CN112159866A - 一种基于流感病毒载体的hiv-1核酸检测质控品的制备方法 - Google Patents

一种基于流感病毒载体的hiv-1核酸检测质控品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于流感病毒载体的HIV‑1核酸检测质控品的制备方法，所述质控品由携带HIV‑1保守基因的重组流感病毒经扩增培养、灭活纯化后获得。所述的基于流感病毒载体的HIV‑1核酸检测质控品的制备方法包括如下步骤：(1)构建插入HIV‑1保守基因的、可用于拯救流感病毒PR8的CRISPR‑Cas9大片段敲入体系；(2)将构建的体系与PR8流感病毒PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、及M蛋白编码质粒共转染293T细胞，激发起功能拯救流感病毒，获得带有HIV‑15’‑UTR的重组流感病毒；(3)将构建的流感病毒进行扩增培养、灭活、纯化后即可制得HIV‑1核酸检测质控品。本发明具有高度模拟HIV‑1病毒的特点，可对HIV‑1核酸检测进行全方位检测；整体制备流程简便，成本较低，易于储存与转运，具有良好的应用前景。

Description

一种基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法
技术领域
本发明属于HIV-1核酸检测领域，具体设计一种基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)是一种经血液、体液等途径传播的RNA病毒，属逆转录病毒，是造成艾滋病的罪魁祸首。HIV-1病毒是目前我国流行的最主要亚型，占到90％以上。尽管中国艾滋病整体上仍处于较低流行水平，但艾滋病人基数在逐年增加。最近几年，我国每年报告新发现HIV感染者/AIDS病人均超过10万例，且每年都呈现增长之势，截止2018年，全国报告现存活艾滋病人和感染者已超过82万人，因此，对其准确、高效、精准的检测是当下HIV防控的重要举措。
目前，实时荧光定量RT-PCR凭借其高灵敏度、高特异性、重复性好、重现性高、便于定量分析等优势，已成为目前临床HIV检测的一线方法，可用于干扰早期，甚至抗体检测窗口期的筛查与诊断。同时，HIV-1核酸检测对于疾病的病情评估、预后预测、指导用药，以及疗效监测都具有重要价值。然而，RT-PCR整体检测流程较为复杂，分为核酸抽提与纯化、逆转录、逆转录产物扩增、以及最后的扩增产物分析等步骤，故容易受到包括样本保存、样本转运、检测人为因素在内的多种因素的影响。因此，极为有必要在HIV-1的RT-PCR检测过程中构建严格的质量控制体系，应用质量控制措施。完成前述质控管理的必要条件是引入特定的、符合条件的阳性质控品对整体检测流程进行评估，此对于保证HIV-1核酸检测结果的准确性具有重要的意义。
目前，HIV-1核酸检测质控品主要有阳性病人的血清/血浆、人工制备的假病毒颗粒、或者直接使用裸露的RNA片段，以上三者都具有各自的局限性：阳性病人来源的质控品其核酸载量不稳定，制备批间差不易控制，且具有生物安全隐患；裸露的RNA本身稳定性非常差，极易受到环境影响，对最后检测结果造成无法估量的影响；人工制备的假病毒颗粒一般使用体外重组技术，使用磷脂双分子层结构报过RNA片段，例如噬菌体颗粒，具有高度的模拟性，但是目前仍存在制备成本与技术门槛过高等缺陷，很难在实际工作中大规模应用此种来源的质控品。因此探索新型、价格低廉、技术门槛低的方式制备HIV-1核酸检测质控品对于规范HIV-1核酸检测，确保其准确性具有重要意义。
流感病毒目前被认为是一种极为理想的病毒类基因操作载体，既往由于编辑、制备特定基因型流感病毒的技术较为复杂，难以应用于工业生产。近年来，随着流感病毒反向遗传学技术的发展，目前已可以使用8质粒反向遗传操作系统，在人源性活体细胞中利用同一质粒模板大批量生成基因型稳定的流感病毒。此方案具有效率高、基因型稳定、产量大等优点，目前已被广泛应用于多种生物工程中流感病毒的制备。另一方面，CRISPR-Cas9基因编辑体系以其高精度的基因编辑能力与超凡的编辑效率闻名于世，目前已成为生物工程领域中基因编辑的最常用工具。近年来，随着技术研发的进展，以CRIPSR-Cas9技术为基础的大片段敲入表达已成为现实，相较于普通的质粒表达体系，其具有更高的表达效率与更低的错误发生率，可稳定维持特定基因的高效、持久表达，适用于大规模工业生产。