CN111996161A - 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途 - Google Patents

一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种CHO细胞无血清无蛋白培养基及其用途，包括氨基酸组分、维生素组分、无机盐组分、微量元素组分及碳水化合物和其他分子化合物组分。本发明的无血清培养基，化学成分明确，成本低廉，不需要血清的同时，也避免了因使用血清带来的生物安全风险，为生物制品，特别是蛋白类药物的规模化生产提供方便。且CHO细胞在本发明培养基中生长良好，无血清的使用，有利于提高生物制品生产工艺和成品质量的稳定性，特别是有利于细胞灌流培养的应用。细胞灌流培养技术作为生物医药细胞培养未来的发展趋势，本培养基很好的填补了市场上无专用细胞灌流培养基的空白，为利用CHO细胞生物医药流水线生产提供了基础。

Description

一种CHO细胞无血清无蛋白培养基及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体为一种细胞无血清无蛋白培养基。
背景技术
中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CH0)细胞广泛应用于重组蛋白药物及抗体药物的生产，其不仅能够提供稳定而准确的糖基化修饰，使表达产物最接近于天然蛋白质分子，而且具有安全性高的特点，是目前少数FDA及各国药监部门认可的合法合规的产业化工程细胞株。一般CHO细胞的培养是在商品化的培养基，如DMEM/F12基础培养基中添加5～10％的胎牛血清来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还提供了体外培养细胞增殖所必需的生长因子。但血清的使用存在批次间差异大、生物危害性风险高、易被支原体和病毒等污染、成本高、不利于产物分离纯化等很多弊端，以及影响细胞的生长及最终产物的质量，不适于大规模工业化生产。
连续灌注培养是近年用于动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物和嵌合抗体及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种方式。应用连续灌流工艺的公司有Genzyme,Genetic Institute,Bayer公司等。该培养方式的主要优点有：①细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，从而较大的提高了产品的产量；②连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；③反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；④产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性；⑤获得相同产能的前提下，可大幅度精简生物制品生产工艺流程，降低前期生产设备等硬件投入；
目前，灌流细胞培养方式越来越流行，因为生物制药的生产工艺开发对产品质量和产量要求更高，灌流性细胞工艺能满足质量和产量要求，特别是对不稳定性生物蛋白药，灌流细胞培养工艺为最佳选择，绝大多数生物制品企业已经启动或者准备启动该生产方式的生产线，但是与之对应的“专用培养基”的研发或生产进程出现脱节。虽然国内和国外已经有数量众多的，应用于传统批次培养或者批次补料培养基的，化学成分明确的无血清无蛋白培养基，但是专门应用于CHO细胞灌流培养基的产品寥寥无几。已经上市的少数几款灌流培养基也是被Life、Thermo、Lonza等国外知名的培养基大公司垄断，成分秘而不宣，而国内用灌流的培养工艺来开发培养基，尚无报道，因为灌流细胞培养方法技术难度高，培养基用量大，设备复杂，而影响灌流培养工艺的发展。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本专利公开了一种适用于CHO细胞高密度悬浮灌流培养的CD无血清无蛋白培养基，化学成分明确，能够显著提高CHO细胞的培养或者生产持续时间，为生物制品的规模化生产提供方便。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，包括氨基酸组分、维生素组分、无机盐组分、微量元素组分及碳水化合物和其他分子化合物组分，具体包括
氨基酸的组成为：
L-精氨酸 150-800mg/L
L-天冬氨酸 100-550mg/L
L-天冬酰胺 145-500mg/L
L-半胱氨酸 105-350mg/L
L-甘氨酸 20-110mg/L
L-谷氨酸 50-180mg/L
L-组氨酸 145-435mg/L
L-异亮氨酸 225-550mg/L
L-亮氨酸 160-480mg/L
L-赖氨酸 270-700mg/L
L-蛋氨酸 65-145mg/L
L-苯丙氨酸 130-460m/L
L-脯氨酸 135-470mg/L
L-丝氨酸 200-500mg/L
L-苏氨酸 50-300mg/L
L-色氨酸 160-420mg/L
L-酪氨酸 180-540mg/L
L-缬氨酸 160-520mg/L
维生素的组成为：
生物素 0.09-3.62mg/L
E-泛酸钙 1-10.5mg/L
叶酸 4.45-24.5mg/L
烟酰胺 1.25-13mg/L
维生素 B6 1-10mg/L
盐酸硫胺素 1.25-13mg/L
维生素 B12 0.1-15mg/L
核黄素 0.1-3.5mg/L
氯化胆碱 8-180mg/L
肌醇 10-75mg/L
无机盐的组成：
氯化镁 10-200mg/L
硫酸镁 30-200mg/L
氯化钙 56-232mg/L
氯化钾 212-936mg/L
碳酸氢钠 1200-3600mg/L
氯化钠 200-2000mg/L
磷酸钠 70-600mg/L
微量元素的组成为：
七水硫酸锌 0.5-5mg/L
五水硫酸铜 0.0001-0.01mg/L
九水硝酸铁 0.05-0.45mg/L
七水硫酸亚铁 0.4-15.5mg/L
亚硒酸纳 0.01-0.8mg/L
氯化镍 0.00005-0.0005mg/L
氯化亚锡 0.00005-0.0005mg/L
