CN111850169B - 一种计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种计算AIV在MDCK‑sus细胞中细胞单位均产毒量的方法，包括如下步骤：步骤1：感染流感病毒时活细胞的密度CDI和MOI；步骤2：获取第i次取样后剩余的流感病毒液的体积Vi，i时刻流感病毒血凝滴度值ɑHAi；步骤3：获取检测流感病毒血凝滴度时鸡红细胞密度RBC；步骤4：根据步骤1‑3所获得的数据得到细胞单位均产毒量VPC，其计算公式如下式1；
该方法以设计时间段的取样后的剩余体积、滴度、鸡红细胞密度，MOI感染复数作为依据，得到某一时间段的细胞平均产毒量，其计算准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法。
背景技术
目前，家禽年出栏量和产值在逐年上升，但禽流感的持续爆发严重危害了养禽业，不仅造成了巨大的经济损失，还引起了多起公共卫生事件，接种禽流感疫苗是最有效的防控手段，因此必须提高禽流感疫苗技术水平。
传统禽流感疫苗通过鸡胚培养生产，效率低、成本高、品质不稳定。国外流感细胞苗主要采用MDCK、Vero等细胞载体贴壁生产；国内多家单位也开展了禽流感细胞苗的研究，但由于微载体工艺扩大困难、细胞密度和病毒滴度较低等的因素制约了其产业化进程。而细胞悬浮培养是大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是生物制药行业发展的必然趋势，该技术完全克服了以往技术的弊端。
全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚或贴壁细胞生产禽流感病毒缺点基础之上建立的一种先进的培养方式，即能节约成本、省时省力、又能扩大培养，生产高质量、高滴度的禽流感病毒。
目前对于细胞单位均产毒量的计算存在的问题在于：细胞均产毒量的计算偏差过大，精确度不高，所以迫切需要一种能够提高细胞均产毒量的估算方法，以评价培养体系和培养方法的有效性。
发明内容
本发明的目的是提供一种计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法，该方法以设计时间段的剩余体积、滴度、鸡红细胞密度作为依据，得到某一时间段的细胞平均产毒量，其计算准确可靠。
本发明的技术方案为：
一种计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法，包括以下步骤：
步骤1：感染流感病毒时活细胞的密度CDI、感染复数MOI；
步骤2：获取第i次取样后剩余的流感病毒液的体积Vi，i时刻流感病毒血凝滴度值ɑHAi；
步骤3：获取检测流感病毒血凝滴度时鸡红细胞密度RBC；
步骤4：根据步骤1-3所获得的数据得到细胞单位均产毒量VPC，其计算公式如下式1；
其中，
Vi为第i次取样后剩余体积，MOI为感染复数，N为取样次数，VW为在第一次取样之前的工作体积。
在上述的计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法中，所述方法具体为：取MDCK-sus细胞扩繁传代；取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，接种于MDCK细胞无血清培养基中，进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；当MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，分瓶培养，在接种H9N2亚型禽流感病毒前测算活细胞的密度CDI；接种H9N2亚型禽流感病毒，同时加入TPCK-胰酶继续培养并测算工作体积VW，在接种病毒12～72后获取病毒液测算剩余的流感病毒液的体积Vi、流感病毒血凝滴度值ɑHAi、鸡红细胞密度RBC；每次取样后，根据历史数据计算细胞单位均产毒量VPC。
在上述的计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法中，接种病毒前，MDCK-sus细胞在MDCK细胞无血清培养基培养时间为24～72小时。
在上述的计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法中，加入TPCK-胰酶的终浓度为3～11ug/mL。
在上述的计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法中，H9N2亚型禽流感病毒的感染复数MOI为0.0001～0.1，接种病毒后培养温度为33～37℃。
在上述的计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法中，MDCK-sus细胞悬液的浓度为0.5×106～2×106cells/mL。
本发明的有益效果如下：
本发明的方法以设计时间段的剩余体积、滴度、鸡红细胞密度作为依据，得到某一时间段的细胞平均产毒量，其计算准确可靠。
附图说明
附图1为实施例中不同MOI时病毒HA滴度的比较图，*表示有显著性差异(p＜0.05)；**表示极显著性差异(p＜0.01)；
附图2为实施例中不同MOI时病毒含量的比较图，*表示有显著性差异(p＜0.05)；**表示极显著性差异(p＜0.01)；
图3为实施例中不同MOI时单位细胞均产毒量的比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
以下实施例中的试剂：
仪器与试剂
生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司)；恒温水浴锅DK-8D(一恒/上海)；二氧化碳培养箱Forma 371(Thermo公司)；生化培养箱DHP-9162(一恒/上海)；高性能高速台式冷冻离心机5804R(Eppendorf/德国)；电热恒温培养箱DHP-9162(一恒/上海)；涡旋振荡器Vortex(Thermo公司)；移液器Research plus(Eppendorf/德国)；倒置显微镜DMI1(德国徕卡)；countstar细胞计数仪IC-1000(上海睿钰生物科技有限公司)；Nova多参数生化分析仪BIOPROFILE(美国)；FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；SMA4000微量分光光度计(merinton)。