因此，联合利用CRISPR-Cas9技术敲入HIV-1保守大片段基因并诱导其表达，联合8质粒反向拯救系统构建以流感病毒为载体的HIV-1核酸检测质控品具有巨大的应用潜能：从结构来看，流感病毒衣壳包裹HIV-1RNA核酸高度模拟了HIV-1这个逆转录病毒的结构，较之噬菌体可更为真实的反映HIV及其在样本中的情况；其次，流感病毒的大批量整体制备流程可遵循流感疫苗的生产及其质量控制要求，相应的标准皆可参考中国药典中“流感病毒灭活疫苗”的相关内容，故以流感病毒为载体的HIV-1核酸检测质控品可以最大程度模拟真实病毒核酸检测过程，更为真实的评估检测的特异性和灵敏度，真正实现对HIV-1核酸检测的全方位监测，对于保证HIV-1RNA检测结果的准确可靠具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，具有高度模拟HIV-1病毒的特点，可对HIV-1核酸检测进行全方位检测；整体制备流程简便，成本较低，易于储存与转运，具有良好的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，所述质控品由携带HIV-1保守基因的重组流感病毒经扩增培养、灭活纯化后获得。
其中，所述的基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法包括如下步骤：
(1)构建插入HIV-1保守基因的、可用于拯救流感病毒PR8的CRISPR-Cas9大片段敲入体系；
(2)将步骤(1)构建的体系与PR8流感病毒PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、及M蛋白编码质粒共转染293T细胞，激发起功能拯救流感病毒，获得带有HIV-15’-UTR的重组流感病毒；
(3)将步骤(2)构建的流感病毒进行扩增培养、灭活、纯化后即可制得HIV-1核酸检测质控品。
其中，步骤(1)包括如下具体步骤：
(1-1)引物序列设计与Cas9片段导入
根据HIV gag-pol基因序列设计特异性引物，对gag-pol基因进行扩增，完成扩增整合后，插入两段各带有800bp同源臂的表达Donor质粒；分别向受体293T细胞导入CRISPR/Cas9和donor序列：CRISPR/Cas9分为Cas9和sgRNA两部分，Cas9为核酸内切酶，负责切割DNA；sgRNA由scaffold和spacer两部分构成，scaffold负责结合并激活Cas9，spacer长度在20bp左右，通过设计成和目的序列互补序列后，引导Cas9靶向切割目的DNA序列；
(1-2)导入大片段效能的鉴定
待步骤(1-1)中sgRNA克隆至表达质粒并转染293T细胞72h后分选阳性细胞，抽提基因组DNA，进行T7E1检测，筛选切割效率最高的5’sgRNA-1和3’sgRNA-1用于后续质粒构建；细胞培养3-4周后，通过镜检排除非单克隆细胞，将单克隆细胞消化后取1/2裂解，抽提基因组DNA并进行测序鉴定，通过流式细胞术鉴定细胞的表达效率；
(1-3)敲入产物的蛋白鉴定
采用SDS-PAGE电泳对目标蛋白进行电泳分离；采用半干转方式进行转膜；转膜完成后封闭，选择特定一抗4℃孵育过夜；完成一抗孵育后，清洗后使用对应二抗室温孵育2小时；之后利用ECL方法进行曝光检测，Image J软件分析条带灰度，以β-Actin为内参计算相对表达量，评估目标蛋白表达量。
其中，步骤(2)包括如下具体步骤：
(2-1)突变流感病毒rPR8-NS-HIV的拯救
准备A/Puerto Rico/8/34流感病毒其他7个片段的双向表达质粒的pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-NA和pHW-M；
取20μl转染试剂lipofectamine 2000(Invitrogen)按说明书稀释到100μlOpiti-MEMⅠ中，室温放置10min，然后将稀释的混合质粒加至转染试剂中，室温结合30min；
将6孔板中己培养18～24h、80-90％汇合度、分布均匀、生长状况良好的稳定表达gag-pol的293T细胞用Opiti-MEMⅠ洗1次，在225μL DNA与脂质体的混合物中再加入775μLOPTI-MEMⅠ混匀后加入各孔，均匀覆盖于细胞上，在37℃、5％CO2培养箱中培养6h，换入含5％血清的Opiti-MEMⅠ1m1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h后准备接种鸡胚尿囊液；
转染上清经尿囊腔接种于9～11日龄SPF鸡胚中，每胚0.2m1，每个样品接种3只鸡胚，置35℃培养48-72h，收集尿囊液，用0.5％鸡红细胞进行HA血凝测定，之后，收集HA阳性的尿囊液备用；
(2-2)RT-PCR鉴定突变病毒
取100μl步骤(2-1)制备的尿囊液，用RNeasy mini kit(Qiagen)分别提取突变病毒和野生型病毒的基因组RNA，用Quititect Reverse Transcriptionkit试剂盒(Qiagen)进行反转录；
