CN116004517A - 一种化学成分限定培养基及应用 - Google Patents

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CN116004517A CN202310154948.1A CN202310154948A CN116004517A CN 116004517 A CN116004517 A CN 116004517A CN 202310154948 A CN202310154948 A CN 202310154948A CN 116004517 A CN116004517 A CN 116004517A
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王延涛
李国军
戴秀秀
宋义高
吴书音
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Shanghai Maibang Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请提供一种化学成分限定培养基及应用，涉及细胞工程技术领域。该化学成分限定培养基由氨基酸、脂类、维生素、糖类、有机化合物和无机化合物组成，配方在营养成分上全面，并且化学成分限定培养基成分确定，无动物源，不含蛋白质或生长因子，支持多种不同类型的HEK293细胞的培养，具有更好的原材料可追溯性和更好的批次间一致性，有助于工艺性能的一致性。本申请提供的化学成分限定培养基能够用于不同细胞的快速增殖和高密度培养，能够有效进行蛋白质表达，将蛋白表达量提高到g/L级别以上的水平，易于放大培养规模，适用于平板、摇瓶、TPP管、Wave及其他反应器，使用方便。

Description

一种化学成分限定培养基及应用
技术领域
本申请涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种化学成分限定培养基及应用。
背景技术
哺乳动物细胞是重组治疗性蛋白、疫苗、抗癌药物和其他临床相关药物等生物制药产品的重要生产平台，常用哺乳动物细胞系如CHO细胞，HEK293细胞，Vero细胞，MDCK细胞等。哺乳动物细胞的主要优点是可用于产生含有多种翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、硫酸酯化和磷酸化等。
其中，HEK293细胞是所有人类细胞系中最常用的宿主细胞之一。目前，HEK293细胞已被广泛应用于多个领域，成为蛋白质、疫苗、抗癌药物和重组腺病毒载体生产的强大载体和新平台，为适应不同平台的需求，HEK293具有不同的亚型及应用方向。HEK293细胞作为宿主细胞有以下几个原因：(1)用于转染生产重组蛋白，具有较高的转染效率；(2)用于生物制药，可以进行大规模悬浮培养；(3)具备所有人源蛋白翻译后修饰的能力，可生产与天然人源蛋白最相似的蛋白质；(4)可快速且高细胞密度的生长，培养方式及代谢和基因工程的灵活性，使其成为一种高效的生物治疗药物的生产工具；(5)因与早期分化神经元相似，在体外更容易受到环境因素的影响，常被用作新药发现和毒性测试的模型。
然而，目前市售的HEK293培养基多是含有血清成分的传统培养基并且在抗体的瞬转表达培养中产量比较低。随着现代生物技术的发展，含血清的传统培养基表现出越来越多的劣势，比如：血清成分复杂，不同批次间成分比例有偏差，其中可能含有一定量的有毒物质和抑制因子，影响细胞的代谢和实验数据的准确性等。
新一代合成培养基—化学成分限定培养基(Chemically Defined Medium，CDM)的出现解决了这些问题，化学成分限定培养基是指培养基中的所有成分都是明确的，它不含有动物蛋白，没有添加植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等，这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物，更好的原材料可追溯性和更好的批次间一致性，其有助于工艺性能的一致性。但是现有的化学成分限定培养基由于配方不够全面，在培养宿主细胞时，依然存在细胞活力不够好，产物表达不够多的问题。
发明内容
本申请的目的在于提供一种化学成分限定培养基，旨在解决现有的HEK293细胞化学成分限定培养基由于配方不够全面，在培养宿主细胞时，存在细胞活力不够好，产物表达不够多的问题。
为实现以上目的，本申请提供一种化学成分限定培养基，由氨基酸、脂类、维生素、糖类、有机化合物和无机化合物组成；其中，氨基酸是细胞合成蛋白质的基本原料；脂类是油、脂肪、类脂的总称；类脂包括磷脂，固醇类，脂蛋白，糖脂等，类脂是构成机体组织较稳定的脂；维生素做为细胞生长因子；糖类提供细胞生长所需的碳源；
所述氨基酸的组分和用量为：
L-a-氨基-n-丁酸5～11mg/L；例如可以为(5、6、7、8、9、10或11)mg/L；
L-半胱氨酸盐酸一水100～220mg/L；例如可以为(100、120、140、160、180、200或220)mg/L；
L-苯丙氨酸200～320mg/L；例如可以为(200、220、240、260、280、300或320)mg/L；
L-谷氨酸钠500～620mg/L；例如可以为(500、520、540、560、580、600或620)mg/L；
