CN108359632A - Mdck细胞系、复制病毒的方法及其应用 - Google Patents

Mdck细胞系、复制病毒的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种MDCK细胞系、复制病毒的方法及其应用。该细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201857，保藏时间为2018年2月10日。本发明所提供的MDCK细胞不仅适合于全悬浮培养，还能用无动物源血清培养基培养，能够使得病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险降低。

Description

MDCK细胞系、复制病毒的方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种MDCK细胞系、复制病毒的方法及其应用。
背景技术
流感病毒疫苗的制备经过了从动物组织器官到细胞培养的规模化发展过程，动物流感病毒的培养也经历了从鸡胚向哺乳动物细胞大规模培养，从哺乳动物细胞的微载体悬浮培养到全悬浮培养，从动物源血清的培养到无动物源血清或成分的培养的发展过程，并结合离心纯化以及柱层析纯化，使动物流感病毒或抗原生产方法的可控性提高，也减少了疫苗注射引起的应急反应。
尽管这样，常用的用于培养流感病毒的细胞系仍存在各种缺点，因此仍无法满足。此研究一种安全，高产的细胞基质将是现行流感疫苗工艺研究的重要问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供了一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系，还提供了利用所述的细胞系培养流感病毒的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种MDCK细胞系，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201857，保藏时间为2018年2月10日。
本发明所提供的MDCK细胞系，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心。培养物名称(分类命名)：犬肾细胞MDCK-G01。
根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述MDCK细胞系的衍生细胞系。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种复制病毒的方法，其包括：
a)培养如上所述的细胞系并接种所要复制的病毒；
b)对细胞进行温育；和
c)当其达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子；
d)可选的，在步骤c)之后，再从所述病毒粒子中分离出病毒抗原并提纯。
根据本发明的一方面，本发明还涉及前述任一项权利要求所述之方法在制备病毒疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的MDCK细胞，先通过逐步降低血清含量制得低血清贴壁培养的细胞株，再经过逐步增加培养转速，细胞逐渐失去黏附瓶壁的依赖，同时也协调使用胎牛血清转变为新生牛血清，然后再配合逐渐提升无血清培养基的含量进行驯化摇床培养得到，因而该细胞不仅适合于全悬浮培养，还能用无动物源血清培养基培养，能够使得病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险降低。
(2)该细胞系生长速率快。
(3)该细胞系还具有很强的耐低氧能力，由于大型生物反应器容积较大，偶尔会发生氧气搅拌不均的问题，因而更易造成细胞缺氧死亡。该细胞系尤其适合于大型生物反应器的培养。
具体实施方式
本发明涉及一种MDCK细胞系，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201857，保藏时间为2018年2月10日。
根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述MDCK细胞系的衍生细胞系。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种复制病毒的方法，其包括：
a)培养如上所述的细胞系并接种所要复制的病毒；
b)对细胞进行温育；和
c)当其达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子；
d)可选的，在步骤c)之后，再从所述病毒粒子中分离出病毒抗原并提纯。
优选的，如上所述之方法，在步骤a)中，当所述细胞系生长至细胞密度为至8.0×106～1.0×107cells/mL时接种病毒(也可以选择9.0×106cells/mL)，病毒按照MOI＝0.001～0.0001接种。
优选的，如上所述之方法，在步骤a)和b)中，所述培养及所述温育在全悬浮培养条件下进行。
优选的，如上所述之方法，在步骤a)和b)中，所述培养及所述温育所用培养基为无血清培养基。
优选的，如前述任一项权利要求所述之方法，所述病毒包括选自流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒，乳多空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯萨奇病毒，呼肠弧病毒，细小病毒，腺病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒和疱疹病毒。
优选的，如上所述之方法，所述病毒选自人流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒或犬流感病毒；
优选的，所述禽流感病毒选自H5N1亚型Re-8株、H7N9亚型H7-Re1株。
