CN111944741A - Mdck细胞系的悬浮培养驯化方法 - Google Patents

Mdck细胞系的悬浮培养驯化方法 Download PDF

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Abstract

一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，先用含血清培养基贴壁培养MDCK细胞，再经消化后，将所得细胞悬液置入摇瓶悬浮培养，传代3～4次后，将培养液离心，并使用化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，传代至MDCK细胞完全单个悬浮生长。本发明的驯化方法，相较于逐步降血清法更快速高效，驯化时间仅需10代左右，远高于逐步降血清方法。相较于一步驯化法更温和，不受驯化所用无血清培养基的品质限制，更具有普遍应用价值，且其所用驯化时间同样较短，与一步驯化法相当。

Description

MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法
技术领域
本发明涉及一种用于生产生物制品的方法，尤其涉及一种驯化细胞的方法，以使其是适应悬浮培养。
背景技术
近年来，全球季节性流感疫苗的市场需求正在逐年稳步上升，众多发展中国家疫苗接种率较低的事实更是体现了季节性流感疫苗的巨大潜在市场开发前景。此外自2009年后岁无大流行流感的爆发，流感病毒依然对人类社会存在威胁。相较于传统的鸡胚生产法，用动物细胞来生产流感疫苗正在逐步成为主流生产方式。在过去十几年中，使用贴壁MDCK细胞来扩增流感病毒已取得了巨大的进展，然而该培养模式仍存在诸多的弊端，如：血清的使用会因换液导致培养工艺的复杂性以及血清批次引起的工艺稳定性问题。此外，高细胞密度培养通常受到微载体的表面积的限制，而MDCK细胞的在无血清或化学限定培养基中悬浮培养则可以解决以上弊端，使生产工艺操作简单、控制稳定、简化下游纯化操作，更易实现流感疫苗的大规模生产。在化学限定培养基中培养MDCK细胞因培养基成分明确、外源DNA含量控制而更适宜用于人用流感疫苗的生产。
获得可悬浮培养的MDCK细胞系需要进行MDCK贴壁细胞的驯化。目前常用的方法为逐步降血清法和一步驯化法。CN109929796A公开了一种通过逐步降血清法即降血清适应培养和悬浮培养驯化两个步骤获得的适应于无血清培养的悬浮MDCK细胞，驯化周期为35周。诸多案例均表明了逐步降血清法细胞驯化时间长、步骤繁琐、多出现细胞结团现象等缺陷，无法支持高密度生长。CN107460156A公开了一种通过一步驯化法获得的适应于无血清悬浮培养的MDCK细胞，但该方法通常存在较大偶然性，对驯化使用的培养基以及驯化培养条件有着较高的要求，设计合理的培养基和优化的培养条件才能够支持快速的驯化，但获得的细胞密度尚不能满足规模化生产的要求。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，将贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞，实现细胞的悬浮培养。
本发明的另一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，提高并获得稳定的细胞的比生长速率。
本发明的再一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，提高细胞活率。
本发明的又一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，增强对流感病毒H1N1和H3N2的扩增能力，获得的病毒滴度高。
本发明所称的“MDCK”、MDCK细胞或“MDCK细胞系”具有相同的含义，包括来自自然界的野生型MDCK，也包括通过人工手段将自然界中的MDCK细胞中进行改造。比如：通过改造了细胞干扰素抗病毒应答能力，因此使得MDCK细胞系具有更高的病毒扩增能力。通过驯化得到的新型细胞系同样保留了高产特性，还对H1N1和H3N2流感病毒均有优秀的扩增能力，适用于大规模的流感疫苗生产中。
一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，包括如下步骤：
先将于含血清培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80％～90％时，弃去含血清培养基，润洗(如：磷酸缓冲盐溶液，PBS)后加入胰酶溶液消化5分钟～10分钟；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化；