L-谷氨酰胺600～720mg/L；例如可以为(600、620、640、660、680、700或720)mg/L；
L-甲硫氨酸150～300mg/L；例如可以为(150、175、200、225、250、275或300)mg/L；
L-精氨酸盐酸100～220mg/L；例如可以为(100、120、140、160、180、200或220)mg/L；
L-赖氨酸盐酸600～720mg/L；例如可以为(600、620、640、660、680、700或720)mg/L；
L-酪氨酸二钠二水合物300～540mg/L；例如可以为(300、340、380、420、460、500或540)mg/L；
L-亮氨酸500～620mg/L；例如可以为(500、520、540、560、580、600或620)mg/L；
L-羟基脯氨酸300～540mg/L；例如可以为(300、340、380、420、460、500或540)mg/L；
L-丝氨酸400～520mg/L；例如可以为(400、420、440、460、480、500或520)mg/L；
L-苏氨酸300～420mg/L；例如可以为(300、320、340、360、380、400或420)mg/L；
L-天冬氨酸钠500～620mg/L；例如可以为(500、520、540、560、580、600或620)mg/L；
L-天冬酰胺1000～1240mg/L；例如可以为(1000、1040、1080、1120、1160、1200或1240)mg/L；
L-缬氨酸300～420mg/L；例如可以为(300、320、340、360、380、400或420)mg/L；
L-异亮氨酸400～520mg/L；例如可以为(400、420、440、460、480、500或520)mg/L；
L-组氨酸盐酸一水500～620mg/L；例如可以为(500、520、540、560、580、600或620)mg/L；
鸟氨酸盐酸300～420mg/L；例如可以为(300、320、340、360、380、400或420)mg/L；
羟基脯氨酸500～620mg/L；例如可以为(500、520、540、560、580、600或620)mg/L；
甘氨酸40～100mg/L；例如可以为(40、50、60、70、80、90或100)mg/L；
胱氨酸-2盐酸100～340mg/L；例如可以为(100、140、180、220、260、300或340)mg/L；
酪氨酸钠盐100～220mg/L；例如可以为(100、120、140、160、180、200或220)mg/L；
所述脂类的组分和用量为：
胆固醇0.5～1.1mg/L；例如可以为(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或1.1)mg/L；
磷脂0.001～0.0022mg/L；例如可以为(0.001、0.0012、0.0014、0.0016、0.0018、0.002或0.0022)mg/L；
亚油酸0.04～0.1mg/L；亚油酸为脂肪酸，例如可以为(0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1)mg/L；
地塞米松0.01～0.07mg/L；地塞米松是一种人工合成的皮质类固醇，例如可以为(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06或0.07)mg/L；
所述维生素的组分和用量为：
D-泛酸钙15～21mg/L；例如可以为(15、16、17、18、19、20或21)mg/L；
核黄素0.1～1.0mg/L；例如可以为(0.1、0.25、0.4、0.55、0.7、0.85或1.0)mg/L；
生物素0.01～0.1mg/L；例如可以为(0.01、0.025、0.04、0.055、0.07、0.085或0.1)mg/L；
生育酚0.0005～0.0011mg/L；例如可以为(0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001或0.0011)mg/L；
维生素A醋酸酯0.001～0.0022mg/L；例如可以为(0.001、0.0012、0.0014、0.0016、0.0018、0.002或0.0022)mg/L；
维生素B12 0.2～1.4mg/L；例如可以为(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2或1.4)mg/L；
烟酰胺0.5～1.1mg/L；例如可以为(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或1.1)mg/L；
盐酸吡哆醇10～16mg/L；例如可以为(10、11、12、13、14、15或16)mg/L；
盐酸硫胺素0.1～1.0mg/L；例如可以为(0.1、0.25、0.4、0.55、0.7、0.85或1.0)mg/L；
叶酸10～16mg/L；例如可以为(10、11、12、13、14、15或16)mg/L；
所述糖类的组分和用量为：
半乳糖1000～1240mg/L；例如可以为(1000、1040、1080、1120、1160、1200或1240)mg/L；