氯化钴 0.0005-0.008mg/L
氯化铝 0.0001-0.001mg/L
醋酸钡 0.0005-0.003mg/L
硫酸铬 0.001-0.006mg/L
氟化钠 0.0005-0.006mg/L
偏硅酸钠 0.005-0.09mg/L
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：
葡萄糖 2000-9000mg/L
乙醇胺 5-30mg/L
腐胺 0.1-15mg/L
硫辛酸 0.2-3mg/L
亚油酸 0.01-0.9mg/L
丙酮酸钠 105-600mg/L
硫酸葡聚糖 10-100mg/L
Pluronic F-68 100-3000mg/L。
优选的，所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，包括：
氨基酸的组成为：L-精氨酸500mg/L，L-天冬氨酸300mg/L，L-天冬酰胺280mg/L，L-半胱氨酸180mg/L，L-甘氨酸55mg/L，L-谷氨酸150mg/L，L-组氨酸305mg/L，L-异亮氨酸325mg/L，L-亮氨酸160mg/L，L-赖氨酸550mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸230m/L，L-脯氨酸370mg/L，L-丝氨酸400mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸210mg/L，L-酪氨酸180mg/L，L-缬氨酸280mg/L。
维生素的组成为：生物素1.8mg/L，泛酸钙5.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B1212mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁130mg/L，硫酸镁35mg/L，氯化钙200mg/L，氯化钾512mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1333mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌1.5mg/L，五水硫酸铜0.005mg/L，九水硝酸铁0.15mg/L，七水硫酸亚铁5.0mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.001mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.00056mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖6000mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.4mg/L，丙酮酸钠250mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，PluronicF-68 1200mg/L。
优选的，所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，包括：
氨基酸的组成为：L-精氨酸150mg/L，L-天冬氨酸100mg/L，L-天冬酰胺145mg/L，L-半胱氨酸120mg/L，L-甘氨酸35mg/L，L-谷氨酸55mg/L，L-组氨酸145mg/L，L-异亮氨酸225mg/L，L-亮氨酸320mg/L，L-赖氨酸350mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸230m/L，L-脯氨酸370mg/L，L-丝氨酸400mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸210mg/L，L-酪氨酸180mg/L，L-缬氨酸280mg/L。
维生素的组成为：生物素0.8mg/L，泛酸钙3.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B126mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁130mg/L，硫酸镁35mg/L，氯化钙106mg/L，氯化钾512mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1333mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌1.5mg/L，五水硫酸铜0.005mg/L，九水硝酸铁0.15mg/L，七水硫酸亚铁0.4mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.0002mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.002mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖5400mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.2mg/L，丙酮酸钠133mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，PluronicF-68 1000mg/L。
优选的，所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，包括：
氨基酸的组成为：L-精氨酸400mg/L，L-天冬氨酸100mg/L，L-天冬酰胺145mg/L，L-半胱氨酸120mg/L，L-甘氨酸35mg/L，L-谷氨酸55mg/L，L-组氨酸145mg/L，L-异亮氨酸225mg/L，L-亮氨酸320mg/L，L-赖氨酸350mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸130m/L，L-脯氨酸135mg/L，L-丝氨酸200mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸160mg/L，L-酪氨酸240mg/L，L-缬氨酸180mg/L。
