [16] The method of any one of [11]-[15], which comprises incubating the cells comprising at least adipose-derived stem cells with the fragmented extracellular matrix component in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • [17] The method of [16], wherein the fragmented extracellular matrix component is a fragmented collagen component.
  • [P1] A method for producing a three-dimensional tissue containing mature adipocytes, comprising incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • [P2] [P1 ] The manufacturing method as described in. [P3] The method of [P1] or [P2], wherein the cells containing at least adipose-derived stem cells do not contain mature adipocytes.
  • Incubating in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor means incubating in a medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, the production method according to any one of [P1] to [P3].
  • [P5] The production method according to any one of [P1] to [P4], wherein the adipose-derived stem cells are bovine-derived.
  • [P6] The production method according to any one of [P1] to [P5], wherein the incubation is performed for 96 hours or more and 384 hours or less.
  • [P7] The production method according to any one of [P1] to [P6], which comprises incubating the cell with the fragmented extracellular matrix component in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • [P8] The production method according to [P7], wherein in the three-dimensional tissue, the fragmented extracellular matrix component is arranged in the interstices between the cells.
  • [P9] The production method of [P7] or [P8], wherein the fragmented extracellular matrix component is a fragmented collagen component.
  • [P10] The production method according to any one of [P7] to [P9], further comprising the step of contacting the cells with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium before incubation.
  • [P11] A method for promoting differentiation of adipose-derived stem cells, comprising incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • Incubating in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor means incubating in a medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, the method according to [P11].
  • [P13] The method of [P11] or [P12], wherein the adipose-derived stem cells are bovine-derived.
  • [P14] The method according to any one of [P11] to [P13], wherein the incubation is performed for 96 hours or more and 384 hours or less.
  • [P15] The method of any one of [P11] to [P14], which comprises incubating the cells comprising at least adipose-derived stem cells with the fragmented extracellular matrix component in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • [P16] The method of [P15], wherein the fragmented extracellular matrix component is a fragmented collagen component.
  • [P17] The method of [P15] or [P16], further comprising contacting the cells with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium prior to incubation.
  • [P18] A method for promoting differentiation of adipose-derived stem cells, comprising incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid.
  • [P19] The method of [P18], wherein the adipose-derived stem cells are bovine-derived.
  • [P20] The method of [P18] or [P19], wherein the incubation is performed for 96 hours or more and 384 hours or less.
  • [P21] [ P18] to [P20].
  • [P22] The method of [P21], wherein the fragmented extracellular matrix component is a fragmented collagen component.
  • [P23] The method of [P21] or [P22], further comprising contacting the cells with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium prior to incubation.
  • the differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes is promoted.
  • By promoting differentiation into mature adipocytes it becomes possible to produce a three-dimensional tissue containing mature adipocytes in a short period of time.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of comparing the fluorescence intensity of lipid staining with Nile Red of the three-dimensional tissue prepared in Production Example 1 (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ** *p ⁇ 0.001).
  • FIG. 2 is a graph showing the results of comparing the fluorescence intensity of lipid staining with Nile Red in the three-dimensional tissue produced in Production Example 2 (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01).
  • 3 shows the results of lipid staining with Nile Red of the three-dimensional tissue produced in Production Example 3.
  • FIG. White dots indicate nuclei (Hoechst staining).
  • FIG. 4 is a graph showing the results of comparison of the fluorescence intensity increase rate of lipid staining with Nile Red for the three-dimensional tissue produced in Production Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of comparison of the fluorescence intensity increase rate of lipid staining with Nile Red for the three-dimensional tissue produced in Production Example 3.
  • FIG. 5 shows the results of lipid staining of the three-dimensional tissue produced in Production Example 4 with Nile Red.
  • White dots indicate nuclei (Hoechst staining).
  • FIG. 6 is a graph showing the results of comparison of the fluorescence intensity increase rate of lipid staining with Nile Red for the three-dimensional tissue produced in Production Example 4.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of comparison of fluorescence intensity of lipid staining with Nile red of the three-dimensional tissue on day 3, day 7, and day 14 of differentiation in Production Example 5.
  • FIG. 8 shows the results of lipid staining with Nile red of the three-dimensional tissue on day 3 of differentiation in Production Example 5.
  • FIG. White dots indicate nuclei (Hoechst staining).
  • FIG. 9 shows the results of lipid staining with Nile red of the three-dimensional tissue on day 7 of differentiation in Production Example 5.
  • FIG. White dots indicate nuclei (Hoechst staining).
  • 10 shows the results of lipid staining with Nile red of the three-dimensional tissue on day 14 of differentiation in Production Example 5.
  • FIG. White dots indicate nuclei (Hoechst staining).
  • FIG. 11 is a graph showing the results of comparison of the fluorescent intensity of lipid staining with Nile red of the three-dimensional tissue on day 7 of differentiation in Production Example 6.
  • the present invention provides a method for producing a three-dimensional tissue containing mature adipocytes, comprising incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • the term "three-dimensional tissue” means an aggregate of cells (massive cell aggregate) artificially produced by cell culture and arranged three-dimensionally.
  • the three-dimensional tissue contains an extracellular matrix component, which will be described later, cells are three-dimensionally arranged via the extracellular matrix component.
  • the shape of the three-dimensional tissue is not particularly limited, and examples thereof include sheet-like, spherical, substantially spherical, ellipsoidal, substantially ellipsoidal, hemispherical, substantially hemispherical, semicircular, substantially semicircular, A rectangular parallelepiped shape, a substantially rectangular parallelepiped shape, etc. are mentioned.
  • the biological tissue includes sweat glands, lymphatic vessels, sebaceous glands, etc., and has a more complicated structure than a three-dimensional tissue. Therefore, the three-dimensional tissue and living tissue can be easily distinguished.
  • Cells as used herein are not particularly limited, but may be, for example, cells derived from mammals such as monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, and rats.
  • the site of cell origin is not particularly limited, and may be somatic cells derived from bones, muscles, internal organs, nerves, brains, bones, skin, blood, or the like, or germ cells.
  • the cells may be stem cells, or cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells and cell line cells.
  • stem cell means a cell with self-renewal ability and pluripotency.
  • Stem cells include pluripotent stem cells that have the ability to differentiate into any cell tumor and tissue stem cells (also called somatic stem cells) that have the ability to differentiate into specific cell tumors.
  • Pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), somatic cell-derived ES cells (ntES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • Tissue stem cells include, for example, mesenchymal stem cells (eg, adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells), hematopoietic stem cells and neural stem cells.
  • the cells include at least adipose-derived stem cells.
  • the origin of adipose-derived stem cells is not particularly limited, and for example, stem cells collected from subcutaneous adipose tissue, epicardium-derived adipose tissue, or the like may be used.
  • stem cells collected from subcutaneous adipose tissue, epicardium-derived adipose tissue, or the like may be used.
  • the three-dimensional tissue body containing mature adipocytes produced by the method of the present embodiment is finally used as a tissue at a specific part of the living body, it is derived from a tissue corresponding to the tissue at that part. is preferred.
  • the adipose-derived stem cells for example, bovine-derived, horse-derived, mouse-derived, rat-derived, and swine-derived stem cells may be used.
  • differentiation into mature adipocytes can be promoted even when bovine adipose-derived stem cells, which are known to be particularly difficult to differentiate into mature adipocytes, are used. Therefore, it is preferable to use bovine-derived adipose-derived stem cells because the effects of the present invention are more pronounced.
  • the cells may further contain cells other than adipose-derived stem cells.
  • cells other than adipose-derived stem cells include mesenchymal cells such as fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts, colon cancer cells (e.g., human colon cancer cells (HT29)), liver cancer cells, and the like.
  • cancer cells cardiomyocytes, epithelial cells (e.g., human gingival epithelial cells), lymphatic endothelial cells, nerve cells, dendritic cells, hepatocytes, adhesive cells (e.g., immune cells), smooth muscle cells (e.g., aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)), pancreatic islet cells, keratinocytes (eg, human epidermal keratinocytes), and the like.
  • epithelial cells e.g., human gingival epithelial cells
  • lymphatic endothelial cells nerve cells
  • dendritic cells dendritic cells
  • hepatocytes adhesive cells (e.g., immune cells)
  • smooth muscle cells e.g., aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)
  • pancreatic islet cells keratinocytes (eg, human epidermal keratinocytes), and the like.
  • keratinocytes
  • the three-dimensional tissue in this embodiment contains mature adipocytes.
  • 90% or more of the total number of adipocytes are preferably mature adipocytes, and more preferably all are mature adipocytes.
  • adipocyte means all adipocytes other than adipose-derived stem cells, and includes mature adipocytes and adipocytes that are not included in adipose-derived stem cells.
  • lipid droplets can be used as an indicator of the maturity of fat cells.
  • Lipid droplets are intracellular organelles that store lipids such as triglycerides (neutral fats) and cholesterol.
  • lipids such as triglycerides (neutral fats) and cholesterol.
  • adipose tissue-specific proteins such as perilipin
  • the size of the lipid droplets of mature adipocytes varies, for example, when the average value of the lipid droplet size is 20 ⁇ m or more, the adipocytes are mature to some extent, i.e., mature adipocytes can be assumed to be
  • the fat cell content is, for example, 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, or 30% or more with respect to the total number of cells in the three-dimensional tissue, It may be 95% or less, 90% or less, 80% or less, or 75% or less.
  • the content of mature adipocytes is, for example, 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, or 30% or more with respect to the total number of cells in the three-dimensional tissue. may be 95% or less, 90% or less, 80% or less, or 75% or less.
  • the three-dimensional tissue may further contain cells other than mature adipocytes.
  • cells other than mature adipocytes include mesenchymal cells such as fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts, colon cancer cells (e.g., human colon cancer cells (HT29)), liver cancer cells, and the like.
  • cancer cells cardiomyocytes, epithelial cells (e.g., human gingival epithelial cells), lymphatic endothelial cells, nerve cells, dendritic cells, hepatocytes, adhesive cells (e.g., immune cells), smooth muscle cells (e.g., aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)), pancreatic islet cells, keratinocytes (eg, human epidermal keratinocytes), and the like.
  • the present invention has the effect of promoting the differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes, the effect of the present invention becomes more pronounced. It is preferably 10% or less, more preferably 5% or less of the total number of cells in the tissue, and further preferably does not contain adipose-derived stem cells.
  • the three-dimensional tissue may have a vascular network between cells.
  • a vascular network is formed between cells, it is expected that the three-dimensional tissue can be maintained for a long period of time, and that the three-dimensional tissue will be easier to engraft when transplanted into a mammal or the like.
  • Having a vascular network between cells means having a structure in which branched blood vessels extend between cells so as to surround cells, similar to living tissue. Whether or not a vascular network similar to that of the living tissue is formed is determined based on, for example, the number of branched blood vessels and/or the diversity of the length between branched blood vessels and/or the diameter of the blood vessels in the living tissue. can be done. For example, the average number of branched blood vessels in the three-dimensional tissue relative to the average number of branched blood vessels in the living tissue is 80% to 150%, 85% to 130%, or 90% to 120%. In some cases, it may be determined that the number of branches is similar to that of blood vessels in living tissue.
  • the average value of the branching number of blood vessels in the three-dimensional tissue is 2.5 or more and 4.5 or less, or 3.0 or more and 4.2 or less, it is similar to the number of blood vessels branching in the biological tissue. It may be determined that For example, the average value of the length between branches of blood vessels in the three-dimensional tissue relative to the average value of the length between branches of blood vessels in living tissue is 80% or more and 150% or less, 85% or more and 130% or less, and 90%. % or more and 120% or less, it may be determined that the length is similar to the length between branches of blood vessels in living tissue. Both large and small blood vessels are observed in living tissue.