葡萄糖1000～1240mg/L；例如可以为(1000、1040、1080、1120、1160、1200或1240)mg/L；
一水麦芽糖1000～1240mg/L；例如可以为(1000、1040、1080、1120、1160、1200或1240)mg/L；
蔗糖2000～2600mg/L；例如可以为(2000、2100、2200、2300、2400、2500或2600)mg/L；
所述有机化合物的组分和用量为：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸30～120mg/L；例如可以为(30、45、60、75、90、105或120)mg/L；
DL-α-硫辛酸0.2～1.4mg/L；例如可以为(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2或1.4)mg/L；
次黄嘌呤0.1～0.7mg/L；例如可以为(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7)mg/L；
腐胺10～22mg/L；例如可以为(10、12、14、16、18、20或22)mg/L；
富马酸0.5～1.1mg/L；例如可以为(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或1.1)mg/L；
谷胱甘肽还原型2～5mg/L；例如可以为(2、2.5、3、3.5、4、4.5或5)mg/L；
环糊精100～220mg/L；例如可以为(100、120、140、160、180、200或220)mg/L；
肌醇50～110mg/L；例如可以为(50、60、70、80、90、100或110)mg/L；
柠檬酸铁铵400～520mg/L；例如可以为(400、420、440、460、480、500或520)mg/L；
牛磺酸20～50mg/L；例如可以为(20、25、30、35、40、45或50)mg/L；
苹果酸200～320mg/L；例如可以为(200、220、240、260、280、300或320)mg/L；
胸苷0.2～5mg/L；例如可以为(0.2、1、1.8、2.6、3.4、4.2或5)mg/L；
乙醇胺盐酸5～11mg/L；例如可以为(5、6、7、8、9、10或11)mg/L；
所述无机化合物的组分和用量为：
丙酮酸钠50～110mg/L；例如可以为(50、60、70、80、90、100或110)mg/L；
二水氯化亚锡0.0001～0.001mg/L；例如可以为(0.0001、0.00025、0.0004、0.00055、0.0007、0.00085或0.001)mg/L；
九水偏钒酸钠0.0002～0.0014mg/L；例如可以为(0.0002、0.0004、0.0006、0.0008、0.001、0.0012或0.0014)mg/L；
九水偏硅酸钠0.005～0.011mg/L；例如可以为(0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01或0.011)mg/L；
磷酸二氢钠800～920mg/L；例如可以为(800、820、840、860、880、900或920)mg/L；
磷酸氢二钠500～800mg/L；例如可以为(500、550、600、650、700、750或800)mg/L；
硫酸镍0.0001～0.001mg/L；例如可以为(0.0001、0.00025、0.0004、0.00055、0.0007、0.00085或0.001)mg/L；
氯化胆碱50～110mg/L；例如可以为(50、60、70、80、90、100或110)mg/L；
氯化钙80～104mg/L；例如可以为(80、84、88、92、96、100或104)mg/L；
氯化钾500～620mg/L；例如可以为(500、520、540、560、580、600或620)mg/L；
氯化镁10～58mg/L；例如可以为(10、18、26、34、42、50或58)mg/L；
氯化钠2000～2600mg/L；例如可以为(2000、2100、2200、2300、2400、2500或2600)mg/L；
偏钒酸铵0.0005～0.0011mg/L；例如可以为(0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001或0.0011)mg/L；
七水硫酸锌0.1～0.22mg/L；例如可以为(0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2或0.22)mg/L；
七水硫酸亚铁0.02～0.05mg/L；例如可以为(0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045或0.05)mg/L；
四水合氯化锰0.002～0.0032mg/L；例如可以为(0.002、0.0022、0.0024、0.0026、0.0028、0.003或0.0032)mg/L；
四水钼酸铵0.0005～0.0011mg/L；例如可以为(0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001或0.0011)mg/L；
