CN116814532A - 一种用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物及其制备方法与应用，属于细胞培养技术领域。所述脂类复合物包括脂类物质、有机溶剂、增溶剂和水按照一定比例制备所得；脂类物质包括α‑亚麻酸、γ‑亚麻酸、油酸、亚油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、豆蔻酸、月桂酸、花生四烯酸、棕榈酸中的一种或几种。本发明的脂类复合物不仅化学成分明确，安全无害，而且配方简化，性能优异，加入培养基中可有效提高细胞生长密度和细胞活率，提高目标蛋白的产量，具有广阔的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物及其制备方法与应用。
背景技术
脂质是生物膜的主要成分，也可以作为哺乳动物细胞的能量来源和信号分子。它们是内质网状和高尔基体的关键组成部分，内质网状和高尔基体是负责蛋白质合成，折叠，翻译后修饰和分泌的细胞器。
通常，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)能够自己合成脂质，重组CHO细胞能够在无脂质培养基中适应和生长，而细胞增殖率和产物活性没有显著下降，现有研究表明，无血清培养基中的脂质补充有益于细胞活力和产物糖基化。事实上，脂质和脂质前体对CHO细胞生长的影响可以根据所提供的脂质或前体的类型而显着变化。因此，培养基中脂质补充剂的选择可对细胞生长产生显着影响。
随着生物制药的飞速发展，哺乳动物细胞培养基也经历了从含有血清的培养基、无血清培养基，无蛋白培养基，无动物源培养基，完全化学成分明确培养基的快速更新迭代，在早期的无血清培养基开发中，为了维持与含有血清培养基相当的性能，各国专家和学者对血清进行了深入的分析，已基本探明血清含有生长因子，激素，蛋白，脂类和其它不明的营养物质，所以在无血清培养基中会添加有一些生长因子，比如IGF，胰岛素等；激素，比如氢化可的松，地塞米松等；蛋白，比如纤维连接蛋白，肽球蛋白等；脂类，脂肪酸，胆固醇等。
脂肪酸和胆固醇在培养基中不是高度可溶或稳定的，溶解度极低，所以绝大多数商业化的化学成份明确培养基基本不含有脂类，但是为了维持细胞更好的生长和提升表达产物，通常会采用后添加的方式。
维持细胞生长和产物表达的重要的生长因子，激素，蛋白都可以稳定的添加到培养基中，而作为动物细胞细胞膜合成和维持细胞生长的脂肪酸由于难溶于水，应用受到了限制，严重影响了无血清培养基的性能，个别培养基虽然添加了脂肪酸，但由于脂肪酸溶解度差，在干粉配液的时候直接被过滤掉了，很难发挥作用。
综上，对于提升哺乳动物细胞生长密度、细胞活率和目标蛋白产物表达产量，提高脂类物质在哺乳动物细胞培养基中的溶解度、脂类物质科学合理的有效配比、增加脂类组分的稳定性以及提高动物细胞对脂类组分的吸收率起到关键作用，进而也是影响生物制药成本的一个重要因素。因此，配制一种可以提升哺乳动物细胞生长密度、细胞活率以及目标蛋白产物表达产量的用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物及其制备方法与应用，解决脂类复合物的有效组分配比及其溶解度的技术问题的同时，有效提升哺乳动物细胞生长密度、细胞活率和目标蛋白表达产量。
本发明的第一个目的是提供一种用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物，所述脂类复合物包括脂类物质；所述脂类物质包括α-亚麻酸，γ-亚麻酸，油酸，亚油酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸、豆蔻酸，月桂酸，花生四烯酸或棕榈酸中的一种或几种。
在一种实施方式中，所述脂类物质包括0.1～2g/L的α-亚麻酸，0.1～2g/L的γ-亚麻酸，0.1～2g/L的油酸，0.1～2g/L的亚油酸，0.1～2g/L的二十碳五烯酸，0.1～2g/L的二十二碳六烯酸、0.1～2g/L的豆蔻酸，0.1～2g/L的月桂酸，0.1～2g/L的花生四烯酸和0.1～2g/L的棕榈酸。
在一种实施方式中，所述脂类复合物还含有有机溶剂和增溶剂。
在一种实施方式中，所述有机溶剂用量为100～500ml/L。
在一种实施方式中，所述增溶剂用量为100～500g/L。
在一种实施方式中，所述有机溶剂为DMSO、甲醇或乙醇中的至少一种。
在一种实施方式中，所述增溶剂为牛血清白蛋白和/或β-环糊精衍生物质。