  • a three-dimensional tissue containing mature adipocytes preferably has a vascular network between adipocytes.
  • a vascular network it is preferable not only to have a vascular network, but also to have adipocytes surrounded by blood vessels close to the living tissue.
  • the average lipid droplet size of adipocytes in the three-dimensional tissue according to the present embodiment is 20 ⁇ m to 180 ⁇ m, or 100 ⁇ m to 180 ⁇ m
  • the three-dimensional tissue is similar to fat cells in living tissue You may judge that you have fat cells of
  • the biological tissue and the three-dimensional tissue are compared under the same conditions (for example, per fixed volume, per fixed area in the case of image analysis, per fixed sample, etc.).
  • the thickness of the three-dimensional tissue is preferably 10 ⁇ m or more, more preferably 100 ⁇ m or more, and even more preferably 1000 ⁇ m or more.
  • Such a three-dimensional tissue has a structure closer to that of a living tissue, and is suitable as a substitute for experimental animals and as a transplant material.
  • the upper limit of the thickness of the three-dimensional tissue is not particularly limited, but may be, for example, 10 mm or less, 3 mm or less, 2 mm or less, or 1.5 mm or less. It may be there, or it may be 1 mm or less.
  • the "thickness of the three-dimensional tissue” means the distance between both ends in the direction perpendicular to the main surface when the three-dimensional tissue is in the form of a sheet or a rectangular parallelepiped.
  • the thickness means the distance at the thinnest part of the main surface.
  • the three-dimensional tissue when the three-dimensional tissue is spherical or approximately spherical, it means its diameter. Furthermore, when the three-dimensional tissue is ellipsoidal or substantially ellipsoidal, it means the minor axis thereof. When the three-dimensional tissue has a substantially spherical or substantially ellipsoidal shape and has irregularities on the surface, the thickness is the distance between two points where a straight line passing through the center of gravity of the three-dimensional tissue and the surface intersect. means the shortest distance.
  • the method of this embodiment includes incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor. Incubation in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor promotes the differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes. In the method of the present embodiment, differentiation is promoted while the adipose-derived stem cells are contained in the three-dimensional tissue, or in a situation where the three-dimensional tissue is formed so that the adipose-derived stem cells are contained in the tissue. By promoting differentiation, it is possible to finally produce a three-dimensional tissue containing vascular cells.
  • incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be performed by incubating only the cells in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, the cells and the extracellular matrix
  • the components may be mixed and incubated in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in a state in which a three-dimensional tissue containing cells and extracellular matrix components is formed may be incubated at
  • TGF ⁇ type I receptor inhibitors include inhibitors of ALK5, ALK2, ALK4 and ALK7, which are TGF ⁇ R1 kinases.
  • the TGF ⁇ type I receptor inhibitor is not particularly limited as long as it has an inhibitory effect on the TGF ⁇ type I receptor.
  • ALK5, ALK4 and ALK7 inhibitors include, for example, 4-[4-(1,3-benzodioxyol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide
  • ALK5 inhibitors include, for example, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, 2-(3-(6-methyl Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine, hydrochloride, N-(2-fluorophenyl)-4-([1,2,4]triazolo[1,5- a]pyridin-6-yl)-5-(6-methyl-2-pyridyl)-1H-imidazole-2-methanamine and the like.
  • Incubating in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor may mean, for example, incubating (cultivating) cells containing at least adipose-derived stem cells in a medium containing a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • cells containing at least adipose-derived stem cells are treated with one or more fatty acids selected from the group consisting of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid.
  • Incubation may be performed in the presence of the above fatty acids, or may be performed in the presence of elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid. Incubation may also be performed in the presence of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid. Incubation in the presence of these fatty acids further promotes the differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes.
  • the incubation in the presence of the fatty acid may or may not be performed simultaneously with the incubation in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • the fatty acids described above may be included in the medium along with the TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • a medium containing the fatty acid and the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in advance may be used, or the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be added to the medium containing the fatty acid, and the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be added.
  • the fatty acid may be added to the medium containing the body inhibitor.
  • the cells may be incubated in a medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and the TGF ⁇ type I receptor inhibitor After incubating the cells in a medium containing, the cells may be incubated in a medium containing the fatty acid.
  • the medium may be a solid medium or a liquid medium, preferably a liquid medium.
  • the medium include Eagle's MEM medium, DMEM, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the liquid medium may be in the form of a gel such as fibrin gel, hydrogel, matrigel, collagen gel and gelatin gel. Cells may be added to a gelled liquid medium, or a liquid medium containing cells may be gelled before use.
  • the medium may be a serum-supplemented medium or a serum-free medium.
  • the medium may be a mixed medium in which two types of medium are mixed.
  • the amount of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be an amount sufficient for each adipose - derived stem cell to come into contact with the inhibitor. ⁇ 11 mol to 2.0 ⁇ 10 ⁇ 8 mol, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol to 2.0 ⁇ 10 ⁇ 8 mol, for example, for 5 ⁇ 10 6 cells of adipose-derived stem cells, It may be from 1.0 ⁇ 10 ⁇ 10 mol to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 mol, or from 5.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 mol.
  • the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be, for example, 6.0 ng to 6.0 ⁇ g, or 300 ng to 6.0 ⁇ g, for 1 ⁇ 10 6 cells of adipose-derived stem cells. It may be 30 ng to 30 ⁇ g, or 1500 ng to 30 ⁇ g for ⁇ 10 6 cells.
  • the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is, for example, 0.1 ⁇ M or more and 100 ⁇ M or less. 5 ⁇ M or more and 50 ⁇ M or less, 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, or 2 ⁇ M or more and 8 ⁇ M or less, or 0.5 ⁇ M or more, 0.7 or more, 1 ⁇ M or more, 2 ⁇ M or more, 3 ⁇ M or more, 4 ⁇ M or more, or 5 ⁇ M or more. , 20 ⁇ M or less, 15 ⁇ M or less, 12 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, 8 ⁇ M or less, or 7 ⁇ M or less.
  • the content of each fatty acid in the medium is, for example, 0.1 ⁇ M or more and 200 ⁇ M or less, 2 ⁇ M or more and 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or more and 60 ⁇ M or less, or 30 ⁇ M or more.
  • Each fatty acid is, for example, 2.0 ⁇ 10 ⁇ 11 mol to 4.0 ⁇ 10 ⁇ 8 mol, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol to 2.0 ⁇ per 1 ⁇ 10 6 cells of adipose-derived stem cells. It may be 10 ⁇ 8 mol.
  • the weight of each fatty acid may be, for example, 6 ng to 15 ⁇ g, or 250 ng to 10 ⁇ g for 1 ⁇ 10 6 cells of adipose-derived stem cells.
  • the cell density in the medium before incubation can be appropriately determined according to the shape and thickness of the target three-dimensional tissue, the size of the incubator, and the like.
  • the cell density in the medium can be 1-10 8 cells/mL, 10 3 -10 7 cells/mL.
  • Incubation is not particularly limited, and can be carried out under suitable conditions according to the type of cells to be cultured.
  • the incubation temperature may be 20°C to 40°C, or 30°C to 37°C.
  • the pH of the medium may be 6-8, or 7.2-7.4.
  • the incubation time may be 24 hours or more and 336 hours or less, may be 72 hours or more and 336 hours or less, may be 96 hours or more and 384 hours or less, or may be 96 hours or more and 288 hours or less. good too.
  • the incubation time after addition of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor and/or the fatty acid may be 24 hours or more and 336 hours or less, may be 72 hours or more and 336 hours or less, or may be 96 hours or more. It may be 384 hours or less, or it may be 96 hours or more and 288 hours or less.
  • the incubator (support) used for cell culture is not particularly limited, and may be, for example, a well insert, a low-adhesion plate, or a plate having a U-shaped or V-shaped bottom surface.
  • the cells may be cultured while adhered to the support, the cells may be cultured without being adhered to the support, or the cells may be separated from the support during culture and cultured.
  • a U-shaped or V-shaped bottom surface that inhibits adhesion of the cells to the support is used. It is preferable to use a plate with a low adsorption or a low adsorption plate.
  • the method of this embodiment may comprise incubating cells containing at least adipose-derived stem cells with fragmented extracellular matrix components in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • a TGF ⁇ type I receptor inhibitor By incubating with the fragmented extracellular matrix component, it is possible to obtain a three-dimensional tissue in which cells are three-dimensionally arranged via the fragmented extracellular matrix component. It is preferable that the fragmented extracellular matrix component is a three-dimensional tissue that is arranged in the interstices between the cells. Cells among cells may be allogeneic cells or heterologous cells.
  • the fragmented extracellular matrix component may be added to the medium at the same time as the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and may be added to the medium prior to the TGF ⁇ type I receptor inhibitor. It may be added to the medium or may be added to the medium after the TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • Extracellular matrix component refers to an aggregate of extracellular matrix molecules formed by a plurality of extracellular matrix molecules.
  • Extracellular matrix means a substance that exists outside cells in an organism. Any substance can be used as the extracellular matrix as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates. Specific examples include, but are not limited to, collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, laminin, vitronectin, tenascin, entactin and fibrillin. These extracellular matrix components may be used singly or in combination.
  • the extracellular matrix component may, for example, contain or be a collagen component.
  • the extracellular matrix component in the present embodiment is preferably a substance existing outside animal cells, that is, an animal extracellular matrix component.
  • the extracellular matrix molecule may be a modification or variant of the above extracellular matrix molecule, or a polypeptide such as a chemically synthesized peptide, as long as it does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates. good.
  • the extracellular matrix molecule may have repeats of the Gly-XY sequence characteristic of collagen.
  • Gly represents a glycine residue
  • X and Y each independently represent any amino acid residue.
  • a plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • the proportion of the sequence represented by Gly-XY in the total amino acid sequence may be 80% or more, preferably 95%. That's it.
  • the extracellular matrix molecule may be a polypeptide having an RGD sequence.
  • the RGD sequence refers to a sequence represented by Arg-Gly-Asp (arginine residue-glycine residue-aspartic acid residue). Having an RGD sequence further promotes cell adhesion, making it more suitable as a scaffold material for cell culture, for example.
  • Extracellular matrix molecules containing a sequence represented by Gly-XY and an RGD sequence include collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin and the like.
  • Collagen includes, for example, fibrous collagen and non-fibrous collagen.
  • Fibrous collagen means collagen that is the main component of collagen fibers, and specifically includes type I collagen, type II collagen, type III collagen, and the like.
  • Non-fibrillar collagens include, for example, type IV collagen.
  • Proteoglycans include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycans, heparan sulfate proteoglycans, keratan sulfate proteoglycans, and dermatan sulfate proteoglycans.
  • the extracellular matrix component may contain at least one selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin, and preferably contains collagen, since the effects of the present invention are more pronounced.
  • the collagen is preferably fibrillar collagen, more preferably type I collagen.
  • Commercially available collagen may be used as the fibrillar collagen, and a specific example thereof is porcine skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • the extracellular matrix component may be an animal-derived extracellular matrix component.
  • animal species from which extracellular matrix components are derived include, but are not limited to, humans, pigs, and bovines.
  • As the extracellular matrix component a component derived from one kind of animal may be used, or a combination of components derived from a plurality of kinds of animals may be used.