接着将收集到的MDCK细胞悬液转移至摇瓶中，加入含血清培养基并将细胞密度调整至0.8～1.5×106个细胞/mL，悬浮培养，将摇床转速设定为100rpm，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5％；
然后，用含血清培养基对MDCK细胞进行3～4次传代，每次传代后细胞密度需保持在0.8～1.5×106个细胞/mL；
之后，将含MDCK细胞的培养液进行离心并弃上清液，加入化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，并传代至MDCK细胞完全单个悬浮生长，获得在化学限定培养基中悬浮培养的MDCK细胞系，摇床转速设定为130rpm，温度设定为37℃，以及CO2浓度设定为5％。
一种含血清培养基的具体实施方式为，以DMEM为基础培养基，添加了10％胎牛血清。
一种终止消化的含血清培养基，以DMEM为基础培养基，并添加了10％胎牛血清，添加量为1-2mL。
一种优先选择的方案中，在含血清培养基中的MDCK细胞传代培养应以轻微聚团形式悬浮生长，每隔48小时传代一次，每次用胰酶溶液将细胞消化至单个状态后计数。
一种优先选的方案中，对MDCK细胞进行1000rpm离心10分钟。随着在化学限定培养基使用，细胞聚团会逐渐消失，至少传6代后可见MDCK细胞呈单个悬浮生长。
化学限定培养基中，各组分及其含量包括：
基础代谢营养物，包括：
4000～10000mg/L D-葡萄糖；50～600mg/L丙酮酸钠；5～30mg/L L-丙氨酸；180～600mg/L L-精氨酸；5～60mg/L L-天冬酰胺；5～60mg/L L-天冬氨酸；5～80mg/L L-胱氨酸；10～150mg/L L-半胱氨酸；5～60mg/L L-谷氨酸；300～1500mg/L L-谷氨酰胺；5～100mg/L甘氨酸；5～150mg/L L-组氨酸；10～150mg/L L-异亮氨酸；40～250mg/L L-亮氨酸；40～150mg/L L-赖氨酸；10～150mg/L L-甲硫氨酸；10～250mg/L L-苯丙氨酸；10～200mg/L L-脯氨酸；40～150mg/L L-丝氨酸；40～200mg/L L-苏氨酸；10～100mg/L L-色氨酸；10～100mg/L L-酪氨酸；40～200mg/L L-缬氨酸；
核苷酸，包括：
5～25mg/L次黄嘌呤；0.1～2mg/L胸苷；1～15mg/L腺苷；1～15mg/L尿苷；1～15mg/L胞苷；1～15mg/L鸟苷；
维生素，包括：
0.01～0.20mg/L D-生物素；2～10mg/L叶酸；2～10mg/L烟酰胺；2～10mg/L吡哆醇；2～10mg/L硫胺素；0.1～1mg/L核黄素；10～50mg/L氯化胆碱；2～10mg/L D-泛酸钙；10～50mg/L肌醇；
无机盐，包括：
10～50mg/L硝酸铁；0.1～1mg/L硫酸亚铁；200～500mg/L氯化钾；6000～9000mg/L氯化钠；50～100mg/L磷酸氢二钠；50～100mg/L磷酸二氢钠；20～100mg/L亚硒酸钠；500～2500mg/L Pluronic F-68；20～150mg/L抗细胞结团剂；
流感病毒增殖促进剂，包括：
1～10mg/L胆固醇；0.3～3mg/L DL-α-生育酚醋酸酯；0.05～0.5mg/L豆蔻酸；0.05～0.5mg/L棕榈酸；0.05～0.5mg/L硬脂酸；1000～5000mg/L氯化镁；50～250mg/L氯化钙；2～30mg/L二甲基亚砜；0.2～2.0mg/L硫酸锌；10～25mg/L硫酸铜；0.0001～0.001mg/L硫酸锰；0.001～0.005mg/L偏钒酸铵；
其它添加物，包括：
10～40mg/L柠檬酸铁铵；1～10mg/L乙醇胺；0.5～3mg/L谷胱甘肽。
本发明的方法，抗细胞结团剂如：但不限于硫酸葡聚糖。
另一种化学限定培养基，各组分及其含量包括：
基础代谢营养物，包括：
5000mg/L D-葡萄糖、200mg/L丙酮酸钠、15～17mg/L L-丙氨酸、285～295mg/L L-精氨酸、35～40mg/L L-天冬酰胺、35～40mg/L L-天冬氨酸、45～50mg/L L-胱氨酸、75～80mg/L L-半胱氨酸、30～35mg/L L-谷氨酸、840～860mg/L L-谷氨酰胺、45～55mg/L甘氨酸、70～80mg/L L-组氨酸；80～90mg/L L-异亮氨酸、130～140mg/L L-亮氨酸、100～110mg/L L-赖氨酸、80～90mg/L L-甲硫氨酸、100～110mg/L L-苯丙氨酸、90～100mg/L L-脯氨酸、70～80mg/L L-丝氨酸、120～130mg/L L-苏氨酸、50～60mg/L L-色氨酸、55～65mg/L L-酪氨酸和90～100mg/L L-缬氨酸；