在一种实施方式中，所述β-环糊精衍生物质包括羟丙基-β-环糊精、甲基化-β-环糊精，磺丁基-β-环糊精，羧甲基-β-环糊精中的至少一种。
本发明的第二个目的是提供一种细胞培养基，所述细胞培养基中含有上述脂类复合物和基础培养基。
在一种实施方式中，所述脂类复合物以(1:200)～(1:1000)的比例加入基础培养基中。
在一种实施方式中，所述基础培养基包括CHO细胞培养基、HEK293细胞培养基、Vero细胞培养基或MDCK细胞培养基。
本发明的第三个目是提供一种制备上述脂类复合物的方法，所述方法为将脂类物质、有机溶剂、牛血清白蛋白和β-环糊精衍生物分散和/或溶解于水中；所述脂类物质包括α-亚麻酸，γ-亚麻酸，油酸，亚油酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸、豆蔻酸，月桂酸，花生四烯酸和棕榈酸。
在一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
1)量取适量的有机溶剂加入洁净的烧杯中，加入脂类物质，搅拌至均匀溶解。
2)量取适量的超纯水加入洁净的烧杯中，加入牛血清白蛋白和/或羟丙基-β-环糊精，搅拌至均匀溶解。
3)将步骤1)的溶液和步骤2)的溶液混合，继续搅拌至完全溶解。
4)使用超纯水定容至终体积。
5)使用外层0.45μm和内层0.2μm的无菌囊氏滤器过滤后，得到脂类复合物，分装，置于4℃储存。
本发明还提供了一种提高目的蛋白产量的方法，所述方法为利用含有上述脂类复合物的培养基或上述细胞培养基进行细胞培养。
在一种实施方式中，所述脂类复合物以(1:200)～(1:1000)的比例加入培养基中。
在一种实施方式中，所述方法在提高目的蛋白产量的同时，提高活细胞密度和细胞活率。
本发明还提供了上述脂类复合物或上述细胞培养基或上述方法在细胞培养中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明的脂类复合物不仅化学成分明确，均为在哺乳动物细胞培养中被广泛使用的成份，安全，无害，而且配方简化，性能优异，加入培养基中可以显著促进哺乳动物细胞对脂类营养的吸收，明显提升无血清培养基的性能，有效提高细胞生长密度和细胞活率，提高目标蛋白的产量，具有广阔的应用价值。
本发明的脂类复合物科学的配比有效提高了脂类物质在培养基/水中的溶解度，增加脂类组分的稳定性和动物细胞对脂类组分的吸收率，不仅化学成分明确，而且安全无害，对于提升哺乳动物细胞培养生长密度、细胞活率和目标蛋白产物表达产量，具有很高的应用价值。
本发选用的有机溶剂和载体能有效提高α-亚麻酸，γ-亚麻酸，油酸，亚油酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸、豆蔻酸，月桂酸，花生四烯酸，棕榈酸中一种或几种脂类复合物在水中的溶解度，溶解后的脂类复合物添加到培养基中容易被细胞吸收，可有效提高细胞生产和高活率的维持时间，具有很高的应用前景。
本发明通过有机溶剂和载体添加量的合理配比，有效保证了α-亚麻酸，γ-亚麻酸，油酸，亚油酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸、豆蔻酸，月桂酸，花生四烯酸，棕榈酸中一种或几种脂类复合物在水中的溶解度和稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。在附图中：
图1是本发明实施例2各组培养基细胞密度示意图；
图2是本发明实施例2各组培养基细胞活率示意图；
图3是本发明实施例2各组培养基细胞蛋白产量示意图；
图4是本发明实施例3各组培养基细胞密度示意图；
图5是本发明实施例3各组培养基细胞活率示意图；
图6是本发明实施例3各组培养基细胞蛋白产量示意图；
图7是本发明实施例4各组培养基细胞密度示意图；
图8是本发明实施例4各组培养基细胞活率示意图；
图9是本发明实施例4各组培养基细胞蛋白产量示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中的材料来源：α-亚麻酸(Sigma，货号L2376)，γ-亚麻酸(Sigma，货号L2378)，油酸(Sigma，货号O1383)，亚油酸(Sigma，货号L1012)，二十碳五烯酸(Biosynth，货号FE164050)，二十二碳六烯酸(Sigma，货号D2534)、豆蔻酸(Sigma，货号M3128)，月桂酸(Sigma，货号W261408)，花生四烯酸(Sigma，货号A3611)，棕榈酸(Sigma，货号P0500)、DMSO(Sigma，货号D2650)、甲醇(Sigma，货号179337)、乙醇(Sigma，货号1.00983)、牛血清白蛋白(Sigma，货号A1933)、羟丙基-β-环糊精(Sigma，货号C0926)、甲基化-β-环糊精(Sigma，货号C4555)，磺丁基-β-环糊精(Biosynth，货号OC59560)，羧甲基-β-环糊精(Sigma，货号21906)；所述商业化细胞培养基为CHO MaxA培养基(迈邦生物，货号MB1101.102)