  • Fragmentation means reducing the size of aggregates of extracellular matrix molecules to a smaller size. Fragmentation may be performed under conditions that cleave bonds within extracellular matrix molecules, or under conditions that do not cleave bonds within extracellular matrix molecules. Extracellular matrices that have been fragmented by the application of physical force usually do not change their molecular structure (the molecular structure is maintained) unlike enzymatic treatment. Fragmented extracellular matrix components may contain defibrated extracellular matrix components (fibrillated extracellular matrix components), which are components obtained by defibrating the above-described extracellular matrix components by applying physical force. . Defibrillation is one mode of fragmentation, and is performed under conditions that do not break bonds within extracellular matrix molecules, for example.
  • the method for fragmenting extracellular matrix components is not particularly limited.
  • the extracellular matrix components may be defibrated by applying physical force using an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, a high-pressure homogenizer, or the like.
  • the extracellular matrix component may be homogenized as it is, or may be homogenized with an aqueous medium such as physiological saline or an organic solvent such as ethanol. It is also possible to obtain millimetre-size and nanometer-size fibrillated extracellular matrix components by adjusting the homogenization time, number of times, and the like.
  • the defibrated extracellular matrix component can also be obtained by defibrating by repeating freezing and thawing.
  • the fragmented extracellular matrix component may at least partially contain a defibrated extracellular matrix component. Moreover, the fragmented extracellular matrix component may consist of only the defibrated extracellular matrix component. That is, the fragmented extracellular matrix component may be a defibrated extracellular matrix component.
  • the defibrated extracellular matrix component preferably contains a fibrillated collagen component (fibrillated collagen component).
  • the defibrated collagen component preferably maintains the triple helical structure derived from collagen.
  • the defibrillated collagen component may be a component that partially maintains the triple helical structure derived from collagen.
  • the shape of the fragmented extracellular matrix component includes, for example, a fibrous shape.
  • the fibrous shape means a shape composed of filamentous collagen components or a shape composed of filamentous extracellular matrix components crosslinked between molecules. At least some of the fragmented extracellular matrix components may be fibrous.
  • Fibrous extracellular matrix components include thin filaments (fibrils) formed by aggregation of multiple filamentous extracellular matrix molecules, filaments formed by further aggregation of filaments, and these filaments. Including defibrated ones. The RGD sequence is preserved without disruption in the fibrous extracellular matrix component.
  • the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 100 nm or more and 400 ⁇ m or less, and may be 100 nm or more and 200 ⁇ m or less. In one embodiment, the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 22 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less. good. In another embodiment, the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 100 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, or 30 ⁇ m or less from the viewpoint of further excellent redispersibility.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average length within the above range, and more preferably a fibrillated collagen component having an average length within the above range.
  • the average diameter of the fragmented extracellular matrix component may be 10 nm or more and 30 ⁇ m or less, 30 nm or more and 30 ⁇ m or less, 50 nm or more and 30 ⁇ m or less, 100 nm or more and 30 ⁇ m or less, or 1 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less. 2 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 4 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, or 5 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average diameter within the above range, and more preferably a fibrillated collagen component having an average diameter within the above range.
  • the average length and average diameter of the fragmented extracellular matrix components can be determined by measuring individual fragmented extracellular matrix components with an optical microscope and analyzing the images.
  • average length means the average length of the measured sample in the longitudinal direction
  • average diameter means the average length of the measured sample in the direction orthogonal to the longitudinal direction. means.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain, for example, a fragmented collagen component or consist of a fragmented collagen component.
  • the “fragmented collagen component” means a fragmented collagen component such as a fibrillar collagen component that maintains a triple helical structure.
  • the average length of the fragmented collagen component is preferably 100 nm to 200 ⁇ m, more preferably 22 ⁇ m to 200 ⁇ m, even more preferably 100 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the average diameter of the fragmented collagen component is preferably 50 nm to 30 ⁇ m, more preferably 4 ⁇ m to 30 ⁇ m, even more preferably 20 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • At least part of the fragmented extracellular matrix components may be crosslinked intermolecularly or intramolecularly.
  • the extracellular matrix component may be intramolecularly or intermolecularly crosslinked with the extracellular matrix molecules that make up the extracellular matrix component.
  • cross-linking methods include physical cross-linking by applying heat, ultraviolet rays, radiation, etc., and chemical cross-linking by cross-linking agents, enzymatic reactions, etc., but the method is not particularly limited. Physical cross-linking is preferred from the standpoint of not interfering with cell growth. Cross-linking (physical cross-linking and chemical cross-linking) may be cross-linking via covalent bonds.
  • the crosslinks may be formed between collagen molecules (triple helix structure) or between collagen fibrils formed by the collagen molecules.
  • the cross-linking may be thermal cross-linking (thermal cross-linking). Thermal crosslinking can be performed, for example, by heat treatment under reduced pressure using a vacuum pump.
  • the extracellular matrix component is crosslinked by forming a peptide bond (-NH-CO-) between the amino group of the collagen molecule and the carboxyl group of the same or another collagen molecule. you can
  • the extracellular matrix component can also be crosslinked by using a crosslinker.
  • the cross-linking agent may be, for example, one capable of cross-linking carboxyl groups and amino groups, or one capable of cross-linking amino groups.
  • As the crosslinking agent for example, aldehyde-based, carbodiimide-based, epoxide-based and imidazole-based crosslinking agents are preferable from the viewpoint of economy, safety and operability.
  • glutaraldehyde 1-ethyl-3-(3 -dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide sulfonate, and other water-soluble carbodiimides.
  • the quantification of the degree of cross-linking can be appropriately selected according to the type of extracellular matrix component, cross-linking means, and the like.
  • the degree of cross-linking may be 1% or more, 2% or more, 4% or more, 8% or more, or 12% or more, and may be 30% or less, 20% or less, or 15% or less.
  • the degree of cross-linking is within the above range, the extracellular matrix molecules can be appropriately dispersed, and the redispersibility after dry storage is good.
  • the degree of cross-linking can be quantified based on the TNBS (trinitrobenzenesulfonic acid) method.
  • the degree of cross-linking by the TNBS method may be within the range described above.
  • the degree of cross-linking by the TNBS method is the proportion of amino groups used for cross-linking among the amino groups in the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix component contains a collagen component
  • the degree of cross-linking measured by the TNBS method is preferably within the above range.
  • the degree of cross-linking may be calculated by quantifying the carboxyl groups.
  • water-insoluble extracellular matrix components may be quantified by the TBO (toluidine blue O) method.
  • the degree of cross-linking by the TBO method may be within the range described above.
  • the content of extracellular matrix components in the three-dimensional tissue may be 0.01 to 90% by mass, preferably 10 to 90% by mass, preferably 10 to 90% by mass, based on the three-dimensional tissue (dry weight). It is preferably 80% by mass, preferably 10 to 70% by mass, preferably 10 to 60% by mass, preferably 1 to 50% by mass, preferably 10 to 50% by mass. is preferred, 10 to 30 mass % is more preferred, and 20 to 30 mass % is more preferred.
  • extracellular matrix component in the three-dimensional tissue means an extracellular matrix component that constitutes the three-dimensional tissue, and may be derived from endogenous extracellular matrix components or exogenous extracellular matrix components. It may be derived from matrix components.
  • Endogenous extracellular matrix components means extracellular matrix components produced by extracellular matrix-producing cells.
  • extracellular matrix-producing cells include mesenchymal cells such as fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts described above. Endogenous extracellular matrix components may be fibrous or non-fibrous.
  • Exogenous extracellular matrix component means an extracellular matrix component supplied from the outside. Exogenous extracellular matrix components may be derived from the same or different animal species as endogenous extracellular matrix components. Examples of animal species from which it is derived include humans, pigs, and bovines. Exogenous extracellular matrix components may also be artificial extracellular matrix components.
  • the extrinsic extracellular matrix component is also referred to as an "exogenous collagen component", and the term “exogenous collagen component”, which means a collagen component supplied from the outside, includes a plurality of collagen components. It is an aggregate of collagen molecules formed by the collagen molecules of , and specifically includes fibrillar collagen, non-fibrillar collagen, and the like.
  • the exogenous collagen component is fibrillar collagen.
  • the fibrillar collagen means a collagen component that is the main component of collagen fibers, and examples thereof include type I collagen, type II collagen, and type III collagen.
  • Commercially available collagen may be used as the fibrillar collagen, and specific examples thereof include porcine skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • Exogenous non-fibrillar collagens include, for example, type IV collagen.
  • the animal species from which the exogenous extracellular matrix component is derived may be different from the cell. Moreover, when the cells contain extracellular matrix-producing cells, the animal species from which the exogenous extracellular matrix component is derived may be different from the extracellular matrix-producing cells. Thus, an exogenous extracellular matrix component may be a heterologous extracellular matrix component.
  • the content of extracellular matrix components constituting the three-dimensional tissue is the endogenous extracellular matrix component and the fragmented cell means the total amount of outer matrix components.
  • the extracellular matrix content can be calculated from the volume of the obtained three-dimensional tissue and the mass of the decellularized three-dimensional tissue.
  • the method for quantifying the amount of collagen component in the three-dimensional tissue includes, for example, the following method for quantifying hydroxyproline.
  • a sample is prepared by mixing hydrochloric acid (HCl) with a solution in which a three-dimensional tissue is dissolved, incubating at a high temperature for a predetermined time, returning to room temperature, and diluting the centrifuged supernatant to a predetermined concentration. After treating the hydroxyproline standard solution in the same manner as the sample, prepare the standard by serially diluting it. Each sample and standard is treated with a hydroxyproline assay buffer and a detection reagent, and the absorbance at 570 nm is measured.
  • the amount of collagen component is calculated by comparing the absorbance of the sample with the standard.
  • the three-dimensional tissue may be directly suspended in high-concentration hydrochloric acid, and the dissolved solution may be centrifuged to recover the supernatant, which may be used to quantify the collagen component.
  • the three-dimensional tissue to be dissolved may be in a state as it is recovered from the culture medium, or may be dissolved in a state in which a liquid component is removed by performing a drying treatment after recovery.
  • the weight after drying should be used as the standard. is preferred.
  • examples of the method for quantifying the amount of collagen components include the following methods.
  • sample preparation The whole amount of the freeze-dried three-dimensional tissue is mixed with 6 mol/L HCl, incubated in a heat block at 95° C. for 20 hours or more, and then returned to room temperature. After centrifugation at 13000 g for 10 minutes, the supernatant of the sample solution is recovered. After appropriately diluting with 6 mol/L HCl so that the results in the measurement described below fall within the range of the calibration curve, a sample is prepared by diluting 200 ⁇ L with 100 ⁇ L of ultrapure water. 35 ⁇ L of sample is used.
  • the collagen component occupying the three-dimensional tissue may be defined by its area ratio or volume ratio.
  • "Define by area ratio or volume ratio” means, for example, collagen components in the three-dimensional tissue by known staining techniques (e.g., immunostaining using anti-collagen antibody, or Masson's trichrome staining) Other tissues It means calculating the ratio of the existing area of the collagen component to the entire three-dimensional tissue body by using macroscopic observation, various microscopes, image analysis software, etc. after making it distinguishable from the structure.
  • the area ratio it is not limited by any cross section or surface in the three-dimensional tissue, but for example, when the three-dimensional tissue is a spherical body etc., it passes through the approximate center It may be defined by a cross-sectional view.
  • the ratio of the area is 0.01 to 99% based on the total area of the three-dimensional tissue, and 1 to 99%. preferably 5 to 90%, preferably 7 to 90%, preferably 20 to 90%, more preferably 50 to 90%.
  • the “collagen component in the three-dimensional tissue” is as described above.
  • the ratio of the area of the collagen component that constitutes the three-dimensional tissue refers to the ratio of the total area of the endogenous collagen component and the exogenous collagen component.