五水硫酸铜0.04～0.1mg/L；例如可以为(0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1)mg/L；
硝酸钾0.003～0.0054mg/L；例如可以为(0.003、0.0034、0.0038、0.0042、0.0046、0.005或0.0054)mg/L；
亚硒酸钠0.002～0.0032mg/L；例如可以为(0.002、0.0022、0.0024、0.0026、0.0028、0.003或0.0032)mg/L；
一水硫酸锰0.00004～0.0001mg/L；例如可以为(0.00004、0.00005、0.00006、0.00007、0.00008、0.00009或0.0001)mg/L。
优选地，所述化学成分限定培养基由第一化学成分限定培养基和第二化学成分限定培养基组成，且所述化学成分限定培养基中所述第一化学成分限定培养基的质量百分比为10％-90％；所述第二化学成分限定培养基的质量百分比为90％-10％；
所述第一化学成分限定培养基的组分和用量为：
其中，所述氨基酸的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000081
Figure BDA0004092018100000091
所述脂类的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000094
所述维生素的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000092
所述糖类的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000093
所述有机化合物的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000101
所述无机化合物的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000102
所述第二化学成分限定培养基的组分和用量为：
其中，所述氨基酸的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000103
Figure BDA0004092018100000111
所述脂类的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000112
所述维生素的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000113
所述糖类的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000114
Figure BDA0004092018100000123
所述有机化合物的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000121
所述无机化合物的组分和用量为：
Figure BDA0004092018100000122
优选地，所述化学成分限定培养基中所述第一化学成分限定培养基的质量百分比为33％-90％；所述第二化学成分限定培养基的质量百分比为67％-10％。
优选地，所述化学成分限定培养基中所述第一化学成分限定培养基的质量百分比为33％-50％；所述第二化学成分限定培养基的质量百分比为67％-50％。
本申请还提供上述的化学成分限定培养基的制备方法，包括：在水中按照配比加入各组分进行溶解，并调节溶液的pH和渗透压，过滤得到所述化学成分限定培养基。
本申请还提供上述的化学成分限定培养基在培养宿主细胞用于制备抗体、重组蛋白、疫苗、慢病毒包装中的应用。
优选地，所述抗体包括：CD20、PD-1、VEGF、TNF-α、Her2、CD47中的任一种；
所述重组蛋白包括：重组人凝血因子VIII、重组人胰岛素、重组干扰素、重组白介素、重组粒细胞集落刺激因子、重组人生长激素中的任一种。
优选地，所述宿主细胞包括如下A～C中的至少一个特征：
A.所述宿主细胞为哺乳动物细胞；
B.所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞；
C.所述HEK293细胞选自Expi293细胞、Freestyle293细胞中的任一种。
本申请还提供一种高效瞬转表达方法，包括：
使用上述的化学成分限定培养基培养宿主细胞，得到细胞悬浮液；
将质粒和转染试剂混匀后加入所述细胞悬浮液中；
将所述细胞悬浮液继续培养，维持葡萄糖浓度在4g/L以上，当细胞活率低于70％时收获细胞和上清培养液，得到表达产物。
优选地，所述质粒和所述转染试剂的质量比为1:1-1:3；
所述质粒和所述转染试剂混匀后孵育5-15min。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的CDM培养基由氨基酸、脂类、维生素、糖类、有机化合物和无机化合物组成，配方在营养成分上全面，并且CDM培养基化学成分确定，无动物源，不含蛋白质或生长因子，支持多种不同类型的HEK293细胞的培养，具有更好的原材料可追溯性和更好的批次间一致性，有助于工艺性能的一致性。本申请提供的CDM培养基能够用于不同细胞的快速增殖和高密度培养，能够有效进行蛋白质表达，将蛋白表达量提高到g/L级别以上的水平，易于放大培养规模，适用于平板、摇瓶、TPP管、Wave及其他反应器，使用方便。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为本发明七种HEK293细胞CDM培养基和市售对照培养基培养细胞的活细胞密度随时间的变化图；