另，实施例中其他所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1配制脂类复合物
(1)取一个洁净的500mL烧杯，加入200mL DMSO，依次加入1gα-亚麻酸，1gγ-亚麻酸，1g油酸，1g亚油酸，1g二十碳五烯酸，1g二十二碳六烯酸，1g豆蔻酸，1g月桂酸，1g花生四烯酸，1g棕榈酸，加入一个磁力搅拌转子，搅拌至均匀溶解，得到脂质复合物的初级混合液。
(2)取一个洁净的1000mL烧杯，加入500mL超纯水，加入15g牛血白蛋白和100g羟丙基-β-环糊精，加入一个磁力搅拌转子，搅拌至干粉完全溶解成澄清的混合溶液。
(3)将步骤(1)的初级混合液转移至步骤(2)的混合溶液中，继续搅拌，直至溶液成为均一，澄清的溶液。
(4)向步骤(3)的溶液中加入适量超纯水，定容至终体积。随后使用外层0.45μm，内层0.2μm的无菌囊氏滤器过滤，得到无菌的脂类复合物，分装，置于4℃储存，备用。
将配制好的脂类复合物以1:300、1:500或1:700比例加入到商业化无血清培养基中，进行细胞培养测试。例如，脂类复合物的添加比例为1:500，即500mL培养基中添加1mL脂类复合物。
实施例2以CHO MaxA细胞培养基进行CHO K1细胞培养测试
将实施例1配制的脂类复合物分别以1:300、1:500、1:700比例加入到CHO MaxA培养基中，使用不添加脂类复合物的CHO MaxA培养基与添加了脂类复合物的CHO MaxA培养基分别进行表达曲妥珠单抗体的CHO K1细胞的Fed Batch实验测试，并检测细胞密度VCD、细胞活率VIA和抗体产量。
结果如图1～3所示，本发明的脂类复合物以1:300比例加入到CHO MaxA培养基中最高细胞密度PVCD最高，达到4.6×107cells/mL，脂类复合物以1:500比例加入到CHO MaxA培养基中收获时细胞活率最高，达到95％以上，脂类复合物以1:500比例加入到CHO MaxA培养基中抗体产量最高，达到3.5g/L。与不添加脂类复合物的对照组相比，添加不同比例的脂类复合物显著提高了CHO K1的细胞密度、细胞活率以及蛋白产量。
实施例3以HEK293 MaxD细胞培养基进行293细胞培养测试
将实施例1配制的脂类复合物分别以1:300、1:500、1:700比例加入到HEK293 MaxD培养基中，使用添加了脂类复合物的HEK293 MaxD培养基分别进行培养HEK293细胞的转染测试，以不添加脂类混合物的HEK293 MaxD培养基为对照组。
使用洁特SF125透气摇瓶，接种体积27mL，细胞接种密度为3E6cells/mL，加入质粒-PEI复合物3mL，总体积30mL，质粒为表达曲妥珠单抗的质粒pcDNA3.4-H和pcDNA3.4-L，摇床转速为120rpm，5％CO2，振幅50mm。
结果如图4～6所示，可知，脂类复合物以1:300比例加入到HEK293 MaxD培养基中PVCD最高，达到2×107cells/mL，培养过程中细胞活率维持最好，收获时细胞活率最高，达到80％以上，抗体产量最高，达到0.44g/L。
实施例4以1:500的添加比例测试不同脂类物质浓度对测试效果的影响
脂质复合物的配制方法同实施例1，区别在于调整脂质复合物中不同脂质的浓度，设置三组不同脂类物质浓度的脂类复合物，以1：500的添加比例至CHO MaxA细胞培养基，进行表达单抗的CHO K1细胞的培养测试。测试条件为使用洁特125mL透气摇瓶，初始培养体积30mL，初始细胞接种密度为1E6/mL。摇床转速为120rpm，5％CO2，振幅50mm。初始培养温度为36.5℃。当14E6＜VCD＜16E6时，降温至33℃，当20E6＜VCD＜25E6时，降温到31℃。在D1、D3、D5、D7、D9、D11、D12、D13分别取样200μL，取样后测量VCD、VIA等参数，D13样品检查抗体产量。