  • the ratio of the area of the collagen component is obtained, for example, by staining the obtained three-dimensional tissue with Masson's trichrome, and comparing the area of the blue-stained collagen component to the total area of the cross section passing through the approximate center of the three-dimensional tissue. It can be calculated as a percentage.
  • the three-dimensional tissue has a trypsin concentration of 0.25%, a temperature of 37° C., a pH of 7.4, and a reaction time of 15 minutes. It is more preferably 90% or more, and even more preferably 90% or more. Such a three-dimensional tissue is stable and resistant to enzymatic degradation during or after culturing.
  • the survival rate can be calculated, for example, from the mass of the three-dimensional tissue before and after trypsinization.
  • the three-dimensional tissue may have a residual rate of 70% or more after collagenase treatment at a collagenase concentration of 0.25%, a temperature of 37 ° C., pH 7.4, and a reaction time of 15 minutes, or 80% or more. is more preferable, and 90% or more is even more preferable.
  • Such a three-dimensional tissue is stable and resistant to enzymatic degradation during or after culturing.
  • Incubating a cell containing at least an adipose-derived stem cell with a fragmented extracellular matrix component in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor means, for example, that cells are incubated with a TGF ⁇ type I receptor inhibitor and a fragmented extracellular matrix component. It may be incubating (cultivating) in a medium containing. At that time, for example, a medium containing a fragmented extracellular matrix component and a TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be used in advance, and the TGF ⁇ type I receptor inhibitor is added to the medium containing the fragmented extracellular matrix component. Alternatively, fragmented extracellular matrix components may be added to the medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • the TGF ⁇ type I receptor inhibitor and/or the fatty acid mentioned above may be contained in the aqueous medium, added before incubation, or added during incubation.
  • the aqueous medium may be the same as during incubation or may be different.
  • the cells may be contacted with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium and incubated, followed by further incubation in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor and/or the fatty acid.
  • the time for contacting and incubating the cells and the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium may be, for example, 12 hours to 72 hours.
  • Aqueous medium means a liquid containing water as an essential component.
  • the aqueous medium is not particularly limited as long as it allows the fragmented extracellular matrix components to exist stably.
  • aqueous media include physiological saline such as phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), and liquid media such as vascular endothelial cell-specific medium (EGM2), but are limited thereto. not.
  • the pH of the aqueous medium is preferably within a range that does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • the pH of the aqueous medium may be, for example, 7.0 or more and 8.0 or less from the viewpoint of reducing the load on the cells when injected into the cells.
  • the pH of the aqueous medium is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9. , or 8.0.
  • the aqueous medium preferably has a buffering capacity in the above pH range, and is more preferably a liquid medium.
  • the liquid medium is not particularly limited, and a suitable medium can be selected according to the type of cells to be cultured.
  • the medium examples include Eagle's MEM medium, DMEM, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the medium may be a serum-supplemented medium or a serum-free medium.
  • the liquid medium may be a mixed medium in which two or more types of medium are mixed.
  • the contacting step includes a method of mixing an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components and an aqueous medium containing cells, a method of adding cells to an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components, and a method of adding cells to an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components.
  • a method of adding an aqueous medium containing an extracellular matrix component to a culture medium a method of adding cells to an aqueous medium containing an extracellular matrix component, and adding an extracellular matrix component and cells to a previously prepared aqueous medium.
  • the methods include, but are not limited to.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the contact step can be appropriately determined according to the shape and thickness of the target three-dimensional tissue, the size of the incubator, and the like.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the aqueous medium in the contacting step may be 0.1-90% by mass, or 1-30% by mass.
  • the amount of the fragmented extracellular matrix component in the contact step is, for example, 0.1 to 100 mg, 0.5 to 50 mg, 0.8 to 25 mg, 1.0 to 1.0 mg for 1.0 ⁇ 10 6 cells. 10 mg, 1.0-5.0 mg, 1.0-2.0 mg, or 1.0-1.8 mg, 0.7 mg or more, 1.1 mg or more, 1.2 mg or more, 1.3 mg or more Or it may be 1.4 mg or more, and may be 7.0 mg or less, 3.0 mg or less, 2.3 mg or less, 1.8 mg or less, 1.7 mg or less, 1.6 mg or less, or 1.5 mg or less.
  • the mass ratio between the fragmented extracellular matrix components and the cells is preferably 1/1 to 1000/1, more preferably 9/1 to 900/1. is more preferable, and 10/1 to 500/1 is even more preferable.
  • the amount of the fragmented extracellular matrix component in the contacting step is 0.1% to 10% by weight, 0.5% to 8% by weight, or 1% to 5% by weight relative to the weight of the entire medium. There may be.
  • An embodiment of the method for producing a three-dimensional tissue may include mixing fibrinogen and thrombin simultaneously or separately in the contacting step, or after the contacting step and before incubation. By mixing fibrinogen and thrombin, they react to form fibrin.
  • the content of fibrinogen may be, for example, 1-10 mg/mL, 2-8 mg/mL, or 5-6 mg/mL relative to the medium.
  • the contacting step and before the incubation it may further comprise a step of co-sedimenting the fragmented extracellular matrix component and the cells in the aqueous medium.
  • a step of co-sedimenting the fragmented extracellular matrix component and the cells in the aqueous medium By carrying out such steps, the distribution of fragmented extracellular matrix components and cells in the three-dimensional tissue becomes more uniform.
  • Specific methods are not particularly limited, but include, for example, a method of centrifuging a culture solution containing fragmented extracellular matrix components and cells.
  • the cell density in the medium before incubation described above may be the same as the cell density in the aqueous medium in the contacting step.
  • the present invention also provides a method for promoting differentiation of adipose-derived stem cells, which comprises incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • incubating adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor can promote differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes.
  • the method of the present embodiment can also be used in the production of tissues involving incubation of cells, and the production of tissues may be three-dimensional culture or two-dimensional culture.
  • the method of the present embodiment promotes differentiation in a state where adipose-derived stem cells are contained in tissue bodies, or promotes differentiation in a situation where tissue bodies are formed such that adipose-derived stem cells are contained in tissue bodies. , thereby finally producing a tissue body containing mature adipocytes.
  • adipose-derived stem cells it is only necessary to promote differentiation by contacting at least a portion of adipose-derived stem cells with a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • TGF ⁇ type I receptor inhibitor it can also be applied to two-dimensional culture.
  • the method of the present embodiment may be a method for promoting differentiation of adipose-derived stem cells in the above-described method for producing a three-dimensional tissue.
  • the method of this embodiment may also include a step of contacting the cells with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium before incubation.
  • cells containing at least adipose-derived stem cells are selected from the group consisting of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid. Also provided is a method of promoting differentiation of adipose-derived stem cells comprising incubating in the presence of fatty acids of Further, in one embodiment, adipose-derived stem cells are incubated in the presence of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid.
  • Differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes can be promoted by incubating adipose-derived stem cells in the presence of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid. can.
  • cells containing at least adipose-derived stem cells are fragmented together with extracellular matrix components selected from the group consisting of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid.
  • extracellular matrix components selected from the group consisting of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid.
  • a three-dimensional tissue in which cells are three-dimensionally arranged via the fragmented extracellular matrix component. It is preferably a three-dimensional tissue in which the fragmented extracellular matrix component is arranged in the interstices between the cells.
  • the method of this embodiment may also include a step of contacting the cells with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium before incubation.
  • a collagen component (crosslinked collagen component) at least partially crosslinked was obtained. Before and after heating at 200° C., no significant change in the appearance of the collagen was observed. 50 mg of the crosslinked collagen component was placed in a 15 mL tube, 5 mL of ultrapure was added, and the mixture was homogenized for 6 minutes using a homogenizer (As One VH-10) to defibrate the crosslinked collagen component.
  • a homogenizer As One VH-10
  • CMF defibrillated collagen component
  • the cells, reagents, preparation method, and the like used in the preparation of the three-dimensional tissue are as follows.
  • (cells and collagen) ⁇ FBS (Thermo Fisher, Gibco) ⁇ Subcutaneous adipose-derived stem cells (ADSC, derived from bovine, collected from beef for meat by a conventional method) ⁇ Erucic acid (Sigma #E3385) ⁇ Elaidic acid (Sigma #E4637) ⁇ Oleic acid (Sigma #O1008) ⁇ Palmitoleic acid (Sigma #P9417) ⁇ Myristoleic acid (Sigma #M3525) Phytanic acid (Sigma #P4060 or LaRoda Fine Chemicals 11-1600) ⁇ Pristanoic acid (Sigma #P6617 or LaRoda Fine Chemicals 11-1500) ⁇ Bovine plasma-derived fibrinogen type IS (Sigma #F8630)
  • DMEM medium high glucose, Nacalai Tesque
  • fibrinogen stock solution Weigh 50 mg of fibrinogen into an Eppendorf tube and immediately add 1 mL of DMEM (0% FBS, 1% antibiotics). After mixing by manually shaking the tube, place in a water bath at 37°C for 3 to 5 minutes, filter through a filter with a pore size of 0.2 ⁇ m, and aliquot into an Eppendorf tube for use.
  • Production example 2 FBS non-fibrillated collagen component containing 1.2% by weight (final concentration), 6 mg/mL (final concentration) fibrinogen, 3 U/mL (final concentration) thrombin, and 5 ⁇ 10 6 cells/mL bovine subcutaneous adipose-derived stem cells
  • 200 ⁇ L of the medium shown in Table 2 below was added. Two days later, the medium was replaced with each medium shown in Table 2 below, the medium was replaced every two days, and the cells were cultured until day 7 (day 9 of seeding) to prepare a three-dimensional tissue.
  • FIG. 2 shows the results of strength comparison.
  • the three-dimensional tissue cultured in the DMEM medium (No. 5) containing 7 types of free fatty acids the fat It was shown that the differentiation of derived stem cells was promoted.
  • erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid and pristanic acid each 50 ⁇ M
  • ALK5 inhibitor (2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazole- 4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical Company No. 14794) was replaced with 200 ⁇ L of DMEM medium containing 0 ⁇ M, 1 ⁇ M, 5 ⁇ M or 10 ⁇ M, the medium was changed every 2 days, and differentiation was performed for 7 days. The cells were cultured until the third day (9th day after seeding) to obtain a three-dimensional tissue.
  • Each of the obtained three-dimensional tissue bodies was lipid-stained with Nile Red, and the nucleus was stained with Hoechst stain.
  • the lipid staining (Nile red) fluorescence intensity was calculated relative to the nuclear staining (Hoechst) fluorescence intensity, and the fluorescence intensity was based on the three-dimensional tissue cultured in DMEM medium containing no ALK5 inhibitor. was calculated (using 3 samples for each condition).
  • FIG. 3 shows a photograph of fluorescence observation of each three-dimensional tissue on day 7 of differentiation (day 9 of culture) using a confocal quantitative image cytometer CQ (Yokogawa).
  • FIG. 4 shows the result of comparison of the fluorescence intensity increase rate in each three-dimensional tissue.
  • the three-dimensional tissue produced in the DMEM medium containing the ALK5 inhibitor Compared to the three-dimensional tissue produced in the DMEM medium containing no ALK5 inhibitor, the three-dimensional tissue produced in the DMEM medium containing the ALK5 inhibitor, it was confirmed that adipogenesis has progressed more ( 3), and an accompanying increase in fluorescence intensity was confirmed (FIG. 4). In particular, when DMEM medium containing 5 ⁇ M or more of the ALK5 inhibitor was used, a 3-fold or more increase in fluorescence intensity was confirmed (FIG. 4). It was shown that the addition of an ALK5 inhibitor promoted the differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes.