核苷酸，包括：
10～15mg/L次黄嘌呤、0.3～0.6mg/L胸苷、6～9mg/L腺苷、6～9mg/L尿苷、6～9mg/L胞苷和6～9mg/L鸟苷；
维生素，包括：
0.05～0.10mg/L D-生物素、4～8mg/L叶酸、4～8mg/L烟酰胺、4～8mg/L吡哆醇、3～5mg/L硫胺素、0.4～0.6mg/L核黄素、30～4mg/L氯化胆碱、5～8mg/L D-泛酸钙和30～35mg/L肌醇；
无机盐，包括：
20～30mg/L硝酸铁、0.3～0.6mg/L硫酸亚铁、30～50mg/L硫酸镁、320～330mg/L氯化钾、6500～7500mg/L氯化钠、65～75mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠和50～60mg/L亚硒酸钠；
1500～2000mg/L Pluronic F-68、50～70mg/L硫酸葡聚糖等。
流感病毒增殖促进剂，包括3～5mg/L胆固醇、1.0～2.0mg/L DL-α-生育酚醋酸酯、0.1～0.3mg/L豆蔻酸、0.3～0.4mg/L棕榈酸、0.2～0.4mg/L硬脂酸、3000～3300mg/L氯化镁、170～180mg/L氯化钙、10～15mg/L二甲基亚砜、1.0～1.3mg/L硫酸锌、15～20mg/L硫酸铜、0.0003～0.0005mg/L硫酸锰和0.001～0.003mg/L偏钒酸铵。
其她添加物，包括：
20～30mg/L柠檬酸铁铵、3.0～5.0mg/L乙醇胺和1.0～2.0mg/L谷胱甘肽。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明的驯化方法，采用快速两步法，先将MDCK贴壁细胞悬浮培养于含血清培养基中，使细胞在含血清的状态下迅速适应悬浮培养状态，同时又在血清的支持下正常生长；然后去除血清将其悬浮培养于化学限定培养基中，从而获得全悬浮的MDCK细胞。该法相对于逐步降血清法更快速高效，驯化时间仅需10代左右，远高于逐步降血清方法。相对于一步驯化法更温和，不受驯化所用无血清培养基的品质限制，更具有普遍应用价值，且其所用驯化时间同样较短，与一步驯化法相当。
本发明的驯化方法，所使用的化学限定培养基不含动物血清、水解物等动物来源成分，化学成分确定且成本低，配制使用方便。培养基中DNA含量极低，十分适用于人用流感疫苗的生产，减轻下游纯化的压力，提高疫苗的安全性。且该化学限定培养基中加入了硫酸葡聚糖，可以有效改善驯化过程中的细胞结团现象，使得最终获得MDCK悬浮细胞呈单个悬浮生长。
本发明中的驯化法，适合于MDCK细胞的培养，用于人用流感疫苗生产的悬浮MDCK细胞系，单个悬浮生长、形态饱满、比生长速率高且稳定、细胞活率高，且对流感病毒H1N1和H3N2的扩增能力强，获得的病毒滴度高。
附图说明
图1为贴壁状态下的MDCK细胞显微镜下形态图；
图2为在化学限定培养基中驯化完成的MDCK悬浮细胞显微镜下形态图；
图3为本发明方法采用化学限定培养基中悬浮生长的MDCK细胞系传代和活率结果图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例采用的MDCK细胞来自华东理工大学赠与，其原始来源为ATCCMDCK CCL-34贴壁细胞株，直接来源为。
本发明以下实施例的培养基，其制取方法如下：
(1)将各原料混合后磨成干粉，然后将其在30℃温度下溶解，并充分混合20分钟后得到混合液；
(2)用NaOH固体调节培养基混合液的pH至6.3～6.7，继续搅拌混合(如：20分钟)，料液变澄清；
(3)加入NaHCO3粉末形成培养基缓冲液体系，并定容得到用于MDCK细胞全悬浮培养的化学限定培养基。
本发明以下实施例用于人用流感疫苗生产的悬浮MDCK细胞系评估人流感病毒H1N1和H3N2的扩增能力。具体评估步骤如下：
1)将所述MDCK全悬浮细胞于化学限定培养基中以0.8～1.5×106cells/mL的细胞密度接种，培养至3.0～5.0×106个细胞/mL时，以感染复数(MOI值)0.0001～0.01接种H1N1或H3N2流感病毒；
2)病毒感染后至病毒HA滴度到达平台期时，培养结束。
实施例1
适用于人用流感疫苗生产的在化学限定培养基中全悬浮培养的MDCK悬浮细胞系的驯化方法步骤：