反转录体系及条件如下：取上述提取的病毒基因组RNA 10μl，加0.5μl Unit12引物(50μmol/l)，70℃变性10min，完成后立即置冰，然后依次加入下列试剂：RTbuffer 5μl，RNasin(40U/μl)1μl，l0mmol/L dNTPs 2μl，AMV反转录酶(10U/μl)1μl，加DEPC水至30μl，42℃温育60min，95℃、5min灭活逆转录酶，得到RT-PCR产物；可立即使用或置-20℃备用。
PCR反应体系：取上述RT-PCR产物5μl，加入10×PCRbuffer 5μl，10mmol/L dNTPs1μl，NS-F(50μmol/L)0.25μl，NS-R(50μmol/L)0.25μl，High Fidelity PCR Enzyme Mix酶0.5μl，加ddH2O至50μl；扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃运行10min。
其中，步骤(3)包括如下具体步骤：
(3-1)rPR8-NS-HIV病毒的灭活与纯化
突变病毒接种9～11日龄SPF鸡胚，72h后收集鸡胚尿囊液，尿囊液以6000g低速离心去除细胞碎片后，以0.1％的甲醛溶液4℃灭活7天，随后取原倍、10-1及10-2倍稀释的病毒液分组接种鸡胚尿囊腔，每组接种10个9～11日龄鸡胚，每胚接种0.2ml，置33～35℃培养72h；观察24h内死亡的鸡胚数量，每组鸡胚须至少存活80％；自存活的鸡胚中每胚取0.5ml尿囊液，按组混合后，再盲传一代，每组各接种10个胚，每胚接种0.2ml，经35℃培育72h后，取尿囊液进行血凝试验，应不出现血凝反应；
灭活的病毒经10-50％蔗糖密度梯度超速离心纯化，收集纯化后病毒，用PH7.2的PBS稀释并用300KD的超滤膜去除蔗糖，最后用0.22μm一次性滤器过滤除菌得到rPR8-NS-HIV质控品原液，置4℃冰箱备用。
进一步，步骤(3)还包括步骤(3-1)之后的如下步骤：
(3-2)rPR8-NS-HIV质控品的定值与分装
将步骤(3-1)中已纯化好的rPR8-NS-HIV原液用阴性血浆(抗HCV、抗HIV、HBsAg阴性)倍比稀释，稀释比例为1:10、1:100、1:1000；选用艾滋病病毒(HIV)核酸定量检测试剂盒检测(罗氏诊断)，以国家一级艾滋病病毒核糖核酸(HIVRNA)血清标准物质(GBW(E)090973)为溯源，通过标准PCR定量检测，确定待测标本的含量；
生物安全柜清洁消毒，紫外照射30min，用无RNase的螺口离心管在生物安全柜内分装新型HIV质控品，依据之前定值浓度用阴性血清将其稀释至106、105、104、103IU/ml，分装量为每支0.2ml，在生物安全柜内加盖螺口管盖，分装完毕后，每支样本粘贴唯一编码标签，-20℃冻存；
(3-3)rPR8-NS-HIV质控品的耐酶性实验
步骤(3-2)中分装好的rPR8-NS-HIV质控品，每种稀释度分别取两个，分两组进行实时荧光定量RT-PCR，其中一组在样品处理前加和不加终浓度为1μg/μL的RNaseA(Qiagen)，37℃温育1h，再进行样品处理、反转录和实时荧光定量PCR扩增；另一组直接进行样品处理，抽取的RNA加和不加RNase，37℃温育1h，而后进行反转录和实时荧光定量PCR扩增；在ABI7500全自动荧光定量PCR扩增分析仪上进行扩增检测，对两组中测定结果进行比较，确定rPR8-NS-HIV质控品的耐酶性；
(3-4)rPR8-NS-HIV质控品的稳定性实验
步骤(3-2)中分装好的质控品分别放于指定温度下，[2-8℃、室温(20-25℃)、37℃]。从第0周开始，每周抽取2支样本，每支样本从核酸提取开始平行做双份，用HIV RNA荧光定量PCR试剂盒检测，确定rPR8-NS-HIV质控品的稳定性；
(3-5)rPR8-NS-HIV作为阳性质控品的临床验证实验
将rPR8-NS-HIV质控品用阴性血浆稀释到104IU/ml，每管1ml，置于4℃条件下备用；然后将rPR8-NS-HIV与试剂盒所带的低浓度阳性质控品一起应用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统进行定量检测，确定rPR8-NS-HIV可作为阳性质控品用于临床检测；
(3-6)rPR8-NS-HIV质控品的线性分析结果
将rPR8-NS-HIV质控品用阴性血浆进行10倍倍比稀释，获得一系列稀释浓度：2×107，2×106，2×105，2×104，2×103IU/ml，然后用HIV核酸定量检测试剂盒检测(罗氏诊断)，每种浓度分别测定三个样品后取平均值，分析rPR8-NS-HIV在检测范围内的线性。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1、本发明中，敲入表达效率显著高于普通质粒表达系统。利用CRISPR-Cas9技术对HIV-1gag基因进行大片段敲入表达，其表达片段长度长，表达丰度稳定，持续时间长，从而有利于获取整合片段用于病毒颗粒的制备。