图2为本发明七种HEK293细胞CDM培养基和市售对照培养基培养细胞的细胞活力随时间的变化图；
图3为本发明七种HEK293细胞CDM培养基和市售对照培养基培养细胞6天抗体蛋白表达量累积柱状图；
图4为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞的活细胞密度随时间的变化图；
图5为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞的细胞活力随时间的变化图；
图6为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞第10天的抗体蛋白表达量累积柱状图；
图7为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞，表达西妥昔(Cetuximab)活细胞密度随时间的变化图；
图8为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞，表达曲妥珠(Trastuzumab)的活细胞密度随时间的变化图；
图9为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞，表达西妥昔(Cetuximab)的细胞活力随时间的变化图；
图10为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞，表达曲妥珠(Trastuzumab)的细胞活力随时间的变化图；
图11为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞，表达西妥昔(Cetuximab)第8天的抗体蛋白表达量累积柱状图；
图12为本发明HEK293细胞Max培养基和市售对照培养基培养细胞，表达曲妥珠(Trastuzumab)第8天的抗体蛋白表达量累积柱状图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
本申请提供的化学成分限定培养基由氨基酸、脂类、维生素、糖类、其他化合物(包括有机化合物和无机化合物)组成，首先提供了七种分别适用于不同细胞培养的化学成分限定培养基，如表1所示的培养基CDM#1-CDM#7。
表1.化学成分限定培养基CDM#1-CDM#7的组分和含量表(mg/L)
Figure BDA0004092018100000161
Figure BDA0004092018100000171
Figure BDA0004092018100000181
本申请还提供由上述的CDM#1和CDM#4培养基以任意比例进行混合复合而得的化学成份限定培养基HEK293 Max培养基，其中，CDM#1培养基在HEK293 Max培养基中所占质量百分比为：10％-90％，CDM#4培养基在HEK293 Max培养基中所占质量百分比为：90％-10％。复配得到的HEK293 Max培养基为平台化通用性强的培养基，可以适用于HEK293细胞多种蛋白瞬转表达的应用。
更优选地，CDM#1培养基在HEK293 Max培养基中所占质量百分比为：33％-90％，CDM#4培养基在HEK293 Max培养基中所占质量百分比为：67％-10％。
更优选地，所述化学成分限定培养基中所述第一化学成分限定培养基的质量百分比为33％-50％；所述第二化学成分限定培养基的质量百分比为67％-50％。
可以理解的是，本领域技术人员根据需要，还可以将上述CDM#1-CDM#7培养基以任意比例进行混合，得到新的Max培养基，该Max培养基的每一个组分的用量范围大于CDM#1培养基中该组分的用量，小于CDM#7培养基中该组分的用量。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1化学成分限定培养基的配制和筛选
1.1、CDM#1-CDM#7培养基的配制
(1)按照表1中CDM#1-CDM#7培养基的组分和用量分别称取各组分物质进行混合，分别得到CDM#1-CDM#7培养基干粉。
(2)分别量取900mL超纯水(20～25℃)于指定不同容器内，分别在容器内缓慢加入CDM#1-CDM#7培养基干粉，剧烈搅拌直至干粉全部溶解。
(3)分别加入0.5g/L的poloxamer 188和3.2g/L的碳酸氢钠，搅拌10～20min，直至完全溶解。
(4)分别使用12mol/L的浓盐酸调节培养基的pH值至6.7～6.8，继续搅拌5～10min，确保所有成份完全溶解。
(5)分别使用超纯水定容至1L(定量至1kg)，搅拌5～10min。
(6)分别测量液体培养基的pH值(6.7～7.4)和渗透压(270～340mOsmol/kg)。
(7)分别使用0.22μm膜过滤得到液态的CDM#1-CDM#7化学成分限定培养基。
1.2、CDM#1-CDM#7培养基的筛选