1)将于常用含血清培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80-90％时，弃去方瓶中的含血清培养基，使用PBS润洗两遍；加入胰酶溶液使其刚好覆盖MDCK贴壁细胞层，消化5-10min；待细胞变圆后用手轻轻拍打方瓶底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化；
2)收集步骤1)中的细胞悬液并转移至摇瓶，加入适量含血清培养基并将细胞密度调整至0.8-1.5×106个细胞/mL，在转速为100rpm摇床中、温度37℃和5％CO2的条件下进行培养；
3)在该条件下用含血清培养基对步骤2)中的MDCK细胞进行3-4次传代，每次传代后细胞密度需保持在0.8-1.5×106个细胞/mL；
4)将步骤3)中含血清培养的MDCK细胞培养液进行离心并弃上清液，加入化学限定培养基重悬细胞团，升摇床转速至130rpm并于温度37℃和5％CO2的条件下于摇瓶中继续悬浮培养，并传代至完全单个悬浮生长，获得在化学限定培养基中悬浮培养的MDCK细胞系。
化学限定培养基中，各组分的浓度为：
基础代谢营养物
Figure BDA0002643815840000061
Figure BDA0002643815840000071
核苷酸:
Figure BDA0002643815840000072
维生素:
Figure BDA0002643815840000073
无机盐：
Figure BDA0002643815840000074
Figure BDA0002643815840000081
酸碱度指示剂：
酚红 8mg/L；
流感病毒增殖促进剂：
Figure BDA0002643815840000082
其它添加物：
柠檬酸铁铵 25mg/L；
乙醇胺 3.36mg/L；
谷胱甘肽 1.17mg/L。
通过本实施例获得的于化学限定培养基中悬浮生长的MDCK细胞以及原始贴壁MDCK细胞形态比较如图1、图2和图3所示，本实施例中获得的悬浮MDCK细胞系，单个悬浮生长，形态饱满，细胞比生长速率高且稳定，以1.0×106个细胞/mL为接种密度，2天后细胞能生长至5～6×106个细胞/mL，比生长速率在0.034～0.037h-1之间，细胞活率高于96％。
通过本实施例获得于化学限定培养基中悬浮生长的MDCK细胞的H1N1和H3N2流感病毒的扩增能力情况如表1所示。由此可知H1N1流感病毒在该MDCK悬浮细胞中扩增可得11log2(HAU/25μL)的HA滴度，H1N1流感病毒在该MDCK悬浮细胞中扩增可得10.5log2(HAU/25μL)的HA滴度，由此可知该MDCK悬浮细胞对流感病毒H1N1和H3N2的扩增能力强，获得的病毒滴度高。
表1
Figure BDA0002643815840000091
实施例2
适用于人用流感疫苗生产的在化学限定培养基中全悬浮培养的MDCK悬浮细胞系的驯化方法步骤：
1)将于常用含血清培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80-90％时，弃去方瓶中的含血清培养基，使用PBS润洗两遍；加入胰酶溶液使其刚好覆盖MDCK贴壁细胞层，消化5-10min；待细胞变圆后用手轻轻拍打方瓶底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化；
2)收集步骤1)中的细胞悬液并转移至摇瓶，加入适量含血清培养基并将细胞密度调整至0.8-1.5×106cells/mL，在转速为100rpm摇床中、温度37℃和5％CO2的条件下进行培养；
3)在该条件下用含血清培养基对步骤2)中的MDCK细胞进行3-4次传代，每次传代后细胞密度需保持在0.8-1.5×106cells/mL；
4)将步骤3)中含血清培养的MDCK细胞培养液进行离心并弃上清液，加入化学限定培养基重悬细胞团，升摇床转速至130rpm并于温度37℃和5％CO2的条件下于摇瓶中继续悬浮培养，并传代至完全单个悬浮生长，获得在化学限定培养基中悬浮培养的MDCK细胞系。
化学限定培养基中，各组分的浓度为：
基础代谢营养物:
Figure BDA0002643815840000092
Figure BDA0002643815840000101
核苷酸:
Figure BDA0002643815840000102
维生素:
Figure BDA0002643815840000103
Figure BDA0002643815840000111
无机盐：