2、本发明模拟度高，可真实反映HIV-1检测全过程中的质量动态变化。本发明制备的人工HIV-1病毒颗粒模拟物与真实HIV-1病毒具有极为类似的结构，可高效检测HIV-1核酸检测全过程，灵敏地反映其中隐藏的问题，确保检测结果的准确可靠。
3、本发明制备简便，易于大规模生产、储存与转运。重组病毒在鸡胚中生长效率高，全程可参考国家药典总“流感灭活疫苗制备”的相关工艺流程与技术标准，一周内可获得大量高浓度病毒颗粒，从而有效降低制备生产成本，实现大批量生产；此外，由于HIV-1的保守基因RNA片段存在于流感病毒的衣壳蛋白中，可有效避免环境RNA酶对其的降解作用，稳定性有保障。据测算，此核酸片段可在室温中稳定保存6周，4℃环境保存至少12月，确保其作为质控品的高度稳定性。
4、本发明制备的质控品在出厂前遵循国家药典中的相关工艺要求对病毒颗粒进行灭活处理，杜绝一切潜在传染可能；经过甲醛灭活后的病毒颗粒经过验证证实无传染与致病力，同样对环境也无影响，安全度高，不会对实验参与人员造成危害。
附图说明
图1为本发明中导入大片段效能的鉴定结果图；
图2为本发明中敲入产物的蛋白鉴定结果图；
图3为本发明中rPR8-NS-HIV质控品的耐酶性实验结果图；
图4为本发明中rPR8-NS-HIV质控品的稳定性实验结果图；
图5为本发明中rPR8-NS-HIV质控品的线性分析结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明所解决的技术问题是提供一种以CRISPR-Cas9大片段敲入技术联合流感病毒为载体的HIV-1核酸检测用质控品及其制备方法。本发明的质控品与实际HIV-1病毒结构具有高度相似性，可极为真实地模拟HIV-1病毒颗粒，实现对HIV-1核酸检测的全方位监控；同时参考标准化的流感灭活疫苗制备流程制备质控品，具有成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产。综上，本发明具有重要的价值与应用前景。
本发明中主要涉及两个技术创新，其一利用全新的CRISPR-Cas9系统对293T细胞实现HIV-1POL蛋白编码基因的大片段敲入与表达；其二，利用8质粒反向拯救系统完成293T细胞内的流感病毒组装。其中的8质粒为：pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-NA、pHW-M、以及前述CRISPR敲入质粒混合物，套用现有8质粒拯救系统做出改良。
本发明主要使用(A/PerrtoRico/8/34)流感病毒作为基础载体，人293T细胞作为初始病毒合成平台。HIV-1敲入保守基因大片段为POL蛋白编码基因(gag-pol)(详细序列可见Genebank，序列号：155348)。
本发明提供了一种基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，所述质控品由携带HIV-1保守基因的重组流感病毒经扩增培养、灭活纯化后获得。
所述的基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法包括如下步骤：
(1)构建插入HIV-1保守基因的、可用于拯救流感病毒PR8的CRISPR-Cas9大片段敲入体系；
具体步骤为：
(1-1)引物序列设计与Cas9片段导入
根据HIV gag-pol基因序列设计特异性引物，对gag-pol基因进行扩增，引物片段如表1所示。完成扩增整合后，插入两段各带有800bp同源臂的表达Donor质粒。分别向受体293T细胞导入CRISPR/Cas9和donor序列：CRISPR/Cas9分为Cas9和sgRNA两部分，Cas9为核酸内切酶，负责切割DNA；sgRNA由scaffold和spacer两部分构成，scaffold负责结合并激活Cas9，spacer长度在20bp左右，通过设计成和目的序列互补序列后，可引导Cas9靶向切割目的DNA序列。
Figure BDA0002438490500000101
(1-2)导入大片段效能的鉴定
待前述sgRNA克隆至表达质粒并转染293T细胞72h后分选阳性细胞，抽提基因组DNA，进行T7E1检测，筛选切割效率最高的5’sgRNA-1和3’sgRNA-1用于后续质粒构建；细胞培养3-4周后，通过镜检排除非单克隆细胞，将单克隆细胞消化后取1/2裂解，抽提基因组DNA并进行测序鉴定，通过流式细胞术鉴定细胞的表达效率，结果如图1显示，阳性率99.0％以上，与目的预期一致。
(1-3)敲入产物的蛋白鉴定
