CN108588276A - D型流感病毒荧光定量pcr引物对及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种D型流感病毒荧光定量PCR引物对及试剂盒。所述引物对是根据Gen Bank上四个JQ922306、KM392476、KM392483、KX768825已公布的D型流感PB1序列，截取中间保守序列而设计。该引物对可用于制备D型流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒，从而对D型流感病毒(IDV)进行病毒含量的检测。该试剂盒包括所述试剂盒由如权利要求1所述的引物对、阳性标准质粒、TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成。用本发明的引物对制备的D型流感病毒(IDV)实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对D型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种D型流感病毒荧光定量PCR引物对及试剂盒。
背景技术
流感是流感病毒(Influenza Virus)引起的严重危害公共卫生和畜牧业发展的人畜共患传染病。以前根据核蛋白的抗原性可将流感病毒分为3类：A型、B型和C型流感病毒(IAV、IBV、ICV)。近几年来又发现了一种新型流感病毒的存在。2011年，在俄克拉荷马州，从流感疾病的猪中分离出一种属于假定新属的病毒株，尚未被官方分类所承认，并初步确定了流感病毒D(IDV)。2016年9月国际病毒分类委员会执委会批准命名了一种新病毒—D型流感病毒。IDV是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属的成员，主要侵害呼吸道。IDV是一种单链负反义RNA病毒，具有7个预测编码9种蛋白质的基因组片段，包括糖蛋白血凝素-酯酶融合(HE)，聚合酶PB2，PB1和P3，核蛋白，基质蛋白(M1和CM2)，和非结构蛋白(NS1和NEP)。D型流感是由IDV引起的接触性病毒性传染病，主要感染猪、牛等，尽管它首次从猪身上分离出来，随后流行病学、血清学和病理学研究表明，牛作为这种新发现的病毒的储库宿主，血清学调查表明，牛是血清流行率最高的物种，IDV抗体滴度最高。随后有报道从美国、中国、法国、意大利、墨西哥和日本的牛中分离出IDV毒株。实验研究证明，IDV也可以感染豚鼠和雪貂，并在其呼吸道中复制。此外，在北美小反刍动物血清中检测到特异于IDV的抗体。在人类中，尽管普遍血清学阳性率较低，但最近的一项研究显示，94～97％的接触牛的工作者具有针对IDV的特异性抗体，此项研究引发人们对可能的动物传染病的担忧。目前国内外公布的快速、准确的检测方法鲜有报道，国际常用检测方法是：血清学试验、病原分离试验、核酸序列分析等。但病毒分离与鉴定操作时间较长，限制了这些方法的推广应用。核酸序列分析需要大量的时间而延误了处理时机。国外曾有报道利用RT-PCR的探针法来检测D型流感病毒，但由于合成探针的成本过高，不利于实际生产上的应用。
发明内容
本发明旨在提供一种实时荧光定量PCR检测D型流感病毒的引物对。
本发明所采取的技术方案是：
一种D型流感病毒荧光定量PCR引物对，包括IDV-F：5′-AAGGAACTGTTACTGGACTGG-3′(SEQ ID№1)和IDV-R：5′-GCAAGCACCCGTAGGATTTTT-3′(SEQ ID№2)。所述引物对是根据Gen Bank上四个JQ922306、KM392476、KM392483、KX768825已公布的D型流感PB1序列，截取中间保守序列而设计。
本发明的引物对可用于制备D型流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒，从而对D型流感病毒(IDV)进行病毒含量的检测。该试剂盒包括所述试剂盒由如权利要求1所述的引物对、阳性标准质粒、TB GreenTMPremix Ex TaqⅡ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成；所述阳性标准质粒是由序列为SEQ ID№3所示的DNA片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒。
用本发明的引物对制备的D型流感病毒(IDV)实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对D型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。
附图说明
图1是实施例1是PCR扩增IDV基因组目的片段的电泳图；
图2是实施例5的实时荧光定量PCR标准曲线；
图3是实施例5的实时荧光定量PCR标准曲线溶解曲线；
图4是实施例6的实时荧光定量PCR特异性试验图，其中标号1为IDV阳性质粒；2为减蛋综合征病毒(EDSV)；3为新城疫病毒(NDV)；4为H5亚型禽流感病毒；5为H9亚型禽流感病毒；6为ddH2O；
图5是实施例7的实时荧光定量PCR的敏感性试验，图中标号1～7分别为6.62×106copies/μL～6.62×100copies/μL；8为阴性对照。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1，IDV基因组目的片段常规PCR扩增。
把4μg人工合成的模板质粒干粉溶于80μL H2O中，PCR反应体系为：Primix ExTaqTM酶12.5μL，上、下游引物各1μL(10μmol/L)，DNA模板(模板质粒)2μL，加灭菌三蒸水至总体积25μL。上述各组分混匀瞬时离心后，在温度梯度PCR仪上执行以下程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；进行34个循环，最后72℃延伸10min。取6μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
实施例2，阳性IDV质粒的制备。
PCR目的产物电泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0按照说明书进行胶回收。使用TaKaRa公司pMD18-T载体连接试剂盒，反应体系总体积为5μL如下：PCR纯化产物2.25μL，Ligation Solution I 2.5μL，pMD18-T Vector 0.25μL，冰上操作，16℃作用4h。重组质粒的转化、菌落PCR鉴定、序列分析，并根据TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0对阳性菌液进行少量提取和纯化后，于-20℃保存备用。
实施例3，实时荧光定量PCR反应条件优化。