Figure BDA0002643815840000112
酸碱度指示剂：
酚红 8mg/L；流感病毒增殖促进剂：
Figure BDA0002643815840000113
其它添加物：
柠檬酸铁铵 45mg/L；
乙醇胺 5.36mg/L；
谷胱甘肽 2.17mg/L。
通过本实施例获得于化学限定培养基中悬浮生长的MDCK细胞传代和活率如图3所示，细胞比生长速率高且稳定，以1.0×106个细胞/mL为接种密度，2天后细胞能生长至4.5-5.5×106个细胞/mL，比生长速率在0.031-0.036h-1之间，细胞活率高于96％。
通过本实施例获得于化学限定培养基中悬浮生长的MDCK细胞的H1N1和H3N2流感病毒的扩增能力情况如表2所示，可知H1N1流感病毒在该MDCK悬浮细胞中扩增可得10.5log2(HAU/25μL)的HA滴度，H1N1流感病毒在该MDCK悬浮细胞中扩增可得11log2(HAU/25μL)的HA滴度，由此可知该MDCK悬浮细胞对流感病毒H1N1和H3N2的扩增能力强，获得的病毒滴度高。
表2
Figure BDA0002643815840000121

Claims (9)

1.一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，包括如下步骤：
先将于含血清培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80％～90％时，弃去含血清培养基，润洗后加入胰酶溶液消化5分钟～10分钟；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化；
接着将收集到的MDCK细胞悬液转移至摇瓶中，加入含血清培养基并将细胞密度调整至0.8～1.5×106个细胞/mL，悬浮培养，将摇床转速设定为100rpm，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5％；
然后，用含血清培养基对MDCK细胞进行3～4次传代，每次传代后细胞密度需保持在0.8～1.5×106个细胞/mL；
之后，将含MDCK细胞的培养液进行离心并弃上清液，加入化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，并传代至MDCK细胞完全单个悬浮生长，获得在化学限定培养基中悬浮培养的MDCK细胞系，摇床转速设定为130rpm，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5％。
2.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的含血清培养基，以DMEM为基础培养基，并添加10％胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的终止消化的含血清培养基，以DMEM为基础培养基，并添加了10％胎牛血清，添加量为1-2mL。
4.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的MDCK细胞在含血清培养基中的传代培养应以轻微聚团形式悬浮生长，每隔48小时传代一次。
5.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的对MDCK细胞进行1000rpm离心10分钟，在化学限定培养中传代培养至少传6代后可呈现单个悬浮生长。
6.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的化学限定培养基，各组分及其含量包括：
基础代谢营养物，包括：
4000～10000mg/L D-葡萄糖；50～600mg/L丙酮酸钠；5～30mg/L L-丙氨酸；180～600mg/L L-精氨酸；5～60mg/L L-天冬酰胺；5～60mg/L L-天冬氨酸；5～80mg/L L-胱氨酸；10～150mg/L L-半胱氨酸；5～60mg/L L-谷氨酸；300～1500mg/L L-谷氨酰胺；5～100mg/L甘氨酸；5～150mg/L L-组氨酸；10～150mg/L L-异亮氨酸；40～250mg/L L-亮氨酸；40～150mg/L L-赖氨酸；10～150mg/L L-甲硫氨酸；10～250mg/L L-苯丙氨酸；10～200mg/L L-脯氨酸；40～150mg/L L-丝氨酸；40～200mg/L L-苏氨酸；10～100mg/L L-色氨酸；10～100mg/L L-酪氨酸；40～200mg/L L-缬氨酸；
核苷酸，包括：