维生素的组成为：生物素0.8mg/L，泛酸钙3.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B126mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁120mg/L，硫酸镁100mg/L，氯化钙200mg/L，氯化钾671mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1500mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌2.0mg/L，五水硫酸铜0.0055mg/L，九水硝酸铁0.25mg/L，七水硫酸亚铁0.4mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.0002mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.002mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖7000mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.25mg/L，丙酮酸钠133mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，PluronicF-68 1000mg/L。
优选的，上面所述CHO细胞无血清无蛋白培养基为用于细胞灌流培养CHO细胞的无血清无蛋白培养基。
优选的，上述任一所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基在CHO细胞培养中的用途。
优选的，上述用途为用于CHO细胞的灌流培养。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供的无血清无蛋白CHO培养基，具备以下有益效果：本发明提供的培养基，氨基酸、维生素、脂肪酸的含量介于传统的基础培养基和补料培养基的中间，基于以上原理，在结合每种物质的浓度和比例适宜，能够显著提高CHO细胞的培养或者生产持续时间，有利于生物蛋白药的大规模生产和生物仿制药的质量标准一致性。特别适宜适用于CHO灌流细胞培养，填补了市场上无专用CHO灌流细胞无血清无蛋白培养基的空白，为代表CHO灌流细胞培养作为未来发展趋势的培养方法提供了专用的培养基。
同时本发明提供的培养基无血清无蛋白，化学成分明确、成本低廉，适用于大规模的医药产业工业化生产的应用。
附图说明
图1是CHO细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基Dynamis进行批次补料培养基的活细胞密度对比图；
图2是CHO细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基Dynamis进行批次补料培养基的细胞活率对比图。
具体实施方式
实施例一
1、按照如下物质浓度配置各实验用培养基：将IL用量的各组分加入800ml超纯水中，室温搅拌30min后，用1M新鲜配置的氢氧化钠溶液或者盐酸调节pH到6.9～7.3。用0.22μm无菌膜过滤，4℃长期保存备用。
氨基酸的组成为：
L-精氨酸 150-800mg/L
L-天冬氨酸 100-550mg/L
L-天冬酰胺 145-500mg/L
L-半胱氨酸 105-350mg/L
L-甘氨酸 20-110mg/L
L-谷氨酸 50-180mg/L
L-组氨酸 145-435mg/L
L-异亮氨酸 225-550mg/L
L-亮氨酸 160-480mg/L
L-赖氨酸 270-700mg/L
L-蛋氨酸 65-145mg/L
L-苯丙氨酸 130-460m/L
L-脯氨酸 135-470mg/L
L-丝氨酸 200-500mg/L
L-苏氨酸 50-300mg/L
L-色氨酸 160-420mg/L
L-酪氨酸 180-540mg/L
L-缬氨酸 160-520mg/L
维生素的组成为：
生物素 0.09-3.62mg/L
F-泛酸钙 1-10.5mg/L
叶酸 4.45-24.5mg/L
烟酰胺 1.25-13mg/L
维生素 B6 1-10mg/L
盐酸硫胺素 1.25-13mg/L
维生素 B12 0.1-15mg/L
核黄素 0.1-3.5mg/L
氯化胆碱 8-180mg/L
肌醇 10-75mg/L
无机盐的组成：
氯化镁 10-200mg/L
硫酸镁 30-200mg/L
氯化钙 56-232mg/L
氯化钾 212-936mg/L
碳酸氢钠 1200-3600mg/L
氯化钠 200-2000mg/L
磷酸钠 70-600mg/L
微量元素的组成为：
七水硫酸锌 0.5-5mg/L
五水硫酸铜 0.0001-0.01mg/L
九水硝酸铁 0.05-0.45mg/L
七水硫酸亚铁 0.4-15.5mg/L
亚硒酸纳 0.01-0.8mg/L
氯化镍 0.00005-0.0005mg/L
氯化亚锡 0.00005-0.0005mg/L
氯化钴 0.0005-0.008mg/L
氯化铝 0.0001-0.001mg/L
醋酸钡 0.0005-0.003mg/L
硫酸铬 0.001-0.006mg/L
氟化钠 0.0005-0.006mg/L
偏硅酸钠 0.005-0.09mg/L
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：
葡萄糖 2000-9000mg/L
乙醇胺 5-30mg/L
腐胺 0.1-15mg/L
硫辛酸 0.2-3mg/L
亚油酸 0.01-0.9mg/L
丙酮酸钠 105-600mg/L
硫酸葡聚糖 10-100mg/L
Pluronic F-68 100-3000mg/L
2、实验培养基配方
2.1培养基1配方
用于实验用的培养基1的配方如下：
氨基酸的组成为：L-精氨酸500mg/L，L-天冬氨酸300mg/L，L-天冬酰胺280mg/L，L-半胱氨酸180mg/L，L-甘氨酸55mg/L，L-谷氨酸150mg/L，L-组氨酸305mg/L，L-异亮氨酸325mg/L，L-亮氨酸160mg/L，L-赖氨酸550mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸230m/L，L-脯氨酸370mg/L，L-丝氨酸400mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸210mg/L，L-酪氨酸180mg/L，L-缬氨酸280mg/L。