采用SDS-PAGE电泳对目标蛋白进行电泳分离；采用半干转方式进行转膜；转膜完成后封闭，选择特定一抗4℃孵育过夜；完成一抗孵育后，清洗后使用对应二抗室温孵育2小时；之后利用ECL方法进行曝光检测，Image J软件分析条带灰度，以β-Actin为内参计算相对表达量，评估目标蛋白表达量。结果如图2所示，敲入后在特定分子量附近具有特异性蛋白条带，表明敲入成功，该细胞株用于后续整合流感病毒拯救。
(2)将步骤(1)构建的体系与PR8流感病毒PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、及M蛋白编码质粒共转染293T细胞，激发起功能拯救流感病毒，获得带有HIV-15’-UTR的重组流感病毒；
具体步骤为：
(2-1)突变病毒的拯救
准备A/Puerto Rico/8/34流感病毒其他7个片段的双向表达质粒的pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-NA和pHW-M。取20μl转染试剂lipofectamine 2000(Invitrogen)按说明书稀释到100μl Opiti-MEMⅠ中，室温放置10min。然后将稀释的混合质粒加至转染试剂中，室温结合30min。将6孔板中己培养约18～24h、80-90％汇合度、分布均匀、生长状况良好的前述稳定表达gag-pol的293T细胞用Opiti-MEMⅠ洗1次，在225μL DNA与脂质体的混合物中再加入775μL OPTI-MEMⅠ混匀后加入各孔，均匀覆盖于细胞上，在37℃、5％CO2培养箱中培养6h，换入含5％血清的Opiti-MEMⅠ1m1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h后准备接种鸡胚尿囊液。
转染上清经尿囊腔接种于9～11日龄SPF鸡胚中，每胚0.2m1，每个样品接种3只鸡胚，置35℃培养48-72h，收集尿囊液，用0.5％鸡红细胞进行HA血凝测定。之后，收集HA阳性的尿囊液备用。
(2-2)RT-PCR鉴定突变病毒
取100μl尿囊液，用RNeasy mini kit(Qiagen)分别提取突变病毒和野生型病毒的基因组RNA，用Quititect Reverse Transcription kit试剂盒(Qiagen)进行反转录。
反转录体系及条件如下：取上述提取的病毒基因组RNA 10μl，加0.5μl Unit12引物(50μmol/l)，70℃变性10min，完成后立即置冰。然后依次加入下列试剂：RTbuffer 5μl，RNasin(40U/μl)1μl，l0mmol/L dNTPs 2μl，AMV反转录酶(10U/μl)1μl，加DEPC水至30μl。42℃温育60min，95℃，5min灭活逆转录酶。RT-PCR产物可立即使用或置-20℃备用。
PCR反应体系：取上述RT-PCR产物5μl，加入10×PCRbuffer 5μl，10mmol/L dNTPs1μl，NS-F(50μmol/L)0.25μl，NS-R(50μmol/L)0.25μl，High Fidelity PCR Enzyme Mix酶0.5μl，加ddH2O至50μl。扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃运行10min。
(3)将步骤(2)构建的流感病毒进行扩增培养、灭活、纯化后即可制得HIV-1核酸检测质控品，具体步骤为：
(3-1)rPR8-NS-HIV病毒的灭活与纯化
突变病毒接种9～11日龄SPF鸡胚，72h后收集鸡胚尿囊液。尿囊液以6000g低速离心去除细胞碎片后，以0.1％的甲醛溶液4℃灭活7天。随后取原倍、10-1及10-2倍稀释的病毒液分组接种鸡胚尿囊腔，每组接种10个9～11日龄鸡胚，每胚接种0.2ml，置33～35℃培养72h。观察24h内死亡的鸡胚数量，每组鸡胚须至少存活80％。自存活的鸡胚中每胚取0.5ml尿囊液，按组混合后，再盲传一代，每组各接种10个胚，每胚接种0.2ml，经35℃培育72h后，取尿囊液进行血凝试验，应不出现血凝反应。灭活的病毒经10-50％蔗糖密度梯度超速离心纯化，收集纯化后病毒，用PH7.2的PBS稀释并用300KD的超滤膜去除蔗糖，最后用0.22μm一次性滤器过滤除菌得到rPR8-NS-HIV质控品原液，置4℃冰箱备用。
(3-2)rPR8-NS-HIV质控品的定值与分装
将上述已纯化好的rPR8-NS-HIV原液用阴性血浆(抗HCV、抗HIV、HBsAg阴性)倍比稀释，稀释比例为1:10、1:100、1:1000。选用艾滋病病毒(HIV)核酸定量检测试剂盒检测(罗氏诊断)，以国家一级艾滋病病毒核糖核酸(HIVRNA)血清标准物质(GBW(E)090973)为溯源，通过标准PCR定量检测，确定待测标本的含量。