  • Production example 4 FBS-free DMEM containing fibrillated collagen component 1.2% by weight (final concentration), 6 mg/mL (final concentration) fibrinogen, 3 U/mL (final concentration) thrombin, and 5 ⁇ 10 6 cells/mL subcutaneous adipose-derived stem cells After inoculating 2 ⁇ L on a 96-well plate (manufactured by IWAKI) and incubating for 15 minutes, 200 ⁇ L of DMEM medium was added and cultured for 48 hours.
  • erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid and pristanic acid each 50 ⁇ M
  • ALK5 inhibitor (2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazole- 4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical Company No. 14794) was replaced with 200 ⁇ L of DMEM medium containing 5 ⁇ M), and cultured by replacing the medium every 2 days to obtain a three-dimensional tissue. .
  • FIG. 5 shows a photograph of nuclei stained with Hoechst staining and fluorescence observed using a confocal quantitative image cytometer CQ (Yokogawa).
  • FIG. 6 shows the rate of increase in fluorescence intensity in each three-dimensional tissue as compared with a three-dimensional tissue cultured for the same period in a DMEM medium containing no ALK5 inhibitor.
  • Adipogenesis was confirmed to proceed in all three-dimensional tissue bodies on differentiation day 3, differentiation day 7, and differentiation day 14 (Fig. 5), and an accompanying increase in fluorescence intensity was confirmed. (Fig. 6).
  • Fig. 5 In particular, in the three-dimensional tissues on day 7 and day 14 of culture, more adipogenesis was observed (Fig. 5), and the increase in fluorescence intensity was also remarkable (Fig. 6). There was not much difference in the rate of increase in fluorescence intensity in the three-dimensional tissue on day 7 of culture and day 14 of culture (Fig. 6).
  • the cells were cultured in 200 ⁇ L of the DMEM medium described in (1) to (3) below, replacing the medium every two days.
  • DMEM medium (1 ⁇ FFA) containing 50 ⁇ M each of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid and pristanic acid
  • DMEM medium (2 ⁇ FFA) containing 100 ⁇ M each of myristoleic acid, phytanic acid and pristanic acid
  • DMEM medium (3 ⁇ FFA) containing 50 ⁇ M each of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic
  • a three-dimensional tissue cultured in a DMEM medium containing erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid particularly a three-dimensional tissue cultured in a medium containing 100 ⁇ M each of the above fatty acids, It was shown that adipocytes have a high degree of maturity and that the differentiation of adipose-derived stem cells is promoted.
  • FIG. 8 shows each three-dimensional tissue on day 3 of differentiation, FIG. 9 on day 7 of differentiation, and FIG. 10 on day 14 of differentiation.
  • Adipogenesis was confirmed to have progressed in all three-dimensional tissues on day 3, day 7, and day 14 of differentiation (Figs. 8 to 10).
  • erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid were found to promote the differentiation of adipose-derived stem cells.
  • the cells were cultured in 200 ⁇ L of DMEM medium of the following (1) to (2), replacing the medium every two days.
  • DMEM medium 7 FFA
  • DMEM medium containing 100 ⁇ M each of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid and pristanic acid
  • DMEM medium containing 100 ⁇ M each of elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid and pristanic acid
  • FIG. 11 shows the results of comparison of lipid-stained (Nile Red) fluorescence intensity with respect to fluorescence intensity.
  • a three-dimensional tissue cultured in a medium containing six types of fatty acids and a three-dimensional tissue cultured in a medium containing seven types of fatty acids have the same degree of adipocyte maturity, and similarly differentiate adipose-derived stem cells. was shown to be promoted.

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Abstract

脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすることを含む、成熟脂肪細胞を含む三次元組織体の製造方法。

Description

三次元組織体の製造方法及び脂肪由来幹細胞の分化促進方法
　本発明は、三次元組織体の製造方法及び脂肪由来幹細胞の分化促進方法に関する。
　人工的に生体組織を模した構造体を作製する手法として、例えば、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、細胞をカチオン性物質及び細胞外マトリックス成分と混合して混合物を得て、得られた混合物から細胞を集めて、基材上に細胞集合体を形成することを含む、立体的細胞組織の製造方法（特許文献２）等が知られている。また、本発明者らは、細胞と断片化された外因性コラーゲンを接触させることで、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造する方法（特許文献３）を提案している。
国際公開第２０１５／０７２１６４号 国際公開第２０１７／１４６１２４号 国際公開第２０１８／１４３２８６号
　上述の製造方法によれば、細胞培養によって人工的に作られる細胞の集合体である三次元組織体を得ることができる。特に、脂肪細胞を含む三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されており、脂肪細胞を含む三次元組織体を製造する際に、脂肪由来幹細胞の分化を促進する方法が望まれている。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、成熟脂肪細胞を含む三次元組織体の製造において、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化を促進させる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、脂肪由来幹細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及び／又は特定の脂肪酸の存在下でインキュベートすることにより、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化が促進されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、例えば、以下の発明を含む。
［１］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすることを含む、成熟脂肪細胞を含む三次元組織体の製造方法。
［２］
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下で上記細胞をインキュベートすることを含む、［１］に記載の製造方法。
［３］
　上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、上記ＴＧＦΒタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、［２］に記載の製造方法。
［４］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞が、成熟脂肪細胞を含まない、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
　上記脂肪由来幹細胞がウシ由来である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法。
［６］
　インキュベートが、９６時間以上３８４時間以下で行われる、［１］～［５］のいずれか一項に記載の製造方法。
［７］
　上記細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の製造方法。
［８］
　上記三次元組織体において、上記断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されている、［７］に記載の製造方法。
［９］
　上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［１０］
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、［７］～［９］のいずれか一項に記載の製造方法。
［１１］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をエルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の分化促進方法。
［１２］
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下で上記細胞をインキュベートすることを含む、［１１］に記載の方法。
［１３］
　上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、［１２］に記載の方法。
［１４］
　上記脂肪由来幹細胞がウシ由来である、［１１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
　インキュベートが、９６時間以上３８４時間以下で行われる、［１１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、［１１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
　上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、［１６］に記載の方法。
［１８］
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、［１６］又は［１７］に記載の方法。
　［Ｐ１］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、成熟脂肪細胞を含む三次元組織体の製造方法。
　［Ｐ２］
　エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下で上記細胞をインキュベートすることを含む、［Ｐ１］に記載の製造方法。
　［Ｐ３］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞が、成熟脂肪細胞を含まない、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の方法。
　［Ｐ４］
　上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、［Ｐ１］～［Ｐ３］のいずれかに記載の製造方法。
　［Ｐ５］
　上記脂肪由来幹細胞がウシ由来である、［Ｐ１］～［Ｐ４］のいずれかに記載の製造方法。
　［Ｐ６］
　インキュベートが、９６時間以上３８４時間以下で行われる、［Ｐ１］～［Ｐ５］のいずれかに記載の製造方法。
　［Ｐ７］
　上記細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、［Ｐ１］～［Ｐ６］のいずれかに記載の製造方法。
　［Ｐ８］
　上記三次元組織体において、上記断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されている、［Ｐ７］に記載の製造方法。
　［Ｐ９］
　上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、［Ｐ７］又は［Ｐ８］に記載の製造方法。
　［Ｐ１０］
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、［Ｐ７］～［Ｐ９］のいずれかに記載の製造方法。
　［Ｐ１１］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の分化促進方法。
　［Ｐ１２］
　上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、［Ｐ１１］に記載の方法。
　［Ｐ１３］
　上記脂肪由来幹細胞がウシ由来である、［Ｐ１１］又は［Ｐ１２］に記載の方法。
　［Ｐ１４］
　インキュベートが、９６時間以上３８４時間以下で行われる、［Ｐ１１］～［Ｐ１３］のいずれかに記載の方法。
　［Ｐ１５］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、［Ｐ１１］～［Ｐ１４］のいずれかに記載の方法。
　［Ｐ１６］
　上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、［Ｐ１５］に記載の方法。
　［Ｐ１７］
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、［Ｐ１５］又は［Ｐ１６］に記載の方法。
　［Ｐ１８］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の分化促進方法。
　［Ｐ１９］
　上記脂肪由来幹細胞がウシ由来である、［Ｐ１８］に記載の方法。
　［Ｐ２０］
　インキュベートが、９６時間以上３８４時間以下で行われる、［Ｐ１８］又は［Ｐ１９］に記載の方法。
　［Ｐ２１］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、断片化細胞外マトリックス成分とともに、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸の存在下でインキュベートすることを含む、［Ｐ１８］～［Ｐ２０］のいずれかに記載の方法。
　［Ｐ２２］
　上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、［Ｐ２１］に記載の方法。
　［Ｐ２３］
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、［Ｐ２１］又は［Ｐ２２］に記載の方法。
　本発明によれば、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化が促進される。成熟脂肪細胞への分化を促進することで、短時間で成熟脂肪細胞を含む三次元組織体を製造可能となる。
図１は、製造例１において作製した三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の蛍光強度を比較した結果を示すグラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図２は、製造例２において作製した三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の蛍光強度を比較した結果を示すグラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図３は、製造例３において作製した三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の結果を示す。白色の点は核（ヘキスト染色）を示す。 図４は、製造例３において作製した三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の蛍光強度の増加率を比較した結果を示すグラフである。 図５は、製造例４において作製した三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の結果を示す。白色の点は核（ヘキスト染色）を示す。 図６は、製造例４において作製した三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の蛍光強度の増加率を比較した結果を示すグラフである。 図７は、製造例５における、分化３日目、７日目及び１４日目の三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の蛍光強度を比較した結果を示すグラフである。 図８は、製造例５における、分化３日目の三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の結果を示す。白色の点は核（ヘキスト染色）を示す。 図９は、製造例５における、分化７日目の三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の結果を示す。白色の点は核（ヘキスト染色）を示す。 図１０は、製造例５における、分化１４日目の三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の結果を示す。白色の点は核（ヘキスト染色）を示す。 図１１は、製造例６における、分化７日目の三次元組織体のナイルレッドによる脂質染色の蛍光強度を比較した結果を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、一実施形態として、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、成熟脂肪細胞を含む三次元組織体の製造方法を提供する。
　本明細書において、「三次元組織体」とは、細胞培養によって人工的に作られ、細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体（塊状の細胞集団）を意味する。三次元組織体が後述する細胞外マトリックス成分を含む場合には、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置される。三次元組織体の形状は、特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