Driving-M MDCK细胞无血清培养基购自上海倍谙基生物科技有限公司；TPCK-胰酶、PBS、SPF鸡胚由广东温氏大华农生物科技有限公司提供；TaqDNA聚合酶、10×PCRBufferMgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、Marker、6×DNA Loading Dye、10×TAE、一步法快速感受态细胞制备试剂盒，SanPrep柱式质粒DNA少量抽提试剂盒、琼脂糖、DNA柱式胶回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；4SRed Plus核酸染色剂购自BBI血；胎牛血清(FetalBovine Serum)、胰酶(0.25％Trypsin-EDTA)、DMEM培养基(DMEM/High glucose)、0.25％Trypsin-EDTA等试剂均来自Gibco公司。
病毒和细胞
H9亚型禽流感病毒SS株(细胞适应株)，病毒含量为109.0EID50/0.2mL，全悬浮MDCK-sus细胞均由肇庆大华农农业部动物疫控生物技术与制品创制重点实验室保存供应
实施例1
取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液采用起始活细胞接种密度1×106cells/mL，设置转速为130r/min、温度为37℃、通入浓度为5％的CO2的条件下，在125mL摇瓶30mLDriving-M MDCK细胞无血清培养基培养体系中进行无血清全悬浮培养并扩繁传代，细胞密度达到对数生长期密度且总量达到一定规模时，分瓶培养，均是125mL摇瓶30mL培养体系。细胞培养至第48H，测算活细胞的密度CDI，设计MOI分别为0.1、0.01、0.001、0.0001，根据接种病毒含量与细胞数量比例关系，计算所需接种的AIV体积，同时加入TPCK-胰酶，并转移至5％CO2培养箱继续培养，测算此时的混合液的体积即工作体积VW，温度设为33℃。接种病毒24小时起，每12小时取样监测细胞密度和活度；每12小时留取培养液样本待测HA血凝效价和病毒含量，连续观察96小时，做三次重复。
得到的不同MOI时病毒HA滴度的比较图如附图1所示，通过各实验组感染后HA滴度比较，MOI为0.001和0.0001时，感染后HA滴度均在第48小时达到峰值为9.32±0.44log2；当MOI为0.1时，感染后HA滴度值最高为8.73±0.44log2，低于其它实验组；当MOI为0.01时，感染后HA滴度高于其它实验组，且于感染后36小时达到峰值为10log2，随后至72小时，HA滴度保持不变；不同MOI时病毒含量的比较图如附图2所示；当MOI为0.1时，病毒含量最高仅为104.00EID50/0.1mL，而当MOI为0.01、0.001、0.0001时，病毒含量均在48h达到最高点，最高点分别为108.21±0.61EID50/0.1mL、108.00±0.67EID50/0.1mL、107.54±0.07EID50/0.1mL，因此当MOI为0.01时，病毒含量高于其它实验组，且MOI为0.01时病毒含量与MOI为0.1时病毒含量有极显著性差异。同时通过式1得到：当MOI为0.01时，单位细胞均产毒量为59451virons/cell，也较其他实验组较高，不同时间的单位细胞均产毒量参考图3。据上判断：MOI为0.01接种病毒为最佳MOI。
VPC测试结果如下表1：
表1
其中，VPC1是指经过实测的单位细胞均产毒量；
VPC2是经过式1计算得到的单位细胞均产毒量。
通过以上测试和计算结果可以发现，式1对于单位细胞均产毒量的计算是非常准确的，偏差度小。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：感染流感病毒时活细胞的密度CDI、感染复数MOI；
步骤2：获取第i次取样后剩余的流感病毒液的体积Vi，i时刻流感病毒血凝滴度值ɑHAi；
步骤3：获取检测流感病毒血凝滴度时鸡红细胞密度RBC；
步骤4：根据步骤1-3所获得的数据得到细胞单位均产毒量VPC，其计算公式如下式1；
其中，
Vi为第i次取样后剩余体积，MOI为感染复数，N为取样次数，VW为在第一次取样之前的工作体积；
所述方法具体为：取MDCK-sus细胞扩繁传代；取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，接种于MDCK细胞无血清培养基中，进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；当MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，分瓶培养；在接种H9N2亚型禽流感病毒前测算活细胞的密度CDI；接种H9N2亚型禽流感病毒，同时加入TPCK-胰酶继续培养并测算工作体积VW，在接种病毒12～72后获取病毒液测算剩余的流感病毒液的体积Vi、流感病毒血凝滴度值ɑHAi、鸡红细胞密度RBC；每次取样后，根据历史数据计算细胞单位均产毒量VPC；
接种病毒前，MDCK-sus细胞在MDCK细胞无血清培养基培养时间为24～72小时；
H9N2亚型禽流感病毒的感染复数MOI为0.0001～0.1，接种病毒后培养温度为33～37℃。
2.根据权利要求1所述的计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法，其特征在于，加入TPCK-胰酶的终浓度为3～11ug/mL。
3.根据权利要求1所述的计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法，其特征在于，MDCK-sus细胞悬液的浓度为0.5×106～2×106cells/mL。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111850169A (zh) | 2020-10-30 |
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