生物安全柜清洁消毒，紫外照射30min。用无RNase的螺口离心管在生物安全柜内分装新型HIV质控品，依据之前定值浓度用阴性血清将其稀释至106、105、104、103IU/ml，分装量为每支0.2ml。在生物安全柜内加盖螺口管盖，分装完毕后，每支样本粘贴唯一编码标签，-20℃冻存。
(3-3)rPR8-NS-HIV质控品的耐酶性实验
取步骤(3-2)中分装好的rPR8-NS-HIV质控品，每种稀释度分别取两个，分两组进行实时荧光定量RT-PCR。其中一组在样品处理前加和不加终浓度为1μg/μL的RNaseA(Qiagen)，37℃温育1h，再进行样品处理、反转录和实时荧光定量PCR扩增。另一组直接进行样品处理，抽取的RNA加和不加RNase，37℃温育1h，而后进行反转录和实时荧光定量PCR扩增。在ABI7500全自动荧光定量PCR扩增分析仪上进行扩增检测，对两组中测定结果进行比较(图3)。结果显示rPR8-NS-HIV质控品具有耐受RNase的特性。
(3-4)rPR8-NS-HIV质控品的稳定性实验
分装好的质控品分别放于指定温度下[2-8℃、室温(20-25℃)、37℃]，从第0周开始，每周抽取2支样本，每支样本从核酸提取开始平行做双份，用HIV RNA荧光定量PCR试剂盒检测(罗氏诊断)，结果如图4所示。结果显示质控品在37℃可稳定至少14天(如图4A)，25℃可稳定至少56天(如图4B)，4℃条件下可稳定至少半年(如图4C)。
(3-5)rPR8-NS-HIV作为阳性质控品的临床验证实验
将rPR8-NS-HIV质控品用阴性血浆稀释到104IU/ml，每管1ml，置于4℃条件下备用。然后将rPR8-NS-HIV与试剂盒所带的低浓度阳性质控品一起应用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统进行定量检测。
结果显示rPR8-NS-HIV质控品CV为11.3％，而试剂盒阳性质控品的CV为10.7％，两者相近，因而rPR8-NS-HIV可作为阳性质控品用于临床检测。
(3-6)rPR8-NS-HIV质控品的线性分析结果
将rPR8-NS-HIV质控品用阴性血浆进行10倍倍比稀释，获得一系列稀释浓度：2×107，2×106，2×105，2×104，2×103IU/ml，然后用HIV核酸定量检测试剂盒检测(罗氏诊断)。每种浓度分别测定三个样品后取平均值，结果如图5所示。结果显示：经线性回归分析得y＝1.02x-0.14，R2＝0.999，说明rPR8-NS-HIV在检测范围内有很好的线性，可用于临床检测。
本发明联合利用CRISPR-Cas9技术敲入HIV-1保守大片段基因并诱导其表达，联合8质粒反向拯救系统构建以流感病毒为载体的HIV-1核酸检测质控品具有巨大的应用潜能。从结构来看，流感病毒衣壳包裹HIV-1RNA核酸高度模拟了HIV-1这个逆转录病毒的结构，较之噬菌体可更为真实的反映HIV及其在样本中的情况；其次，流感病毒的大批量整体制备流程可遵循流感疫苗的生产及其质量控制要求，相应的标准皆可参考中国药典中“流感病毒灭活疫苗”的相关内容，故以流感病毒为载体的HIV-1核酸检测质控品可以最大程度模拟真实病毒核酸检测过程，更为真实的评估检测的特异性和灵敏度，真正实现对HIV-1核酸检测的全方位监测，对于保证HIV-1RNA检测结果的准确可靠具有重要的实际应用价值。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州艾可瑞斯生物科技有限公司
<120> 一种基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法
<130> 2020-9-26
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知
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<213> 未知
<400> 6
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Claims (6)

1.一种基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，所述质控品由携带HIV-1保守基因的重组流感病毒经扩增培养、灭活纯化后获得。
2.根据权利要求1所述的基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建插入HIV-1保守基因的、可用于拯救流感病毒PR8的CRISPR-Cas9大片段敲入体系；
(2)将步骤(1)构建的体系与PR8流感病毒PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、及M蛋白编码质粒共转染293T细胞，激发起功能拯救流感病毒，获得带有HIV-15’-UTR的重组流感病毒；