(1)取同一批次冻存的Expi293细胞(购自ThermoFisher，货号A14635)在原始培养基(购自ThermoFisher，货号A1435101)里复苏；将细胞在CO2摇床中(120rpm，8％CO2)、37℃振荡培养，并准备转染以表达目的抗体。
(2)当细胞密度达到3～4×106cells/mL且细胞活率≥95％(2～4天)时，进行传代培养细胞，细胞传代密度为0.3～0.6×106cells/mL。每2到3天进行一次传代操作，以保持细胞处于早期对数生长期。
(3)转染前一天，将细胞按3×106cells/mL细胞密度接种，并使细胞生长过夜。
(4)在转染当天，进行转染的细胞活率应≥95％。分别使用表2中各HEK293细胞CDM培养基进行离心换液，并将Expi293细胞用各CDM培养基稀释至3×106cells/mL。
表2 HEK293细胞CDM培养基筛选各参数一览表
培养基编号 原型培养基代号 转染密度(1×E6) DNA(ug) PEI(ug)
CDM#1 PT01 3 30 90
CDM#2 PT02 3 30 90
CDM#3 PT03 3 30 90
CDM#4 PT04 3 30 90
CDM#5 PT05 3 30 90
CDM#6 PT06 3 30 90
CDM#7 PT07 3 30 90
CON#1 市售某国产培养基01 3 30 90
CON#2 Gibco 3 30 90
CON#3 市售某国产培养基02 3 30 90
(5)按照表2中阳性抗体DNA转染量，用一定体积的Opti-MEM培养基(购自ThermoFisher，货号11058021)稀释质粒，小心混匀；用相等体积的Opti-MEM培养基稀释转染试剂PEI(购自Polysciences，货号#24765)，小心混匀，室温静止5min。
(6)将PEI稀释液加入到DNA稀释液(质粒：PEI＝1：3，W/W)中，室温10min后转染，每瓶加1mL。
(7)将摇瓶放回37℃摇床进行振荡培养。维持葡萄糖浓度在4g/L以上。当细胞活率低于70％时收获细胞和表达产物，检测细胞培养液中蛋白浓度。
(8)实验结果
图1为不同CDM培养基培养Expi293活细胞密度变化图、图2为不同CDM培养基培养Expi293细胞活力变化图、图3为不同CDM培养基培养Expi293细胞抗体蛋白表达量图。
由图1至图3可知，CDM#1-CDM#7培养基进行培养Expi293细胞的活细胞密度、细胞活力以及抗体蛋白表达量均要优于对照CON#1国产培养基01，CDM#4、CDM#5、CDM#6、CDM#7培养基进行培养Expi293细胞的活细胞密度、细胞活力以及抗体蛋白表达量均高于在售的对照CON#1国产培养基01、CON#3国产培养基02，接近CON#2Gibco原始培养基。考虑到CDM#4、CDM#5、CDM#6、CDM#7培养基成分接近，CDM#4和CDM#5产量最高，且CDM#4来源于CDM#5，CDM#4的培养基用量最少，在达到相同的效果下最节约成本，所以选定CDM#4进一步进行Max培养基优化。
实施例2HEK293 Max培养基的配制和优化
2.1、HEK293 Max培养基的配制
(1)量取900mL超纯水(20～25℃)于指定容器内，根据CDM#1和CDM#4的不同配比(如表3所示)，缓慢加入对应量的CDM#1培养基干粉和CDM#4培养基干粉，剧烈搅拌10～30min，直至干粉全部溶解。
表3 HEK293 Max培养基的配制和筛选参数
Figure BDA0004092018100000211
Figure BDA0004092018100000221
(2)使用5mol/L氢氧化钠溶液调节液体培养基的pH值至6.0～7.0，搅拌5～10min。
(3)加入0.5g/L的poloxamer 188和3.2g/L的碳酸氢钠，搅拌10～20min，直至完全溶解。
(4)使用12mol/L的浓盐酸调节培养基的pH值至6.7～6.8，继续搅拌5～10min，确保所有成份完全溶解。
(5)使用超纯水定容至1L(定量至1kg)，搅拌5～10min。
(6)测量液体培养基的pH值(6.7～7.4)和渗透压(270～340mOsmol/kg)。
(7)0.22μm膜过滤备用，得到不同CDM#1和CDM#4配比的HEK293Max培养基Max#1-Max#5。
2.2、HEK293 Max培养基的优化
(1)取同一批次冻存的Expi293细胞在原始培养基里复苏，在CO2摇床中(120rpm，8％CO2)、37℃振荡培养，并准备转染以表达目的抗体。
(2)当细胞密度达到3～4×106cells/mL，且细胞活率≥95％(2～4天)时，进行传代培养细胞，传代密度为0.3～0.6×106cells/mL。每2到3天进行一次传代操作，以保持细胞处于早期对数生长期。
(3)转染前一天，将细胞按3×106cells/mL细胞密度接种，并使细胞生长过夜。
(4)在第二天(转染当天)，进行转染的细胞活率应≥95％。使用表3中以CDM#1和CDM#4两种培养基以不同比例进行混合获得的Max培养基离心换液，并将细胞用各Max培养基稀释至3×106cells/mL。
(5)按照表3中阳性DNA转染量，用一定体积的Opti-MEM培养基稀释质粒，小心混匀；用相等体积的Opti-MEM培养基稀释转染试剂PEI，小心混匀，室温静止5min。
(6)将PEI稀释液加入到DNA稀释液(质粒：PEI＝1：3，W/W)中，室温15min后进行转染，每瓶加3mL。