第一组：脂类物质的浓度，0.5g/Lα-亚麻酸，0.5g/Lγ-亚麻酸，0.5g/L油酸，0.5g/L亚油酸，0.5g/L二十碳五烯酸，0.5g/L二十二碳六烯酸，0.5g/L豆蔻酸，0.5g/L月桂酸，0.5g/L花生四烯酸，0.5g/L棕榈酸；
第二组：脂类物质的浓度，1g/Lα-亚麻酸，1g/Lγ-亚麻酸，1g/L油酸，1g/L亚油酸，1g/L二十碳五烯酸，1g/L二十二碳六烯酸，1g/L豆蔻酸，1g/L月桂酸，1g/L花生四烯酸，1g/L棕榈酸；
第三组：脂类物质的浓度，2g/Lα-亚麻酸，2g/Lγ-亚麻酸，2g/L油酸，2g/L亚油酸，2g/L二十碳五烯酸，2g/L二十二碳六烯酸，2g/L豆蔻酸，2g/L月桂酸，2g/L花生四烯酸，2g/L棕榈酸。
结果如图7～9所示，0.5g/L和1g/L浓度脂类混合物加入到CHO MaxA培养基中PVCD最高，达到3×107cells/mL以上，0.5g/L浓度脂类混合物加入到CHO MaxA培养基中收获时细胞活率最高，达到80％以上，0.5g/L浓度脂类混合物加入到CHO MaxA培养基中抗体产量最高，达到5.5g/L，较1g/L浓度脂类混合物略高一点，2g/L浓度脂类混合物在PVCD、收获活率和产量方面均是最低的。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种用于哺乳动物细胞培养基的脂类复合物，其特征在于，所述脂类复合物包括脂类物质、有机溶剂和增溶剂；所述脂类物质包括α-亚麻酸，γ-亚麻酸，油酸，亚油酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸、豆蔻酸，月桂酸，花生四烯酸，棕榈酸中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的脂类复合物，其特征在于，所述脂类物质包括0.1～2g/L的α-亚麻酸，0.1～2g/L的γ-亚麻酸，0.1～2g/L的油酸，0.1～2g/L的亚油酸，0.1～2g/L的二十碳五烯酸，0.1～2g/L的二十二碳六烯酸、0.1～2g/L的豆蔻酸，0.1～2g/L的月桂酸，0.1～2g/L的花生四烯酸和0.1～2g/L的棕榈酸；所述有机溶剂用量为100～500ml/L，所述增溶剂用量为100～500g/L。
3.权利要求1或2所述的脂类复合物，其特征在于，所述有机溶剂为DMSO、甲醇或乙醇中的至少一种；所述增溶剂为牛血清白蛋白和/或β-环糊精衍生物质。
4.权利要求3所述的脂类复合物，其特征在于，所述β-环糊精衍生物质包括羟丙基-β-环糊精、甲基化-β-环糊精，磺丁基-β-环糊精，羧甲基-β-环糊精中的至少一种。
5.一种细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基中含有权利要求1～4任一所述脂类复合物和基础培养基。
6.根据权利要求5所述的细胞培养基，其特征在于，所述脂类复合物以(1:200)～(1:1000)的比例加入基础培养基中。
7.根据权利要求5或6所述的细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基包括CHO细胞培养基、HEK293细胞培养基、Vero细胞培养基或MDCK细胞培养基。
8.一种制备权利要求1～4任一所述脂类复合物的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：
1)量取适量的有机溶剂加入洁净的烧杯中，依次加入α-亚麻酸，γ-亚麻酸，油酸，亚油酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸、豆蔻酸，月桂酸，花生四烯酸或棕榈酸中的一种或几种，搅拌至均匀溶解；
2)量取适量的超纯水加入洁净的烧杯中，加入牛血清白蛋白和/或羟丙基-β-环糊精中的一种或几种，搅拌至均匀溶解；
3)将步骤1)的溶液和步骤2)的溶液混合，继续搅拌至完全溶解；
4)使用超纯水定容至终体积；
5)使用外层0.45μm和内层0.2μm的无菌囊氏滤器过滤后，得到脂类复合物，分装，置于4℃储存。
9.权利要求1～4任一所述脂类复合物或权利要求5～7任一所述细胞培养基或权利要求8所述方法在细胞培养中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为提高目的蛋白的产量、提高活细胞密度和/或细胞活率。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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