(3)将步骤(2)构建的流感病毒进行扩增培养、灭活、纯化后即可制得HIV-1核酸检测质控品。
3.根据权利要求2所述的基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下具体步骤：
(1-1)引物序列设计与Cas9片段导入
根据HIV gag-pol基因序列设计特异性引物，对gag-pol基因进行扩增，完成扩增整合后，插入两段各带有800bp同源臂的表达Donor质粒；分别向受体293T细胞导入CRISPR/Cas9和donor序列：CRISPR/Cas9分为Cas9和sgRNA两部分，Cas9为核酸内切酶，负责切割DNA；sgRNA由scaffold和spacer两部分构成，scaffold负责结合并激活Cas9，spacer长度在20bp左右，通过设计成和目的序列互补序列后，引导Cas9靶向切割目的DNA序列；
(1-2)导入大片段效能的鉴定
待步骤(1-1)中sgRNA克隆至表达质粒并转染293T细胞72h后分选阳性细胞，抽提基因组DNA，进行T7E1检测，筛选切割效率最高的5’sgRNA-1和3’sgRNA-1用于后续质粒构建；细胞培养3-4周后，通过镜检排除非单克隆细胞，将单克隆细胞消化后取1/2裂解，抽提基因组DNA并进行测序鉴定，通过流式细胞术鉴定细胞的表达效率；
(1-3)敲入产物的蛋白鉴定
采用SDS-PAGE电泳对目标蛋白进行电泳分离；采用半干转方式进行转膜；转膜完成后封闭，选择特定一抗4℃孵育过夜；完成一抗孵育后，清洗后使用对应二抗室温孵育2小时；之后利用ECL方法进行曝光检测，Image J软件分析条带灰度，以β-Actin为内参计算相对表达量，评估目标蛋白表达量。
4.根据权利要求2所述的基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括如下具体步骤：
(2-1)突变流感病毒rPR8-NS-HIV的拯救
准备A/Puerto Rico/8/34流感病毒其他7个片段的双向表达质粒的pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-NA和pHW-M；
取20μl转染试剂lipofectamine 2000按说明书稀释到100μl Opiti-MEMⅠ中，室温放置10min，然后将稀释的混合质粒加至转染试剂中，室温结合30min；
将6孔板中己培养18～24h、80-90％汇合度、分布均匀、生长状况良好的稳定表达gag-pol的293T细胞用Opiti-MEMⅠ洗1次，在225μL DNA与脂质体的混合物中再加入775μL OPTI-MEMⅠ混匀后加入各孔，均匀覆盖于细胞上，在37℃、5％CO2培养箱中培养6h，换入含5％血清的Opiti-MEMⅠ1m1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h后准备接种鸡胚尿囊液；
转染上清经尿囊腔接种于9～11日龄SPF鸡胚中，每胚0.2m1，每个样品接种3只鸡胚，置35℃培养48-72h，收集尿囊液，用0.5％鸡红细胞进行HA血凝测定，之后，收集HA阳性的尿囊液备用；
(2-2)RT-PCR鉴定突变病毒
取100μl步骤(2-1)制备的尿囊液，用RNeasy mini kit分别提取突变病毒和野生型病毒的基因组RNA，用Quititect Reverse Transcription kit试剂盒进行反转录；
反转录体系及条件如下：取上述提取的病毒基因组RNA 10μl，加0.5μl Unit12引物，70℃变性10min，完成后立即置冰，然后依次加入下列试剂：RTbuffer 5μl，RNasin 1μl，l0mmol/L dNTPs 2μl，AMV反转录酶1μl，加DEPC水至30μl，42℃温育60min，95℃、5min灭活逆转录酶，得到RT-PCR产物；
PCR反应体系：取上述RT-PCR产物5μl，加入10×PCR buffer 5μl，10mmol/L dNTPs 1μl，NS-F 0.25μl，NS-R 0.25μl，High Fidelity PCR Enzyme Mix酶0.5μl，加ddH2O至50μl；扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃运行10min。
5.根据权利要求2所述的基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(3)包括如下具体步骤：
(3-1)rPR8-NS-HIV病毒的灭活与纯化