维生素的组成为：生物素1.8mg/L，泛酸钙5.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B1212mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁130mg/L，硫酸镁35mg/L，氯化钙200mg/L，氯化钾512mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1333mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌1.5mg/L，五水硫酸铜0.005mg/L，九水硝酸铁0.15mg/L，七水硫酸亚铁5.0mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.001mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.00056mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖6000mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.4mg/L，丙酮酸钠250mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，PluronicF-68 1200mg/L。
2.2培养基2配方
用于实验用的培养基2的配方如下：
氨基酸的组成为：L-精氨酸150mg/L，L-天冬氨酸100mg/L，L-天冬酰胺145mg/L，L-半胱氨酸120mg/L，L-甘氨酸35mg/L，L-谷氨酸55mg/L，L-组氨酸145mg/L，L-异亮氨酸225mg/L，L-亮氨酸320mg/L，L-赖氨酸350mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸230m/L，L-脯氨酸370mg/L，L-丝氨酸400mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸210mg/L，L-酪氨酸180mg/L，L-缬氨酸280mg/L。
维生素的组成为：生物素0.8mg/L，泛酸钙3.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B126mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁130mg/L，硫酸镁35mg/L，氯化钙106mg/L，氯化钾512mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1333mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌1.5mg/L，五水硫酸铜0.005mg/L，九水硝酸铁0.15mg/L，七水硫酸亚铁0.4mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.0002mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.002mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖5400mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.2mg/L，丙酮酸钠133mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，PluronicF-68 1000mg/L。
2.3培养基3配方
用于实验用的培养基3的配方如下：
氨基酸的组成为：L-精氨酸400mg/L，L-天冬氨酸100mg/L，L-天冬酰胺145mg/L，L-半胱氨酸120mg/L，L-甘氨酸35mg/L，L-谷氨酸55mg/L，L-组氨酸145mg/L，L-异亮氨酸225mg/L，L-亮氨酸320mg/L，L-赖氨酸350mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸130m/L，L-脯氨酸135mg/L，L-丝氨酸200mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸160mg/L，L-酪氨酸240mg/L，L-缬氨酸180mg/L。
维生素的组成为：生物素0.8mg/L，泛酸钙3.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B126mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁120mg/L，硫酸镁100mg/L，氯化钙200mg/L，氯化钾671mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1500mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌2.0mg/L，五水硫酸铜0.0055mg/L，九水硝酸铁0.25mg/L，七水硫酸亚铁0.4mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.0002mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.002mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖7000mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.25mg/L，丙酮酸钠133mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，PluronicF-68 1000mg/L。