　本明細書において「細胞」は、特に限定されないが、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
　本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能及び多分化能を有する細胞を意味する。幹細胞には、任意の細胞腫に分化する能力を持つ多能性幹細胞と、特定の細胞腫に分化する能力を持つ組織幹細胞（体性幹細胞とも呼ばれる）が含まれる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。組織幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞）、造血幹細胞及び神経幹細胞が挙げられる。
　細胞は、少なくとも脂肪由来幹細胞を含む。脂肪由来幹細胞の由来は特に限定されず、例えば、皮下脂肪組織及び心外膜由来脂肪組織等から採取した幹細胞を用いてもよい。本実施形態の方法により製造する成熟脂肪細胞を含む三次元組織体を、最終的に生体の特定箇所の組織に見立てて利用する場合には、当該箇所の組織に対応する組織由来のものを用いることが好ましい。また、脂肪由来幹細胞は、例えば、ウシ由来、ウマ由来、マウス由来、ラット由来、及びブタ由来等の幹細胞を用いてもよい。本実施形態の方法によれば、成熟脂肪細胞へ特に分化がしにくいと知られているウシ由来の脂肪由来幹細胞を用いても、成熟脂肪細胞への分化を促進することができる。したがって、本発明による効果がより顕著になることから、ウシ由来の脂肪由来幹細胞を用いることが好ましい。
　細胞は、脂肪由来幹細胞以外の細胞を更に含んでいてもよい。脂肪由来幹細胞以外の細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、肝細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ））、膵島細胞、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。ただし、本発明は、脂肪由来幹細胞を成熟脂肪細胞の分化を促進する効果を奏するため、本発明による効果がより顕著になることから、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞、すなわちインキュベート前の細胞は成熟脂肪細胞を含まないことが好ましい。
　本実施形態における三次元組織体は、成熟脂肪細胞を含む。成熟脂肪細胞を含む三次元組織体において、脂肪細胞の全細胞数のうち９０％以上が成熟脂肪細胞であることが好ましく、全てが成熟脂肪細胞であることがより好ましい。なお、本明細書において「脂肪細胞」とは、脂肪由来幹細胞を除くすべての脂肪細胞を意味し、成熟脂肪細胞、及び脂肪由来幹細胞に含まれない脂肪細胞が含まれる。
　脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド（中性脂肪）、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の１重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質（ペリリピン等）の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が２０μｍ以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
　脂肪細胞の含有率は、三次元組織体における全細胞数に対して、例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、又は３０％以上であってよく、９５％以下、９０％以下、８０％以下又は７５％以下であってよい。また、成熟脂肪細胞の含有率は、三次元組織体における全細胞数に対して、例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、又は３０％以上であってよく、９５％以下、９０％以下、８０％以下又は７５％以下であってよい。
　三次元組織体は成熟脂肪細胞以外の細胞を更に含んでいてもよい。成熟脂肪細胞以外の細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、肝細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ））、膵島細胞、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。ただし、本発明は、脂肪由来幹細胞を成熟脂肪細胞の分化を促進する効果を奏するため、本発明による効果がより顕著になることから、インキュベート後の三次元組織体において、脂肪由来幹細胞が三次元組織体における全細胞数に対して１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがより好ましく、脂肪由来幹細胞を含まないことがさらに好ましい。
　三次元組織体は、細胞間に血管網を有するものであってよい。細胞間に血管網が形成されていると、三次元組織体を長期間維持できること、及び、三次元組織体を哺乳類等に移植した際に生着しやすくなることが期待される。
　「細胞間に血管網を有する」とは、生体組織と同様に、分岐した血管が細胞を取り囲むように細胞と細胞の間に延びた構造を有することを意味する。生体組織と同様の血管網が形成されているか否かについては、例えば、生体組織における血管の分岐数及び／又は血管の分岐間の長さ及び／又は血管の直径の多様性に基づき判断することができる。例えば、生体組織における血管の分岐数の平均値に対する、三次元組織体における血管の分岐数の平均値が、８０％以上１５０％以下、８５％以上１３０％以下、又は９０％以上１２０％以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。また、例えば、三次元組織体における血管の分岐数の平均値が、２．５以上４．５以下、又は３．０以上４．２以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。例えば、生体組織における血管の分岐間の長さの平均値に対する、三次元組織体における血管の分岐間の長さの平均値が、８０％以上１５０％以下、８５％以上１３０％以下、及び９０％以上１２０％以下である場合に、生体組織における血管の分岐間の長さと類似していると判断してもよい。生体組織においては、太い血管及び細い血管の両方が観察される。そこで、例えば、生体組織と同様に直径の太いもの（例えば、１０μｍ以上２５μｍ未満）と細いもの（例えば、０μｍ超１０μｍ未満）の両方が観察された場合には、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。また、例えば、０μｍ超２５μｍ未満に血管直径全体の６０％以上、７０％以上又は８０％以上が分布している場合に、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。成熟脂肪細胞を含む三次元組織体は、脂肪細胞間に血管網を有することが好ましい。その場合、血管網を有するだけでなく、血管に取り囲まれる脂肪細胞も生体組織と近いことが好ましい。例えば、本実施形態に係る三次元組織体における脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、２０μｍ～１８０μｍ、又は１００μｍ～１８０μｍである場合に、三次元組織体が生体組織における脂肪細胞と同様の脂肪細胞を有すると判断してもよい。上記生体組織及び三次元組織体の比較に際しては、同じ条件（例えば、一定体積当たり、画像解析であれば一定面積当たり、一定サンプル当たり等）にて生体組織と三次元組織体を比較する。
　上記三次元組織体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。三次元組織体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。
　ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
　また、三次元組織体が球体状又は略球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
　本実施形態の方法においては、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることで、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化が促進される。本実施形態の方法においては、脂肪由来幹細胞が三次元組織体に含まれた状態で分化を促進させること、又は脂肪由来幹細胞が組織体に含まれるように三次元組織体が形成される状況において分化を促進することにより、最終的に血管細胞を含む三次元組織体を作製することができる。したがって、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることは、細胞のみがＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤存在下でインキュベートされてもよく、細胞及び細胞外マトリックス成分が混合された状態でＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤存在下でインキュベートされてもよく、細胞及び細胞外マトリックス成分を含む三次元組織体が形成された状態でＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤存在下でインキュベートされてもよい。
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤としては、例えば、ＴＧＦβＲ１キナーゼである、ＡＬＫ５、ＡＬＫ２、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７の阻害剤が挙げられる。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤は、ＴＧＦβタイプＩ受容体を阻害する作用を有するものであれば、特に制限されない。ＡＬＫ５、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７阻害剤としては、例えば、４－［４－（１，３－ベンゾジオキシオール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミドが挙げられ、ＡＬＫ５阻害剤としては、例えば、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン，塩酸塩、Ｎ－（２－フルオロフェニル）－４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチル－２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－メタンアミン等が挙げられる。
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートするとは、例えば、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベート（培養）することであってよい。
　本実施形態の方法は、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をエルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすることをさらに含んでいてもよい。また、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートしてもよく、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸の存在下でインキュベートしてもよい。また、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸の存在下でインキュベートしてもよい。これらの脂肪酸の存在下でインキュベートすることで、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化がより促進される。上記脂肪酸の存在下でのインキュベートは、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でのインキュベートと同時に行われてもよく、同時に行われなくてもよい。同時に行われる場合には、例えば、上記脂肪酸がＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤とともに培地に含まれてもよい。その際、例えば、予め上記脂肪酸とＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地を使用してもよく、上記脂肪酸を含む培地にＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地に上記脂肪酸を添加してもよい。同時に行われない場合には、例えば、上記脂肪酸を含む培地中で細胞をインキュベートした後、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地中で細胞をインキュベートしてもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地中で細胞をインキュベートした後、上記脂肪酸を含む培地中で細胞をインキュベートしてもよい。
　培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地は、固体培地であっても、液体培地であってもよいが、液体培地であることが好ましい。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。また、液体培地は、フィブリンゲル、ハイドロゲル、マトリゲル、コラーゲンゲル及びゼラチンゲルのようにゲル状のものを用いてもよい。ゲル状の液体培地に細胞を添加してもよく、細胞を含む液体培地をゲル化させて用いてもよい。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の量は、各脂肪由来幹細胞が当該阻害剤に接するのに十分な量であればよく、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、２．０×１０－１１ｍｏｌ～２．０×１０－８ｍｏｌ、又は１．０×１０－９ｍｏｌ～２．０×１０－８ｍｏｌであってよく、例えば、脂肪由来幹細胞５×１０６ｃｅｌｌｓに対して、１．０×１０－１０ｍｏｌ～１．０×１０－７ｍｏｌ、又は５．０×１０－９ｍｏｌ～１．０×１０－７ｍｏｌであってよい。また、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤は、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、６．０ｎｇ～６．０μｇ、又は３００ｎｇ～６．０μｇであってよく、例えば、脂肪由来幹細胞５×１０６ｃｅｌｌｓに対して、３０ｎｇ～３０μｇ、又は１５００ｎｇ～３０μｇであってよい。
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートする場合、培地におけるＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量は、例えば、０．１μＭ以上１００μＭ以下、０．５μＭ以上５０μＭ以下、１μＭ以上１０μＭ以下、又は２μＭ以上８μＭ以下であってもよく、０．５μＭ以上、０．７以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上であってもよく、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１２μＭ以下、１０μＭ以下、８μＭ以下又は７μＭ以下であってもよい。
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を上記脂肪酸が含まれる培地中でインキュベートする場合、培地における各脂肪酸の含有量は、例えば、０．１μＭ以上２００μＭ以下、２μＭ以上１００μＭ以下、１０μＭ以上６０μＭ以下、３０μＭ以上５０μＭ以下、３０μＭ以上１５０μＭ以下、又は８０μＭ以上１２０μＭ以下であってもよく、１μＭ以上、５以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、５０μＭ以上、６０μＭ以上、７０μＭ以上、８０μＭ以上、９０μＭ以上であってもよく、２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１２０μＭ以下、１００μＭ以下、８０μＭ以下又は７０μＭ以下であってもよい。
　各脂肪酸は、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、２．０×１０－１１ｍｏｌ～４．０×１０－８ｍｏｌ、又は１．０×１０－９ｍｏｌ～２．０×１０－８ｍｏｌであってよい。各脂肪酸の重量は、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、６ｎｇ～１５μｇ、又は２５０ｎｇ～１０μｇであってよい。
　インキュベート前の培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培地中の細胞密度は、１～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０３～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。
　インキュベートは、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な条件で行うことができる。例えば、インキュベートの温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。インキュベートの時間は、２４時間以上３３６時間以下であってもよく、７２時間以上３３６時間以下であってもよく、９６時間以上３８４時間以下であってもよく、９６時間以上２８８時間以下であってもよい。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及び／又は上記脂肪酸を添加してからのインキュベートの時間は、２４時間以上３３６時間以下であってもよく、７２時間以上３３６時間以下であってもよく、９６時間以上３８４時間以下であってもよく、９６時間以上２８８時間以下であってもよい。
　細胞の培養に用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。上記細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、上記細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。上記細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。
　本実施形態の方法は、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含んでもよい。断片化細胞外マトリックス成分とともにインキュベートすることで、断片化細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置された三次元組織体を得ることができる。断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されている三次元組織体であることが好ましい。細胞同士における細胞は、同種細胞であってもよく、異種細胞であってもよい。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地を用いる場合において、断片化細胞外マトリックス成分は、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤と同時に培地に添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤より先に培地に添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤より後に培地に添加してもよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を断片化して得ることができる。本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらの１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲン成分を含んでいてよく、コラーゲン成分であってもよい。本実施形態における細胞外マトリックス成分は、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。
　細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。細胞外マトリックス分子は、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列の繰り返しを有するものであってよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することによって、分子鎖の配置への束縛が少なくなるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としての機能がより一層優れたものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックス分子において、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックス分子は、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってもよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（アルギニン残基－グリシン残基－アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。ＲＧＤ配列を有することによって、細胞接着がより一層促進されるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としてより一層好適なものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン等が挙げられる。
　コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞外マトリックス成分は、本発明による効果がより顕著になることから、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。
　細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。
　「断片化」とは、細胞外マトリックス分子の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断する条件で行われてもよいし、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われてもよい。物理的な力の印加によって断片化された細胞外マトリックスは、酵素処理とは異なり、通常、分子構造は断片化する前とは変化しない（分子構造は維持されている）。断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である、解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含んでいてよい。解繊は、断片化の一態様であり、例えば、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
　細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。細胞外マトリックス成分を解繊する方法としては、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を解繊してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体や、エタノール等の有機溶媒でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの解繊細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。解繊細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで解繊することにより得ることもできる。
　断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分であってよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン成分（解繊コラーゲン成分）を含むことが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。
　断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状のコラーゲン成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が分子間で架橋して構成される形状を意味する。断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であってよい。線維状の細胞外マトリックス成分には、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細線維）、細線維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。線維状の細胞外マトリックス成分ではＲＧＤ配列が破壊されることなく保存されている。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均長が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均径は、１０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、３０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、５０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１μｍ以上３０μｍ以下であってよく、２μｍ以上３０μｍ以下であってよく、３μｍ以上３０μｍ以下であってよく、４μｍ以上３０μｍ以下であってよく、５μｍ以上３０μｍ以下であってよい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均径が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
　断片化細胞外マトリックス成分は、例えば、断片化コラーゲン成分を含んでいてよく、断片化コラーゲン成分からなっていてよい。「断片化コラーゲン成分」とは、線維性コラーゲン成分等のコラーゲン成分を断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲン成分の平均長は、１００ｎｍ～２００μｍであることが好ましく、２２μｍ～２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ～２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲン成分の平均径は、５０ｎｍ～３０μｍであることが好ましく、４μｍ～３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ～３０μｍであることがさらにより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を構成する細胞外マトリックス分子の分子内又は分子間で架橋されていてよい。
　架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。細胞の生育を妨げない観点からは、物理架橋が好ましい。架橋（物理架橋及び化学架橋）は、共有結合を介した架橋であってよい。
　細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、架橋は、コラーゲン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細繊維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）であってよい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。コラーゲン成分の熱架橋を行う場合、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン分子のアミノ基が、同一又は他のコラーゲン分子のカルボキシ基とペプチド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）を形成することにより、架橋されていてよい。
　細胞外マトリックス成分は架橋剤を使用することによっても、架橋させることができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
　架橋度の定量は、細胞外マトリックス成分の種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。架橋度が上記範囲にあることにより、細胞外マトリックス分子が適度に分散することができ、また、乾燥保存後の再分散性が良好である。
　細胞外マトリックス成分中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、ＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）法に基づき定量することが可能である。ＴＮＢＳ法による架橋度が、上述の範囲内であってもよい。ＴＮＢＳ法による架橋度は、細胞外マトリックスが有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合である。細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、ＴＮＢＳ法により測定される架橋度が上記範囲内であることが好ましい。
　架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックス成分の場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。ＴＢＯ法による架橋度が、上述した範囲内であってもよい。
　三次元組織体における細胞外マトリックス成分含有率は、上記三次元組織体（乾燥重量）を基準として０．０１～９０質量％であってよく、１０～９０質量％であることが好ましく、１０～８０質量％であることが好ましく、１０～７０質量％であることが好ましく、１０～６０質量％であることが好ましく、１～５０質量％であることが好ましく、１０～５０質量％であることが好ましく、１０～３０質量％であることがより好ましく、２０～３０質量％であることがより好ましい。
　ここで、「三次元組織体における細胞外マトリックス成分」とは、三次元組織体を構成する細胞外マトリックス成分を意味し、内因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよく、外因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよい。
　「内因性の細胞外マトリックス成分」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックス成分を意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、例えば、上述した線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられる。内因性細胞外マトリックス成分は、線維性であってもよいし、非線維性であってもよい。
　「外因性の細胞外マトリックス成分」とは、外部から供給される細胞外マトリックス成分を意味する。外因性の細胞外マトリックス成分は、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックス成分と同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックス成分は、人工の細胞外マトリックス成分であってもよい。
　細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合には、外因性の細胞外マトリックス成分は「外因性コラーゲン成分」とも称され、外部から供給されるコラーゲン成分を意味する「外因性コラーゲン成分」は、複数のコラーゲン分子によって形成されている、コラーゲン分子の集合体であり、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲン成分は、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲン成分を意味し、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンが挙げられる。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてもよい。つまり、外因性の細胞外マトリックス成分は、異種細胞外マトリックス成分であってよい。
　すなわち、三次元組織体が内因性細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分を含む場合、上記三次元組織体を構成する細胞外マトリックス成分含有率は、内因性細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計量を意味する。上記細胞外マトリックス含有率は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。
　例えば、三次元組織体に含まれる細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合、三次元組織体におけるコラーゲン成分量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン成分定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン成分定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、構造体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン成分量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。
　コラーゲン成分量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
（サンプルの調製）
　凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。
（スタンダードの調製）
　スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ　ｉｎ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。
（アッセイ）
　３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　（ｒｅａｇｅｎｔ　Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。
　三次元組織体中に占めるコラーゲン成分を、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲン成分を既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲン成分の存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば三次元組織体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。
　例えば、三次元組織体中のコラーゲン成分を面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１～９９％であり、１～９９％であることが好ましく、５～９０％であることが好ましく、７～９０％であることが好ましく、２０～９０％であることが好ましく、５０～９０％であることがより好ましい。「三次元組織体におけるコラーゲン成分」については、上述したとおりである。三次元組織体を構成するコラーゲン成分の面積の割合は、内因性コラーゲン成分及び外因性コラーゲン成分を合わせた面積の割合を意味する。コラーゲン成分の面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲン成分の面積の割合として算出することが可能である。
　三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
　上記三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートするとは、例えば、細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及び断片化細胞外マトリックス成分が含まれる培地中でインキュベート（培養）することであってよい。その際、例えば、予め断片化細胞外マトリックス成分とＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地を使用してもよく、断片化細胞外マトリックス成分を含む培地にＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地に断片化細胞外マトリックス成分を添加してもよい。
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含んでいてもよい。この場合、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及び／又は上述した脂肪酸は、水性媒体中に含まれていてもよく、インキュベート前に添加してもよく、インキュベート中に添加してもよい。水性媒体は、インキュベート時と同じであってもよく、異なっていてもよい。水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させてインキュベートすることで、断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されており、細胞と断片化細胞外マトリックス成分が三次元組織体全体に渡って三次元的に均一に分布した三次元組織体を製造することができる。例えば、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させてインキュベートした後に、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及び／又は上記脂肪酸の存在下でさらにインキュベートしてもよい。水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させてインキュベートする時間は、例えば、１２時間～７２時間であってもよい。
　「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、断片化細胞外マトリックス成分が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、水性媒体として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられるがこれに制限されない。
　水性媒体のｐＨは細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない範囲が好ましい。水性媒体のｐＨは、細胞に投入した際の細胞への負荷を軽減する観点から、例えば、７．０以上であってよく、８．０以下であってよい。具体的には、水性媒体のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０であってよい。水性媒体は、上記ｐＨの範囲において緩衝能を有することが好ましく、より好ましくは液体培地である。液体培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。当該培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進し得る。接触工程としては、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体と細胞を含有する水性媒体とを混合する方法、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を添加する方法、細胞を含む培養液に細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体を加える方法、細胞外マトリックス細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を加える方法、予め用意した水性媒体に、細胞外マトリックス成分及び細胞をそれぞれ加える方法等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。
　接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、接触工程における水性媒体中の断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、０．１～９０質量％であってもよいし、１～３０質量％であってもよい。
　接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の量は、例えば、１．０×１０６ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．８～２５ｍｇ、１．０～１０ｍｇ、１．０～５．０ｍｇ、１．０～２．０ｍｇ、又は１．０～１．８ｍｇであってよく、０．７ｍｇ以上、１．１ｍｇ以上、１．２ｍｇ以上、１．３ｍｇ以上又は１．４ｍｇ以上であってよく、７．０ｍｇ以下、３．０ｍｇ以下、２．３ｍｇ以下、１．８ｍｇ以下、１．７ｍｇ以下、１．６ｍｇ以下又は１．５ｍｇ以下であってもよい。
　接触工程において、断片化細胞外マトリックス成分と細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス成分／細胞）は、１／１～１０００／１であることが好ましく、９／１～９００／１であることがより好ましく、１０／１～５００／１であることがさらに好ましい。
　また、接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の量は、培地全体の重量に対して、０．１重量％～１０重量％、０．５重量％～８重量％、又は１～５重量％であってもよい。
　三次元組織体の製造方法の一実施形態は、接触工程、又は接触工程後かつインキュベート前に、フィブリノゲン及びトロンビンを同時に又は別々に混合することを含んでいてよい。フィブリノゲン及びトロンビンを混合することによって、これらが反応してフィブリンが形成される。フィブリノゲンの含有量は、例えば、培地に対して、１～１０ｍｇ／ｍＬであってよく、２～８ｍｇ／ｍＬであってよく、５～６ｍｇ／ｍＬであってもよい。
　接触工程後かつインキュベート前に、水性媒体中における断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを共に沈降させる工程を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における断片化細胞外マトリックス成分及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
　上述したインキュベート前の培地中の細胞密度は、接触工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