根据本发明的一方面，本发明还涉及前述任一项权利要求所述之方法在制备病毒疫苗中的应用。
优选的，如上所述之应用，所述疫苗为减毒活疫苗、全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗或核酸疫苗。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种保藏编号为CCTCC NO:C201857的MDCK细胞的制备方法，步骤如下：
贴壁培养型MDCK细胞由西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心(简写GsACC)从ATCC引进，引进时间：2011年2月，ATCC编号：CCL-34，代次：P56，保存号：58860056。在GsACC扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为:GsACC2B0000090。
用含10％的FBS的DMEM/F12培养液复苏MDCK细胞，生长致密后传代。
挑选生长良好的细胞，逐步驯化培养，具体如下：
用胎牛血清含量为8％的DMEM/F12培养基传代培养3次；
用胎牛血清含量为5％的DMEM/F12培养基传代培养5次；
用胎牛血清含量为2％的DMEM/F12培养基传代培养5次；
用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养7次；
用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养6次；
少量贴壁细胞变圆，并且培养液中有悬浮细胞，用低血清培养基传代培养5次；
消化、离心，得到的细胞以细胞密度为1.2×106cells/ml、转速为30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/L进行换液；
待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约5.2×105cells/ml，并逐步提高摇床转速，先提高转速30r/min，再提高转速20r/min，每次转速适应培养3-5代，最终转速提高到80r/min；
转速提高到80r/min共传代6次，得到性能稳定的且完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株，冷冻保藏；
复苏低血清培养的细胞，稳定培养4代后，挑选生长良好的细胞，离心1000r/min5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为4:1混合的培养液培养，适应培养5代。
挑选生长良好的细胞，离心1000r/min 5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为2:1混合的培养液培养，适应培养5代；
挑选生长良好的细胞，离心1000r/min 5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为1:2混合的培养液培养，适应培养5代；
挑选P120代生长良好的细胞，离心1000r/min 5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用无血清培养基培养，适应培养8代得到生长稳定的无血清悬浮培养的MDCK细胞。
此后，不再离心换液，保留原培养液，补入新的培养基，进行稀释传代即可。
制得的无血清悬浮培养的MDCK细胞，以1.5×106cells/ml的密度接种，72小时达到峰值1.75×107cells/ml，曲线特征为近“S”型曲线，此后细胞进入衰退期，细胞密度开始下降。细胞倍增时间21小时。
通过该方法共筛选得到三株可用于无血清全悬浮培养、且细胞生长速度均较理想、也具有较好的耐低氧能力的细胞，分别命名为G01(本发明请求保护的细胞系)、G02、G03。
实施例2
本实施例提供了一种对保藏编号为CCTCC NO:C201857的MDCK细胞的培养方法。
本实验例提供了本发明所提供的GJ-pyj201培养基对保藏编号为CCTCC NO:C201857的MDCK细胞的培养效果。
一、方法
1.1摇瓶细胞的制备
按常规方法从液氮中复苏冻存的悬浮种细胞，用吸管将细胞液加入到500ml三角摇瓶中，加入pH值为7.0±0.2的过滤除菌无血清培养基至100ml。将摇瓶置于摇床内，37℃，120r/min～140r/min进行培养扩繁。待细胞数量足够时，可接种反应器培养。
1.2 5L反应器细胞培养
取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，以1.0～2.0×106cells/ml的密度接种到5L反应器培养，培养体积为2L，转速120转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2，每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定。待细胞密度≥2.0×106cells/ml时，将5L反应器的培养体积流加至4.5L，调整反应器控制参数(转速120r/min～140r/min、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2)继续培养。每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，待细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，转出4L至25L反应器内，余下0.5L用细胞培养液流加至5L体积继续培养。
1.3反应器放大培养