突变病毒接种9～11日龄SPF鸡胚，72h后收集鸡胚尿囊液，尿囊液以6000g低速离心去除细胞碎片后，以0.1％的甲醛溶液4℃灭活7天，随后取原倍、10-1及10-2倍稀释的病毒液分组接种鸡胚尿囊腔，每组接种10个9～11日龄鸡胚，每胚接种0.2ml，置33～35℃培养72h；观察24h内死亡的鸡胚数量，每组鸡胚须至少存活80％；自存活的鸡胚中每胚取0.5ml尿囊液，按组混合后，再盲传一代，每组各接种10个胚，每胚接种0.2ml，经35℃培育72h后，取尿囊液进行血凝试验，应不出现血凝反应；
灭活的病毒经10-50％蔗糖密度梯度超速离心纯化，收集纯化后病毒，用PH7.2的PBS稀释并用300KD的超滤膜去除蔗糖，最后用0.22μm一次性滤器过滤除菌得到rPR8-NS-HIV质控品原液，置4℃冰箱备用。
6.根据权利要求5所述的基于流感病毒载体的HIV-1核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(3)还包括步骤(3-1)之后的如下步骤：
(3-2)rPR8-NS-HIV质控品的定值与分装
将步骤(3-1)中已纯化好的rPR8-NS-HIV原液用阴性血浆倍比稀释，稀释比例为1:10、1:100、1:1000；选用艾滋病病毒核酸定量检测试剂盒检测，以国家一级艾滋病病毒核糖核酸血清标准物质为溯源，通过标准PCR定量检测，确定待测标本的含量；
生物安全柜清洁消毒，紫外照射30min，用无RNase的螺口离心管在生物安全柜内分装新型HIV质控品，依据之前定值浓度用阴性血清将其稀释至106、105、104、103IU/ml，分装量为每支0.2ml，在生物安全柜内加盖螺口管盖，分装完毕后，每支样本粘贴唯一编码标签，-20℃冻存；
(3-3)rPR8-NS-HIV质控品的耐酶性实验
步骤(3-2)中分装好的rPR8-NS-HIV质控品，每种稀释度分别取两个，分两组进行实时荧光定量RT-PCR，其中一组在样品处理前加和不加终浓度为1μg/μL的RNaseA，37℃温育1h，再进行样品处理、反转录和实时荧光定量PCR扩增；另一组直接进行样品处理，抽取的RNA加和不加RNase，37℃温育1h，而后进行反转录和实时荧光定量PCR扩增；在ABI7500全自动荧光定量PCR扩增分析仪上进行扩增检测，对两组中测定结果进行比较，确定rPR8-NS-HIV质控品的耐酶性；
(3-4)rPR8-NS-HIV质控品的稳定性实验
步骤(3-2)中分装好的质控品分别放于指定温度下，从第0周开始，每周抽取2支样本，每支样本从核酸提取开始平行做双份，用HIV RNA荧光定量PCR试剂盒检测，确定rPR8-NS-HIV质控品的稳定性；
(3-5)rPR8-NS-HIV作为阳性质控品的临床验证实验
将rPR8-NS-HIV质控品用阴性血浆稀释到104IU/ml，每管1ml，置于4℃条件下备用；然后将rPR8-NS-HIV与试剂盒所带的低浓度阳性质控品一起应用COBAS AmpliPrep/COBASTaqMan系统进行定量检测，确定rPR8-NS-HIV可作为阳性质控品用于临床检测；
(3-6)rPR8-NS-HIV质控品的线性分析结果
将rPR8-NS-HIV质控品用阴性血浆进行10倍倍比稀释，获得一系列稀释浓度：2×107，2×106，2×105，2×104，2×103IU/ml，然后用HIV核酸定量检测试剂盒检测，每种浓度分别测定三个样品后取平均值，分析rPR8-NS-HIV在检测范围内的线性。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481171A (zh) * 2021-06-21 2021-10-08 武汉大学 一种携带hiv-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用

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CN103667534A (zh) * 2013-12-12 2014-03-26 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 一种艾滋病（hiv-1）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒
CN105132583A (zh) * 2015-07-17 2015-12-09 上海市临床检验中心 一种以流感病毒为载体的hcv核酸检测用质控品及其制备方法

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CN105132583A (zh) * 2015-07-17 2015-12-09 上海市临床检验中心 一种以流感病毒为载体的hcv核酸检测用质控品及其制备方法

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