5～25mg/L次黄嘌呤；0.1～2mg/L胸苷；1～15mg/L腺苷；1～15mg/L尿苷；1～15mg/L胞苷；1～15mg/L鸟苷；
维生素，包括：
0.01～0.20mg/L D-生物素；2～10mg/L叶酸；2～10mg/L烟酰胺；2～10mg/L吡哆醇；2～10mg/L硫胺素；0.1～1mg/L核黄素；10～50mg/L氯化胆碱；2～10mg/L D-泛酸钙；10～50mg/L肌醇；
无机盐，包括：
10～50mg/L硝酸铁；0.1～1mg/L硫酸亚铁；200～500mg/L氯化钾；6000～9000mg/L氯化钠；50～100mg/L磷酸氢二钠；50～100mg/L磷酸二氢钠；20～100mg/L亚硒酸钠；500～2500mg/L Pluronic F-68；20～150mg/L抗细胞结团剂；
流感病毒增殖促进剂，包括：
1～10mg/L胆固醇；0.3～3mg/L DL-α-生育酚醋酸酯；0.05～0.5mg/L豆蔻酸；0.05～0.5mg/L棕榈酸；0.05～0.5mg/L硬脂酸；1000～5000mg/L氯化镁；50～250mg/L氯化钙；2～30mg/L二甲基亚砜；0.2～2.0mg/L硫酸锌；10～25mg/L硫酸铜；0.0001～0.001mg/L硫酸锰；0.001～0.005mg/L偏钒酸铵；
其它添加物，包括：
10～40mg/L柠檬酸铁铵；1～10mg/L乙醇胺；0.5～3mg/L谷胱甘肽。
7.根据权利要求6所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。
8.根据权利要求6所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的化学限定培养基，各组分及其含量包括：
基础代谢营养物，包括：
5000mg/L D-葡萄糖、200mg/L丙酮酸钠、15～17mg/L L-丙氨酸、285～295mg/L L-精氨酸、35～40mg/L L-天冬酰胺、35～40mg/L L-天冬氨酸、45～50mg/L L-胱氨酸、75～80mg/LL-半胱氨酸、30～35mg/L L-谷氨酸、840～860mg/L L-谷氨酰胺、45～55mg/L甘氨酸、70～80mg/L L-组氨酸；80～90mg/L L-异亮氨酸、130～140mg/L L-亮氨酸、100～110mg/L L-赖氨酸、80～90mg/L L-甲硫氨酸、100～110mg/L L-苯丙氨酸、90～100mg/L L-脯氨酸、70～80mg/L L-丝氨酸、120～130mg/L L-苏氨酸、50～60mg/L L-色氨酸、55～65mg/L L-酪氨酸和90～100mg/L L-缬氨酸；
核苷酸，包括：
10～15mg/L次黄嘌呤、0.3～0.6mg/L胸苷、6～9mg/L腺苷、6～9mg/L尿苷、6～9mg/L胞苷和6～9mg/L鸟苷；
维生素，包括：
0.05～0.10mg/L D-生物素、4～8mg/L叶酸、4～8mg/L烟酰胺、4～8mg/L吡哆醇、3～5mg/L硫胺素、0.4～0.6mg/L核黄素、30～4mg/L氯化胆碱、5～8mg/L D-泛酸钙和30～35mg/L肌醇；
无机盐，包括：
20～30mg/L硝酸铁、0.3～0.6mg/L硫酸亚铁、30～50mg/L硫酸镁、320～330mg/L氯化钾、6500～7500mg/L氯化钠、65～75mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠和50～60mg/L亚硒酸钠；
1500～2000mg/L Pluronic F-68、50～70mg/L硫酸葡聚糖等。
流感病毒增殖促进剂，包括3～5mg/L胆固醇、1.0～2.0mg/L DL-α-生育酚醋酸酯、0.1～0.3mg/L豆蔻酸、0.3～0.4mg/L棕榈酸、0.2～0.4mg/L硬脂酸、3000～3300mg/L氯化镁、170～180mg/L氯化钙、10～15mg/L二甲基亚砜、1.0～1.3mg/L硫酸锌、15～20mg/L硫酸铜、0.0003～0.0005mg/L硫酸锰和0.001～0.003mg/L偏钒酸铵。
其它添加物，包括：
20～30mg/L柠檬酸铁铵、3.0～5.0mg/L；乙醇胺和1.0～2.0mg/L谷胱甘肽。
9.一种用于人用流感疫苗生产的细胞，其特征在于以权利要求1～8之一所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法获得。
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