将从5L反应器转移出的细胞接入提前灭菌并预孵细胞培养液的25L反应器中培养，以1.0～2.0×106cells/ml的密度接种到25L反应器培养，培养体积为20L～25L，转速100r/min～130r/min、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2，每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，待25L反应器的细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，将细胞转入提前灭菌并预孵细胞培养液的125L反应器中继续放大培养(转速80～100r/min、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2)。每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，当细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，适时将细胞转入下一级放大的细胞反应器(5倍放大)，待终级反应器(6000L)细胞密度达到8.0×106～1.0×107cells/ml时可用于接毒培养。
1.4分别将3个6000L生物反应器准备好并灭菌备用，按照反应器编号将1#、2#、3#培养基以无菌的方法过滤至对应的反应器中预孵24h。培养基预孵后无异常即可按照1.5×106～2.0×106cells/mL的密度将种细胞分别接种至三个反应器，接种后调整好反应器温度37℃、pH7.0、溶氧30-60％、搅拌转速40-60r/min等参数并开启自控。接种后24h取样观察并进行细胞计数，接种后48h再次取样观察并计数，细胞的比生长速率μ应该≥0.69。当细胞密度达到8.0×106～9.0×106cells/mL左右时即可补充接毒液调整细胞密度进行接毒。
二、结果：
2.1三种培养基的细胞增殖情况对比
当种细胞的接种密度均为1.5×106～2.0×106cells/mL的情况下，培养0h、24h、48h时取样进行活细胞计数并镜检观察细胞的状态，镜检观察1#、2#培养基培养细胞有少量结团外，且有形状不规则细胞，3#培养基培养细胞状态良好，细胞都比较圆润、表面光滑、大小均一。培养后0h、24h、48h时取样计数，从表1可以看出3#的细胞增殖最快，细胞密度达到1.0×107cells/mL以上，细胞活力维持在98％以上。
表1MDCK细胞在不同培养基上的增殖情况
2.2H7-Re1株在三种培养基培养的MDCK细胞上的增殖情况对比
细胞培养48h后补充接毒液，将3个6000L反应器的细胞密度都调整至4.5×106cells/mL左右，按照MOI为10-3接入同一批种毒。接毒后24小时取样测HA，3#反应器HA较高，达到1:256，病变也比较明显。最终48h收毒时3#反应器的毒价最高，HA达到1:1024，每1ml病毒含量达到108.37TCID50，每0.1ml病毒含量达到108.17EID50，结果见表2。
表2病毒在MDCK细胞上的增殖情况
其中，1#培养基按照申请公布号CN105543163A，申请公布日为2016.05.04的专利申请文件的实施例3进行配制。
2#培养基的配制方法为：
一种适应MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用超纯水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8M、氯化钙2×10-3M、硫酸铜7.8×10-9M、氰钴胺3×10-7M、D-泛酸钙5×10-5M、D-葡萄糖1.8×10-2M、硫酸亚铁5×10-6M、叶酸1×10-4M、谷胱甘肽6.5×10-7M、氢化可的松5×10-8M、次黄嘌呤3×10-5M、肌醇7×10-5M、硝酸铁1.2×10-7M、L-丙氨酸5×10-5M、L-精氨酸7×10-4M、L-天冬酰胺5×10-5M、L-天冬氨酸5×10-5M、L-半胱氨酸1×10-4M、L-胱氨酸1×10-4M、L-谷氨酸5×10-5M、L-谷氨酰胺2.5×10-3M、甘氨酸2.5×10-4M、L-组氨酸1.5×10-4M、L-异亮氨酸4.2×10-4M、L-亮氨酸4.5×10-4M、L-赖氨酸5×10-4M、L-蛋氨酸1.2×10- 4M、L-苯丙氨酸2.2×10-4M、L-脯氨酸1.5×10-4M、L-丝氨酸2.5×10-4M、L-苏氨酸4.5×10- 4M、L-色氨酸4.4×10-5M、L-酪氨酸2.1×10-4M、L-缬氨酸4.5×10-4M、硫辛酸5.1×10-7M、氯化镁6×10-5M、硫酸镁7×10-4M、烟酰胺1.7×10-5M、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3M、腐胺5×10-7M、吡多辛1.5×10-7M、核黄素5.8×10-7M、碳酸氢钠2.9×10-2M、氯化钠1.19×10- 1M、磷酸氢二钠5×10-4M、磷酸二氢钠4.5×10-4M、丙酮酸钠1×10-3M、硫胺素6.4×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6M、硫酸锌1.5×10-6M、氯化胆碱1×10-4M、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12M以及二硫苏糖醇6.5×10-6M。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节pH＝7.2-7.4。
3#培养基的配制方法为：