3、细胞培养和检测
3.1根据上述配方和方法配置培养基1，将可表达Anti-Her2的CHO-DG44细胞株以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm；当细胞密度约3×106细胞/ml时，以0.8×106细胞/ml的密度接种传代，直至细胞传代10次以上。
3.2将上述驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm，然后每天取培养体积30％，即9mL的细胞培养液，300g离心5min后，丢弃上清，用9mL新的培养基1重悬细胞，然后重新添加到原培养瓶中继续培养。
3.3根据上述配方和方法配置培养基2，将上述驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm，然后每天取培养体积30％，即9mL的细胞培养液，300g离心5min后，丢弃上清，用9mL新的培养基1重悬细胞，然后重新添加到原培养瓶中继续培养。
3.4根据上述配方和方法配置培养基3，将上述驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm，然后每天取培养体积30％，即9mL的细胞培养液，300g离心5min后，丢弃上清，用9mL新的培养基1重悬细胞，然后重新添加到原培养瓶中继续培养。
3.5以市售的商品化培养基Dynamis(Gibco)作为对照，按照“3.1”节方法驯化细胞后，以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm，培养的第3、5、7、9和11天，分别添加初始培养体积5％的补料培养基EfficientFeedTMC+AGTTMSupplement(Gibco)。
4、结果和分析
4.1图1是CHO细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基Dynamis进行批次补料培养基的活细胞密度对比图，结果表明，培养基1、2和3相较于传统的应用于批次补料培养基的培养基，能够维持更长时间的CHO细胞的高密度生长(28天)，其中培养基3的效果最优。
4.2图2是CHO细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基Dynamis进行批次补料培养基的细胞活率对比图，结果表明，培养基1、2和3相较于传统的应用于批次补料培养基的培养基，能够维持更长时间的CHO细胞的高活率生长(第28天活率>80％)，其中，培养基3的效果最优。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，包括氨基酸组分、维生素组分、无机盐组分、微量元素组分及碳水化合物和其他分子化合物组分，其特征在于，
氨基酸的组成为：
L-精氨酸150-800mg/L
L-天冬氨酸100-550mg/L
L-天冬酰胺145-500mg/L
L-半胱氨酸105-350mg/L
L-甘氨酸20-110mg/L
L-谷氨酸50-180mg/L
L-组氨酸145-435mg/L
L-异亮氨酸225-550mg/L
L-亮氨酸160-480mg/L
L-赖氨酸270-700mg/L
L-蛋氨酸65-145mg/L
L-苯丙氨酸130-460m/L
L-脯氨酸135-470mg/L
L-丝氨酸200-500mg/L
L-苏氨酸50-300mg/L
L-色氨酸160-420mg/L
L-酪氨酸180-540mg/L
L-缬氨酸160-520mg/L
维生素的组成为：
生物素0.09-3.62mg/L
D-泛酸钙1-10.5mg/L
叶酸4.45-24.5mg/L
烟酰胺1.25-13mg/L
维生素B6 1-10mg/L
盐酸硫胺素1.25-13mg/L
维生素B12 0.1-15mg/L
核黄素0.1-3.5mg/L
氯化胆碱8-180mg/L
肌醇10-75mg/L
无机盐的组成：
氯化镁10-200mg/L
硫酸镁30-200mg/L
氯化钙56-232mg/L
氯化钾212-936mg/L
碳酸氢钠1200-3600mg/L
氯化钠200-2000mg/L
磷酸钠70-600mg/L
微量元素的组成为：
七水硫酸锌0.5-5mg/L
五水硫酸铜0.0001-0.01mg/L
九水硝酸铁0.05-0.45mg/L
七水硫酸亚铁0.4-15.5mg/L
亚硒酸纳0.01-0.8mg/L
氯化镍0.00005-0.0005mg/L
氯化亚锡0.00005-0.0005mg/L
氯化钴0.0005-0.008mg/L
氯化铝0.0001-0.001mg/L
醋酸钡0.0005-0.003mg/L
硫酸铬0.001-0.006mg/L
氟化钠0.0005-0.006mg/L
偏硅酸钠0.005-0.09mg/L
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：
葡萄糖2000-9000mg/L
乙醇胺5-30mg/L
腐胺0.1-15mg/L
硫辛酸0.2-3mg/L
亚油酸0.01-0.9mg/L
丙酮酸钠105-600mg/L
硫酸葡聚糖10-100mg/L
Pluronic F-68 100-3000mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于，包括：
氨基酸的组成为：L-精氨酸500mg/L，L-天冬氨酸300mg/L，L-天冬酰胺280mg/L，L-半胱氨酸180mg/L，L-甘氨酸55mg/L，L-谷氨酸150mg/L，L-组氨酸305mg/L，L-异亮氨酸325mg/L，L-亮氨酸160mg/L，L-赖氨酸550mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸230m/L，L-脯氨酸370mg/L，L-丝氨酸400mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸210mg/L，L-酪氨酸180mg/L，L-缬氨酸280mg/L。