3.1退火温度的优化：以阳性质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，筛选最佳退火温度，设置温度梯度7个，54.0℃，54.3℃，55.0℃，56.0℃，57.2℃，58.2℃，58.7℃。反应体系为25μL，反应程序为如表1所示：
表1反应程序
以任一拷贝数的阳性质粒，采用7个不同退火温度梯度进行实时荧光定量PCR检测，结果显示退火温度55℃时最佳。
3.2引物浓度的优化：按照上述确定的最佳退火温度，以阳性质粒为模板进行实时荧光定量PCR扩增，设置引物终浓度梯度5个，1pmol/μL，0.8pmol/μL，0.6pmol/μL，0.4pmol/μL，0.2pmol/μL，确定其最佳的引物浓度。以任一拷贝数的阳性质粒，以最佳退火温度55℃，设定5个上、下游引物终浓度梯度，结果显示上、下游引物终浓度最佳为0.6pmol/μL。
实施例4，重组质粒拷贝数计算以及标准品的制备。
少量提取质粒经纯化后，利用核酸蛋白测定仪(Eppendorf BioPhotometer D30)测出质粒浓度，再根据基因拷贝数(copies)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)x10-9÷[片段大小(bp)x660]，计算目的基因拷贝数，再对阳性重组质粒进行10倍梯度稀释，作为实时荧光定量PCR的标准品。测得提取的重组质粒浓度为20.7ng/μL，大小为2853bp，拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(片段大小(bp)x660)，经计算，目的基因的拷贝数为6.62×109copies/μL。
实施例5，实时荧光定量PCR反应及标准曲线和回归方程的建立。
将经过10倍梯度稀释的阳性质粒作为实时荧光定量PCR的模板，按照1.6中确定的最佳反应条件进行实时荧光定量PCR扩增，绘制TB GreenTMPremix Ex TaqⅡ实时荧光定量PCR方法的标准曲线。采用优化出的最佳退火温度和最佳引物浓度，建立25μL反应体系，将阳性重组质粒经10倍倍比稀释，取6.62×108、6.62×107、6.62×106、6.62×105、6.62×104、6.62×103，6个浓度作为标准品进行实时荧光定量PCR反应，并绘制标准曲线，Y＝-3.337X+37.163；相关系数R2＝1.000；扩增效率E＝99.4％。结果显示，不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系。其中X轴为质粒标准品拷贝数的对数值，Y轴为循环阈值，结果如图2所示。
质粒标准品均出现单一窄而尖的单峰，而阴性对照没有出现熔点峰，溶解温度Tm均为81.0℃，如图3所示，表明TB GreenⅡ实时荧光定量PCR反应为特异性扩增。
实施例6，特异性试验。
采用建立的实时荧光定量PCR方法对减蛋综合征病毒(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒的cDNA进行扩增，验证该方法的特异性，同时设立双蒸水作阴性对照。用建立的TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法对IDV阳性质粒、减蛋综合征病毒(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒的cDNA进行进行实时荧光定量PCR，结果表明此次设计的引物只能特异性扩增IDV，其他样品和阴性对照均无特异性扩增(见图4)，说明说明所建立的TB GreenⅡ实时荧光定量PCR方法具有很好的特异性。
实施例7，敏感性试验。
将制备的阳性质粒标准品按10倍梯度稀释后，选取6个连续的稀释梯度进行实时荧光定量PCR扩增，以此来测定实时荧光定量PCR所能检测出来的阳性质粒的最低拷贝数。检测样品在实时荧光定量PCR 35个循环内的Ct值＞0，则结果判定为阳性。用建立的方法对6.62×106copies/μL～6.62×100copies/μL进行检测。结果表明该检测方法最低可以检出6.62×100copies/μL的标准品(见图5)，而普通PCR的检测极限为6.62×103copies/μL，实时荧光定量PCR检测的灵敏度是普通PCR的1000倍。
实施例8，重复性试验结果。
选取质粒浓度为6.62×108copies/μL～6.62×103copies/μL的标准品分别做3个批内重复和批间重复，实时荧光定量PCR方法优化的最佳反应条件进行扩增，批内重复变异系数均小于1.0％，批间重复变异系数均小于1.2％(见表2)，结果表明该实时荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。
表2实时荧光定量PCR重复性试验
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> D型流感病毒荧光定量PCR引物对及试剂盒
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
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gtcatgacat taaattacag ggaggaagca ttggccagaa ggaactgtta ctggactggg 240
ctacaaagtt cagatgattt tgtgctcttt tgcatctcta ggacttggcc agagatggag 300
atgactattc taaaattcat cgctgtttgc aagttgatgg gaataaacat gtctttggaa 360
aaatcctacg ggtgcttgcc tgaacttttt gagttcacaa gcatgttctt ttccggggat 420
tttgtctcaa acatagcctt ggagttacct gctttcacaa cagctggaat gaatgaagga 480
accgacttca cagctgcgat gtctgtcata agaacaaaca tgat 524
Claims (2)
1.一种D型流感病毒荧光定量PCR引物对，其特征在于，包括SEQ ID № 1所示的IDV-F和SEQ ID № 2所示的IDV-R。
2.一种D型流感病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括所述试剂盒由如权利要求1所述的引物对、阳性标准质粒、TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成；所述阳性标准质粒是由序列为SEQ ID № 3所示的DNA片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒。
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