一种适应MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用注射用水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8M、氯化钙2×10-3M、硫酸铜7.8×10-9M、氰钴胺3×10-7M、D-泛酸钙5×10-5M、D-葡萄糖1.8×10-2M、硫酸亚铁5×10-6M、叶酸1×10-4M、谷胱甘肽6.5×10-7M、氢化可的松5×10-8M、次黄嘌呤3×10-5M、肌醇7×10-5M、硝酸铁1.2×10-7M、L-丙氨酸5×10-5M、L-精氨酸7×10-4M、L-天冬酰胺5×10-5M、L-天冬氨酸5×10-5M、L-半胱氨酸1×10-4M、L-胱氨酸1×10-4M、L-谷氨酸5×10-5M、L-谷氨酰胺2.5×10-3M、甘氨酸2.5×10-4M、L-组氨酸1.5×10-4M、L-异亮氨酸4.2×10-4M、L-亮氨酸4.5×10-4M、L-赖氨酸5×10-4M、L-蛋氨酸1.2×10- 4M、L-苯丙氨酸2.2×10-4M、L-脯氨酸1.5×10-4M、L-丝氨酸2.5×10-4M、L-苏氨酸4.5×10- 4M、L-色氨酸4.4×10-5M、L-酪氨酸2.1×10-4M、L-缬氨酸4.5×10-4M、硫辛酸5.1×10-7M、氯化镁6×10-5M、硫酸镁7×10-4M、烟酰胺1.7×10-5M、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3M、腐胺5×10-7M、吡多辛1.5×10-7M、核黄素5.8×10-7M、碳酸氢钠2.9×10-2M、氯化钠1.19×10- 1M、磷酸氢二钠5×10-4M、磷酸二氢钠4.5×10-4M、丙酮酸钠1×10-3M、硫胺素6.4×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6M、硫酸锌1.5×10-6M、氯化胆碱1×10-4M、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12M、二硫苏糖醇6.5×10-6M、亚油酸2×10-7M、苯酚红3.6×10- 5M、泊洛沙姆2g、前列腺素E2 7×10-8M、H2SeO3 3×10-8M以及Na2SiO3 5×10-7M。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节pH＝7.2-7.4。
实施例3
按实施例2中1.1～1.4的培养条件培养实施例1中筛选得到的G01、G02、G03细胞，培养基均采用3#培养基，区别仅在于，在步骤1.4中，将溶氧控制在25-35％，从而模拟生物反应器中局部缺氧的环境。
在培养0h和24h时取样观察细胞活率。
表3不同MDCK细胞在低氧环境下的细胞活率
其中，G01细胞明显具备更强的对低氧环境的忍耐能力。
按实施例2中1.1～1.4的培养条件培养实施例1中筛选得到的G01细胞，区别仅在于，在步骤1.4中，先均用3#培养基以无菌的方法过滤至对应的反应器中预孵24h，以使得3个反应器中的初始细胞活率一致。随后在正式培养时，将溶氧控制在25-35％，从而模拟生物反应器中局部缺氧的环境，同时将三个反应器中的培养基都分别替换为1#、2#、3#培养基。
表4不同培养基对MDCK-G01细胞在低氧环境下的细胞活率
从表4可知，3#培养基能进一步提升MDCK-G01细胞的耐低氧能力。
这可能是由于本申请所添加的既定量的谷胱甘肽、泊洛沙姆、PGE2等成分能够有效调节MDCK-G01细胞细胞膜的通透性，促进更高效率的气体交换。此外亚硒酸、Na2SiO3、亚油酸和泊洛沙姆等成分还能减少细胞的团聚，可进一步增加氧气的利用效率。
由于大型生物反应器容积较大，偶尔会发生氧气搅拌不均的问题，因而更易造成细胞缺氧死亡。本发明申请人制备疫苗时常采用3000L～6000L的大型生物反应器进行细胞培养，因而对细胞的耐低氧能力要求较高。本发明所提供的MDCK-G01细胞系配合特定的培养基可取得较为理想的培养效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种MDCK细胞系，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201857，保藏时间为2018年2月10日。
2.权利要求1所述MDCK细胞系的衍生细胞系。
3.一种复制病毒的方法，其包括：
a)培养权利要求1或2所述的细胞系并接种所要复制的病毒；
b)对细胞进行温育；和
c)当其达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子；
d)可选的，在步骤c)之后，再从所述病毒粒子中分离出病毒抗原并提纯。
4.如权利要求3所述之方法，在步骤a)中，当所述细胞系生长至细胞密度为至8.0×106～1.0×107cells/mL时接种病毒，病毒按照MOI＝0.001～0.0001接种。
5.如权利要求3所述之方法，在步骤a)和b)中，所述培养及所述温育在全悬浮培养条件下进行。
6.如权利要求3所述之方法，在步骤a)和b)中，所述培养及所述温育所用培养基为无血清培养基。
7.如前述任一项权利要求所述之方法，所述病毒包括选自流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒，乳多空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯萨奇病毒，呼肠弧病毒，细小病毒，腺病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒和疱疹病毒。
8.如权利要求7所述之方法，所述病毒选自人流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒或犬流感病毒；
优选的，所述禽流感病毒选自H5N1亚型Re-8株、H7N9亚型H7-Re1株。
9.前述任一项权利要求所述之方法在制备病毒疫苗中的应用。
10.如权利要求9所述之应用，所述疫苗为减毒活疫苗、全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗或核酸疫苗。
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