维生素的组成为：生物素1.8mg/L，泛酸钙5.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B12 12mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁130mg/L，硫酸镁35mg/L，氯化钙200mg/L，氯化钾512mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1333mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌1.5mg/L，五水硫酸铜0.005mg/L，九水硝酸铁0.15mg/L，七水硫酸亚铁5.0mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.001mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.00056mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖6000mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.4mg/L，丙酮酸钠250mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，Pluronic F-681200mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于，包括：
氨基酸的组成为：L-精氨酸150mg/L，L-天冬氨酸100mg/L，L-天冬酰胺145mg/L，L-半胱氨酸120mg/L，L-甘氨酸35mg/L，L-谷氨酸55mg/L，L-组氨酸145mg/L，L-异亮氨酸225mg/L，L-亮氨酸320mg/L，L-赖氨酸350mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸230m/L，L-脯氨酸370mg/L，L-丝氨酸400mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸210mg/L，L-酪氨酸180mg/L，L-缬氨酸280mg/L。
维生素的组成为：生物素0.8mg/L，泛酸钙3.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B126mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁130mg/L，硫酸镁35mg/L，氯化钙106mg/L，氯化钾512mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1333mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌1.5mg/L，五水硫酸铜0.005mg/L，九水硝酸铁0.15mg/L，七水硫酸亚铁0.4mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.0002mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.002mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖5400mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.2mg/L，丙酮酸钠133mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，Pluronic F-681000mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于，包括：
氨基酸的组成为：L-精氨酸400mg/L，L-天冬氨酸100mg/L，L-天冬酰胺145mg/L，L-半胱氨酸120mg/L，L-甘氨酸35mg/L，L-谷氨酸55mg/L，L-组氨酸145mg/L，L-异亮氨酸225mg/L，L-亮氨酸320mg/L，L-赖氨酸350mg/L，L-蛋氨酸65mg/L，L-苯丙氨酸130m/L，L-脯氨酸135mg/L，L-丝氨酸200mg/L，L-苏氨酸98mg/L，L-色氨酸160mg/L，L-酪氨酸240mg/L，L-缬氨酸180mg/L。
维生素的组成为：生物素0.8mg/L，泛酸钙3.5mg/L，叶酸14.45mg/L，烟酰胺1.25mg/L，维生素B6 1.9mg/L，盐酸硫胺素3.25mg/L，维生素B12 6mg/L，核黄素0.5mg/L，氯化胆碱80mg/L，肌醇15mg/L。
无机盐的组成：氯化镁120mg/L，硫酸镁100mg/L，氯化钙200mg/L，氯化钾671mg/L，碳酸氢钠2400mg/L，氯化钠1500mg/L，磷酸钠210mg/L。
微量元素的组成为：七水硫酸锌2.0mg/L，五水硫酸铜0.0055mg/L，九水硝酸铁0.25mg/L，七水硫酸亚铁0.4mg/L，亚硒酸纳0.21mg/L，氯化镍0.0001mg/L，氯化亚锡0.0001mg/L，氯化钴0.0005mg/L，氯化铝0.0002mg/L，醋酸钡0.0015mg/L，硫酸铬0.001mg/L，氟化钠0.002mg/L，偏硅酸钠0.01mg/L。
碳水化合物和其他分子化合物的组成为：葡萄糖7000mg/L，乙醇胺13mg/L，腐胺1mg/L，硫辛酸0.6mg/L，亚油酸0.25mg/L，丙酮酸钠133mg/L，硫酸葡聚糖50mg/L，Pluronic F-681000mg/L。
5.根据权利要求1至4中任一所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述CHO细胞无血清无蛋白培养基为用于细胞灌流培养CHO细胞的无血清无蛋白培养基。
6.权利要求1至4中任一所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基在CHO细胞培养中的用途。
7.权利要求6所述的一种CHO细胞无血清无蛋白培养基在CHO细胞培养中的用途，其特征在于，所述用于为用于CHO细胞的灌流培养。
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