　本発明は、一実施形態として、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の分化促進方法も提供する。上述したように、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下で脂肪由来幹細胞をインキュベートすることにより、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化を促進することができる。本実施形態の方法は、細胞のインキュベートを含む組織体の製造においても使用でき、組織体の製造は、三次元培養であっても、二次元培養であってもよい。本実施形態の方法は、脂肪由来幹細胞が組織体に含まれた状態で分化を促進させること、又は脂肪由来幹細胞が組織体に含まれるように組織体が形成される状況において分化を促進することを含み、それにより最終的に成熟脂肪細胞を含む組織体を作製することができる。
　本実施形態の方法は、少なくとも一部の脂肪由来幹細胞がＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤と接触することで分化が促進されればよいため、上述した三次元組織体の製造における三次元培養だけでなく、二次元培養においても適用することができる。
　また、本実施形態の方法は、上述した三次元組織体の製造方法における脂肪由来幹細胞の分化促進方法であってもよい。
　三次元組織体、細胞、インキュベート、断片化細胞外マトリックス成分及び各工程等、本実施形態の方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。例えば、本実施形態の方法においても、インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程を含んでもよい。
　本発明は、一実施形態として、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の分化促進方法も提供する。また、一実施形態として、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の分化促進方法も提供する。エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸の存在下で脂肪由来幹細胞をインキュベートすることにより、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化を促進することができる。
　本実施形態の方法は、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにエルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすること、また、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにエルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及びプリスタン酸の存在下でインキュベートすることを含んでもよい。断片化細胞外マトリックス成分とともにインキュベートすることで、断片化細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置された三次元組織体を得ることができる。断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されている、三次元組織体であることが好ましい。
　三次元組織体、細胞、インキュベート、断片化細胞外マトリックス成分及び各工程等、本実施形態の方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。例えば、本実施形態の方法においても、インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程を含んでもよい。
　以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
　ブタ皮膚由来コラーゲンＩ型スポンジ断片（日本ハム株式会社製）１００ｍｇを２００℃で２４時間加熱を行うことにより、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分（架橋コラーゲン成分）を得た。なお、２００℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。架橋コラーゲン成分５０ｍｇを１５ｍＬチューブに入れ、５ｍＬの超純粋を加え、ホモジナイザー（アズワン社　ＶＨ－１０）を用いて６分間ホモジナイズすることで架橋コラーゲン成分を解繊した。
　２１℃の条件下、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を吸引し、コラーゲンペレットを５ｍＬの新しい超純水と混合し、コラーゲン溶液を作製した。コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上に維持したまま、ソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社　ＶＣ５０）を用いて１００Ｖで２０秒間超音波処理し、ソニケーターを取り出した後コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上で１０秒間冷却することを１００回繰り返した。超音波処理を１００回行った後、コラーゲン溶液を孔径４０μｍのフィルターでろ過し、解繊されたコラーゲン成分（ＣＭＦ）を含む分散液を得た。分散液を常法によって凍結乾燥させることにより、乾燥体として、解繊コラーゲン成分（ＣＭＦ）を得た。ＣＭＦの平均長（長さ）は、１４．８±８．２μｍ（Ｎ＝２０）であった。使用の際には、血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲンを分散させて使用した。
　三次元組織体の作製において用いた細胞、試薬及び作成方法等は以下のとおりである。
（細胞及びコラーゲン）
・ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｇｉｂｃｏ）
・皮下脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ、ウシ由来、食肉用牛肉より常法により採取）
・エルカ酸（シグマ社　＃Ｅ３３８５）
・エライジン酸（シグマ社　＃Ｅ４６３７）
・オレイン酸（シグマ社　＃Ｏ１００８）
・パルミトレイン酸（シグマ社　＃Ｐ９４１７）
・ミリストレイン酸（シグマ社　＃Ｍ３５２５）
・フィタン酸（シグマ社　＃Ｐ４０６０、又はラローダ　ファイン　ケミカルズ社　１１－１６００）
・プリスタン酸（シグマ社　＃Ｐ６６１７、又はラローダ　ファイン　ケミカルズ社　１１－１５００）
・ウシ血漿由来フィブリノゲンＩ－Ｓ型（シグマ社　＃Ｆ８６３０）
（培地及び各種溶液）
・ＤＭＥＭ培地（高グルコース、ナカライテスク社）：以下、単にＤＭＥＭと記載した場合、ＦＢＳを１０％含むものを指すものとする。
・５０ｍｇ／ｍＬ　フィブリノゲンストック溶液：フィブリノゲン　５０ｍｇをエッペンドルフチューブに秤とり、ＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、１％抗生物質）１ｍＬをすぐに加える。手動でチューブを振って混合した後、３７℃のウォーターバスに３～５分間置き、孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
＜三次元組織体の製造＞
製造例１
　得られた解繊コラーゲン成分１．２重量％（最終濃度）、６ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）フィブリノゲン、３Ｕ／ｍＬ（最終濃度）トロンビン、及び５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのウシ皮下脂肪由来幹細胞を含むＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ　２μＬを、９６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）上に播種し、１５分間インキュベートした。１５分後に２００μＬのＤＭＥＭ培地を加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　２日後に上記表１に示す各培地で培地交換し、以降２日ごとに培地を交換して、５日（播種から７日）、９日（播種から１１日）及び１３日（播種から１５日）まで培養し、三次元組織体を得た。得られた各三次元組織体をナイルレッドにより脂質染色し、ヘキスト染色により核を染色した。共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１（ＹＯＫＯＧＡＷＡ）を用いて蛍光観察し、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ，　ＮＩＨ）を用いて、脂質染色（ナイルレッド）総蛍光強度を核（ヘキスト）定量化により標準化し、次いで未分化条件（１とするＤＭＥＭのみの条件）によって標準化し、核染色（ヘキスト）蛍光強度に対する、脂質染色（ナイルレッド）蛍光強度を算出した（各条件につき、２～３サンプル使用）。
　結果を図１に示す。特に５日培養後の三次元組織体において、遊離脂肪酸を含むＤＭＥＭ培地での培養により、脂肪由来幹細胞の分化が促進されていることが示された。
製造例２
　解繊コラーゲン成分１．２重量％（最終濃度）、６ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）フィブリノゲン、３Ｕ／ｍＬ（最終濃度）トロンビン、及び５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのウシ皮下脂肪由来幹細胞を含むＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ　２μＬを、９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）上に播種し１５分インキュベートした後、以下の表２に示される培地を２００μＬ加えた。その２日後に、下記表２に示す各培地で培地交換し、２日ごとに培地を交換し、７日目（播種９日目）まで培養して三次元組織体を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　分化７日目（播種から９日目）の各三次元組織体を、製造例１と同様に、ナイルレッド染色及びヘキスト染色し、核染色（ヘキスト）蛍光強度に対する、脂質染色（ナイルレッド）蛍光強度を比較した結果を図２に示す。従来のよく使用される細胞用培地（Ｎｏ．１～４）を使用した場合と比較しても、７種類の遊離脂肪酸を含むＤＭＥＭ培地（Ｎｏ．５）で培養した三次元組織体において、脂肪由来幹細胞の分化が促進されていることが示された。
製造例３
　解繊コラーゲン成分１．２重量％（最終濃度）、６ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）フィブリノゲン、３Ｕ／ｍＬ（最終濃度）トロンビン、及び５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの皮下脂肪由来幹細胞を含むＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ　２μＬを、９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）上に播種し１５分インキュベートした後、ＤＭＥＭ培地を２００μＬ加え、４８時間培養した。その後、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各５０μＭと、ＡＬＫ５阻害剤（２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４）を０μＭ、１μＭ、５μＭ又は１０μＭを含有するＤＭＥＭ培地２００μＬで培地交換を行い、２日ごとに培地を交換し、分化７日目（播種から９日目）まで培養し、三次元組織体を得た。
　得られた各三次元組織体をナイルレッドにより脂質染色し、ヘキスト染色により核を染色した。製造例１と同様に、核染色（ヘキスト）蛍光強度に対する、脂質染色（ナイルレッド）蛍光強度を算出し、ＡＬＫ５阻害剤を含まないＤＭＥＭ培地にて培養した三次元組織体を基準とした蛍光強度の増加率を算出した（各条件につき、３サンプル使用）。
　分化７日目（培養９日目）の各三次元組織体を、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ（ＹＯＫＯＧＡＷＡ）を用いて蛍光観察した写真を図３に示す。また、各三次元組織体における蛍光強度の増加率を比較した結果を図４に示す。
　ＡＬＫ５阻害剤を含まないＤＭＥＭ培地にて作製した三次元組織体と比較して、ＡＬＫ５阻害剤を含むＤＭＥＭ培地にて作製した三次元組織体において、より脂肪形成が進んでいることが確認され（図３）、また、それに伴う蛍光強度の増加が確認された（図４）。特に、ＡＬＫ５阻害剤を５μＭ以上含むＤＭＥＭ培地を使用した場合において３倍以上の蛍光強度の増加が確認された（図４）。ＡＬＫ５阻害剤の添加により、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化が促進されることが示された。
製造例４
　解繊コラーゲン成分１．２重量％（最終濃度）、６ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）フィブリノゲン、３Ｕ／ｍＬ（最終濃度）トロンビン、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの皮下脂肪由来幹細胞を含むＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ　２μＬを、９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）上に播種し１５分インキュベートした後、ＤＭＥＭ培地２００μＬを加えて４８時間培養した。その後、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各５０μＭと、ＡＬＫ５阻害剤（２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４）を５μＭ含有するＤＭＥＭ培地２００μＬで培地交換を行い、２日ごとに培地を交換して培養し、三次元組織体を得た。
　分化３日目（播種から５日目）、分化７日目（播種から９日目）及び分化１４日目（播種から１６日目）の各三次元組織体を、ナイルレッドにより脂質染色し、ヘキスト染色により核を染色し、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ（ＹＯＫＯＧＡＷＡ）を用いて蛍光観察した写真を図５に示す。また、製造例３と同様に、ＡＬＫ５阻害剤を含まないＤＭＥＭ培地にて同期間培養した三次元組織体とそれぞれ比較した、各三次元組織体における蛍光強度の増加率を図６に示す。
　分化３日目、分化７日目及び分化１４日目のいずれの三次元組織体においても、脂肪形成が進んでいることが確認され（図５）、また、それに伴う蛍光強度の増加が確認された（図６）。特に培養７日目及び培養１４日目の三次元組織体においてより脂肪形成が進んでいることが観察され（図５）、蛍光強度の増加も顕著であった（図６）。培養７日目及び培養１４日目の三次元組織体における蛍光強度の増加率にさほど差は見られなかった（図６）。
製造例５
解繊コラーゲン成分１．２重量％（最終濃度）、６ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）フィブリノゲン、３Ｕ／ｍＬ（最終濃度）トロンビン、及び５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのウシ皮下脂肪由来幹細胞を含むＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ　２μＬを９６ウェルマイクロプレートに播種し１５分インキュベート、その後ＤＭＥＭ培地を加え４８時間培養することで三次元組織体を得た。
　以下の（１）～（３）のＤＭＥＭ培地２００μＬで２日ごとに培地を交換して培養した。
（１）エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各５０μＭを含むＤＭＥＭ培地（１×ＦＦＡ）、（２）エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各１００μＭを含むＤＭＥＭ培地（２×ＦＦＡ）、（３）エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各１５０μＭを含むＤＭＥＭ培地（３×ＦＦＡ）
　（１）～（３）のＤＭＥＭ培地における分化３日目（播種から５日目）、分化７日目（播種から９日目）及び分化１４日目（播種から１６日目）の各三次元組織体を、製造例１と同様に、ナイルレッド染色及びヘキスト染色し、核染色（ヘキスト）蛍光強度に対する、脂質染色（ナイルレッド）蛍光強度を比較した結果を図７に示す。エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸を含むＤＭＥＭ培地で培養した三次元組織体、特に上記脂肪酸各１００μＭを含む培地で培養した三次元組織体において、脂肪細胞の成熟度が高く、脂肪由来幹細胞の分化が促進されていることが示された。
　同様に分化３日目、分化７日目及び分化１４日目の各三次元組織体を、ナイルレッド染色及びヘキスト染色し、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ（ＹＯＫＯＧＡＷＡ）を用いて蛍光観察した写真を図８～１０に示す。図８は分化３日目、図９は分化７日目、図１０は分化１４日目の各三次元組織体を示す。
　分化３日目、分化７日目及び分化１４日目のいずれの三次元組織体においても、脂肪形成が進んでいることが確認された（図８～１０）。組織体を形成した後の培養においても、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸による、脂肪由来幹細胞の分化促進効果が認められた。
製造例６
解繊コラーゲン成分１．２重量％（最終濃度）、６ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）フィブリノゲン、３Ｕ／ｍＬ（最終濃度）トロンビン、及び５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのウシ皮下脂肪由来幹細胞を含むＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ　２μＬを９６ウェルマイクロプレートに播種し１５分インキュベート、その後ＤＭＥＭ培地を加え４８時間培養することで三次元組織体を得た。
　以下の（１）～（２）のＤＭＥＭ培地２００μＬで２日ごとに培地を交換して培養した。
（１）エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各１００μＭを含むＤＭＥＭ培地（７　ＦＦＡ）、
（２）エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各１００μＭを含むＤＭＥＭ培地（６　ＦＦＡ）
　（１）～（２）のＤＭＥＭ培地における分化７日目（播種から９日目）の各三次元組織体を、製造例１と同様に、ナイルレッド染色及びヘキスト染色し、核染色（ヘキスト）蛍光強度に対する、脂質染色（ナイルレッド）蛍光強度を比較した結果を図１１に示す。６種類の脂肪酸を含む培地で培養した三次元組織体と、７種類の脂肪酸を含む培地で培養した三次元組織体とで、脂肪細胞の成熟度は同等であり、同様に脂肪由来幹細胞の分化が促進されていることが示された。

Claims (18)

  1. 　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすることを含む、成熟脂肪細胞を含む三次元組織体の製造方法。
  2. 　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下で前記細胞をインキュベートすることを含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、前記ＴＧＦΒタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞が、成熟脂肪細胞を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記脂肪由来幹細胞がウシ由来である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　インキュベートが、９６時間以上３８４時間以下で行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　前記三次元組織体において、前記断片化細胞外マトリックス成分が前記細胞同士の隙間に配置されている、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、請求項７又は８に記載の製造方法。
  10. 　インキュベート前に、水性媒体中において前記細胞と前記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をエルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の分化促進方法。
  12. 　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下で前記細胞をインキュベートすることを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記脂肪由来幹細胞がウシ由来である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　インキュベートが、９６時間以上３８４時間以下で行われる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、請求項１６に記載の方法。
  18. 　インキュベート前に、水性媒体中において前記細胞と前記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
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