(7)将摇瓶放回37℃摇床进行振荡培养。维持葡萄糖浓度在4g/L以上，当细胞活率低于70％时收获细胞和表达产物，检测细胞培养液中抗体含量。
(8)实验结果
图4为不同Max培养基培养Expi293活细胞密度变化图，图5为不同Max培养基培养Expi293细胞细胞活力变化图，图6为不同Max培养基培养Expi293细胞抗体蛋白表达量图。
由图4至图6可知，CDM#4、Max#1、Max#2、Max#3、Max#4、Max#5培养基进行培养Expi293的活细胞密度、细胞活力以及抗体蛋白表达量均高于在售的对照CON#1国产培养基01和CON#2Gibco原始培养基。其中，Max#2、Max#3、Max#5培养Expi293的抗体蛋白表达量最高。
实施例3HEK293 Max培养基在抗体大分子表达中的应用
(1)取同一批次冻存的Expi293细胞在原始培养基里复苏。将细胞在CO2摇床中(120rpm，8％CO2)、37℃振荡培养，并准备转染以表达目的抗体蛋白。
(2)当细胞密度达到3～4×106cells/mL且细胞活率≥95％(2～4天)时，进行传代培养细胞，细胞传代密度为0.3～0.6×106cells/mL。每2到3天进行一次传代操作，以保持细胞处于早期对数生长期。
(3)转染前一天，将细胞按3×106cells/mL细胞密度接种，并使细胞生长过夜。
(4)在第二天(转染当天)，进行转染的细胞活率应≥95％。使用表4中不同Max系列培养基进行离心换液，并将细胞用各Max培养基稀释至3×106cells/mL。
表4 HEK293 Max培养基在抗体大分子表达的参数
Figure BDA0004092018100000241
(5)分别将西妥昔(Cetuximab)和曲妥珠(Trastuzumab)抗体重轻链DNA表达质粒，用一定体积的Opti-MEM培养基稀释，小心混匀；用相等体积的Opti-MEM培养基稀释PEI，小心混匀，室温静止5min。
(6)将PEI稀释液加入到DNA稀释液中(质粒：PEI＝1：3，W/W)室温静置15min后进行转染，每瓶加3mL。
(7)将摇瓶放回37℃摇床进行振荡培养。维持葡萄糖浓度在4g/L以上，每天取样计算细胞密度和细胞活力，当细胞活率低于70％时收获细胞和表达产物，最终收集上清时检测细胞培养液中蛋白浓度。
(8)实验结果
图7为不同Max培养基瞬转Expi293细胞表达西妥昔(Cetuximab)活细胞密度变化图，图8为不同Max培养基瞬转Expi293细胞表达曲妥珠(Trastuzumab)活细胞密度变化图，可知，本发明的Max#2、Max#3、Max#5在表达上述两种抗体大分子时，在第8天活细胞仍保持高密度，达到1×E7cells/mL，而市售对照国产培养基01在第5天活细胞密度仅达到5×E6cells/mL。
图9为不同Max培养基瞬转Expi293细胞表达西妥昔(Cetuximab)细胞活力变化图，图10为不同Max培养基瞬转Expi293细胞表达曲妥珠(Trastuzumab)细胞活力变化图，可知，本发明的Max#2、Max#3、Max#5在表达上述两种抗体大分子时，在第8天细胞活力仍达到80％左右，而市售对照国产培养基01在第5天细胞活力仅为70％或更低。
图11为不同Max培养基瞬转Expi293细胞表达西妥昔(Cetuximab)抗体表达量柱状图，图12为不同Max培养基瞬转Expi293细胞表达曲妥珠(Trastuzumab)抗体表达量柱状图，可知，本发明的Max#2、Max#3、Max#5在表达西妥昔(Cetuximab)抗体大分子时，在第8天西妥昔(Cetuximab)表达量依次为：0.107g/L，0.079g/L、0.102g/L，而市售对照国产培养基01表达量为0.026g/L，产量依次为市售对照国产培养基01的4.11倍、3.03倍、3.92倍；在表达曲妥珠(Trastuzumab)抗体大分子时，在第8天曲妥珠(Trastuzumab)表达量依次为：0.246g/L、0.154g/L、0.208g/L，而市售对照国产培养基01表达量为0.061g/L，产量依次为市售对照国产培养基01的4.03倍、2.52倍、3.41倍；由此可见，本发明提供的Max#2、Max#3、Max#5在表达抗体大分子中与市售培养基相比，具有明显的优势和非常高的市场价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种化学成分限定培养基，其特征在于，由氨基酸、脂类、维生素、糖类、有机化合物和无机化合物组成；
所述氨基酸的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000011
Figure FDA0004092018080000021
所述脂类的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000022
所述维生素的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000023
所述糖类的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000024
所述有机化合物的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000025
Figure FDA0004092018080000031
所述无机化合物的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000032
Figure FDA0004092018080000041
2.根据权利要求1所述的化学成分限定培养基，其特征在于，所述化学成分限定培养基由第一化学成分限定培养基和第二化学成分限定培养基组成，且所述化学成分限定培养基中所述第一化学成分限定培养基的质量百分比为10％-90％；所述第二化学成分限定培养基的质量百分比为90％-10％；
所述第一化学成分限定培养基的组分和用量为：
其中，所述氨基酸的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000042
Figure FDA0004092018080000051
所述脂类的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000052
所述维生素的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000053
Figure FDA0004092018080000061
所述糖类的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000062
所述有机化合物的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000063
所述无机化合物的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000064
Figure FDA0004092018080000071
所述第二化学成分限定培养基的组分和用量为：其中，所述氨基酸的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000072
Figure FDA0004092018080000081
所述脂类的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000082
所述维生素的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000083
Figure FDA0004092018080000091
所述糖类的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000092
所述有机化合物的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000093
所述无机化合物的组分和用量为：
Figure FDA0004092018080000094
Figure FDA0004092018080000101
3.根据权利要求2所述的化学成分限定培养基，其特征在于，所述化学成分限定培养基中所述第一化学成分限定培养基的质量百分比为33％-90％；所述第二化学成分限定培养基的质量百分比为67％-10％。
4.根据权利要求3所述的化学成分限定培养基，其特征在于，所述化学成分限定培养基中所述第一化学成分限定培养基的质量百分比为33％-50％；所述第二化学成分限定培养基的质量百分比为67％-50％。
5.如权利要求1至4任一项所述的化学成分限定培养基的制备方法，其特征在于，包括：在水中按照配比加入各组分进行溶解，并调节溶液的pH和渗透压，过滤得到所述化学成分限定培养基。
6.如权利要求1至4任一项所述的化学成分限定培养基在培养宿主细胞用于制备抗体、重组蛋白、疫苗、慢病毒包装中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗体包括：CD20、PD-1、VEGF、TNF-α、Her2、CD47中的任一种；
所述重组蛋白包括：重组人凝血因子VIII、重组人胰岛素、重组干扰素、重组白介素、重组粒细胞集落刺激因子、重组人生长激素中的任一种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞包括如下A～C中的至少一个特征：
A.所述宿主细胞为哺乳动物细胞；
B.所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞；
C.所述HEK293细胞选自Expi293细胞、Freestyle293细胞中的任一种。
9.一种高效瞬转表达方法，其特征在于，包括：
使用权利要求1至4任一项所述的化学成分限定培养基培养宿主细胞，得到细胞悬浮液；
将质粒和转染试剂混匀后加入所述细胞悬浮液中；
将所述细胞悬浮液继续培养，维持葡萄糖浓度在4g/L以上，当细胞活率低于70％时收获细胞和上清培养液，得到表达产物。
10.根据权利要求9所述的高效瞬转表达方法，其特征在于，所述质粒和所述转染试剂的质量比为1:1-1:3；
所述质粒和所述转染试剂混匀后孵育5-15min。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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