CN110964858B - Pcr检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Pcr检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法，本发明的一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒，包括引物和标准品，所述的引物为上游引物与下游引物。所述的上游引物具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列；所述的下游引物具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列；上游引物设计于禽腺病毒基因组ITR基因序列10bp～50bp区间，下游引物设计于ORF0基因序列546bp～606bp区间。本发明操作便捷，适合于检测大量样本，可以快速，高度灵敏、特异、快速检测的禽腺病毒血清4型。为禽腺病毒血清4型爆发时的快速、准确地诊断大批临床样品，并尽快地控制本病提供了技术手段。

Description

PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法。
背景技术
鸡的包涵体肝炎和心包积液综合征均是由禽腺病毒属病毒引起的急性传染病，1963年美国首次在肉鸡中首次发现包涵体肝炎，1987年巴基斯坦在肉鸡中首次发现心包积液综合征，该病以心包积液，肝脏肿大、发黄、出血、脂肪沉积和肾脏尿酸盐沉积萎主要特征，因此也被称为心包积液-肝炎综合征。1976年和1999年我国已有包涵体肝炎和心包积液综合征相关报道，2012年心包积液综合征在我国开始流行，给养鸡业造成重大经济损失。
禽腺病毒属于腺病毒科、禽腺病毒属，病毒粒子呈球形，无囊膜，直径为80～100nm呈二十面体对称，基因组为双链DNA。感染鸡的禽腺病毒主要是血清1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型，共12类不同血清型。流行病学调查显示，在我国流行的禽腺病毒血清型包括1、2、3、4、8a、8b、11型，而禽腺病毒中以血清4型致病性最为严重，是心包积水综合征最常见的病原。该病主要在亚洲和美洲报道较多，以肉鸡多发，死亡率在20％～80％，给养禽业造成巨大经济损失。
目前禽腺病毒的血清4型鉴定中通常采用方法有：血清交叉中和试验、序列比对分析、限制性内切酶鉴定。
(1)血清交叉中和试验
该方法需要将腺病毒毒株稀释至200TCID50与不同血清型禽腺病毒标准阳性血清进行中和试验检测，比较不同血清型的阳性血清对毒株的中和效价，当中和效价相差16倍或者与其他阳性血清不发生中和作用，确定血清型；当中和效价相差8或16倍，以血凝抑制试验与其他血清型没有交叉反应，或与其他血清型存在理化性质及系统发生的显著差别时，也可确定为新的血清型。该方法是血清型鉴定的标准操作方法，也是被业内所认同，但是该方法也存在以下缺点：标准血清获取困难、操作技术要求高、检测周期长。
(2)序列比对分析
该方法以禽腺病毒的保守基因(Hexon、penton、fiber)为靶基因，设计相关引物扩增测序获得基因序列，通过与标准毒株序列进行比对，依据检测基因与标准毒株基因相似性确定血清型。该方法中由于腺病毒保守基因同源性高，设计引物特异性差，除目的血清型腺病毒，仍可扩增出其他血清型禽腺病毒。该方法与交叉中和试验相比，仍具有快速、廉价、操作简便等特征，但是存在检测周期长、特异性差等缺点。
(3)限制性内切酶鉴定
该方法通过不同限制性内切酶对禽腺病毒基因组或者PCR扩增保守基因进行酶切，分析比较检测毒株与标准毒株的酶切图谱，以确定检测毒株的血清型，该方法具有快速、廉价等优点，但是存在标准毒株基因组获取困难、检测周期长、敏感性差等缺点。
目前，缺少一种高灵敏度的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法。
发明内容
本发明目的是提供一种高灵敏度的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法。
本发明的技术方案如下：本发明的一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒，其特征在于：所述的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒包括引物和标准品，所述的引物为上游引物和下游引物，
所述的上游引物具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列；
所述的下游引物具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列；
上游引物设计于禽腺病毒基因组ITR基因序列10bp～50bp区间，下游引物设计于ORF0基因序列546bp～606bp区间。
进一步地，所述试剂盒包括：上游引物、下游引物、2×Taq Mix、标准品和PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
进一步地，所述标准品为禽腺病毒血清4型核酸DNA。
更进一步地，所述标准品DNA模板的浓度为3.5×103ng/μl。
本发明的一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒的PCR扩增体系，所述PCR扩增对象包括检测样品DNA、标准品和PCR阴性对照，所述PCR扩增检测体系包括25.0μl扩增体系，其各种成分及终浓度分别为：2×Taq Mix 12.5μl，上游引物终浓度0.5μmol/L，下游引物终浓度0.5μmol/L，检测样品DNA、标准品或PCR阴性对照2μl，DNA-RNA Free H2O加至25μl。
本发明的一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒的检测方法，在使用所述的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒时，其PCR扩增设置反应条件包括：
预变性：94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃35s，72℃35s，35个循环；72℃5min，扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳检测结果。
有益效果：本发明操作便捷，适合于检测大量样本，可以快速、高度灵敏、特异、快速检测的禽腺病毒血清4型。为禽腺病毒血清4型爆发时的快速、准确地诊断大批临床样品，并尽快地控制本病提供了技术手段。本发明具有如下优点：
(1)操作简便，结果直观。扩增的目的片段位于禽腺病毒基因组的ITR与ORF0区域，不同血清型禽腺病毒在该区域核苷酸序列差异较大，本发明方法仅能特异性扩增禽腺病毒血清4型的目的片段，与现有PCR检测方法相比，无需进行序列测定，即可直接判断结果。
(2)特异性良好。仅能够特异性检测出禽腺病毒血清4型，对禽腺病毒其他血清型、鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型、鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽传染性贫血病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡网状内皮增生病毒、减蛋综合征病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的检测结果均为阴性，表明该引物具有较好的特异性。
(3)灵敏度高。检测禽腺病毒血清4型的特异性引物对禽腺病毒血清4型最小检出量为3.5×10-4ng/μl，表明敏感性良好，灵敏度高。
附图说明
图1为本发明PCR的上游引物设计区域示意图；
图2为本发明PCR的下游引物设计区域示意图；
图3为本发明中特异性试验示意图；图3坐标中标号：M为DL2000Marker；+为标准品；1为禽腺病毒TJ株(血清4型)；2为禽腺病毒血清1型；3为禽腺病毒血清2型；4为禽腺病毒血清3型；5为禽腺病毒血清4型；6为禽腺病毒血清8a型；7为禽腺病毒血清8b型；8为禽腺病毒血清11型株；9为鸡新城疫病毒；10为禽流感病毒H9亚型株；11为鸡传染性支气管炎病毒；12为禽白血病病毒；13为禽传染性贫血病病毒；14为鸡传染性法氏囊病病毒；15为鸡网状内皮增生病毒；16为减蛋综合征病毒；17为鸡传染性喉气管炎病毒；－为阴性对照；图3坐标中标号：a：2000bp；b：1000bp；c：750bp；d：500bp；e：250bp；f：100bp。
图4为本发明中敏感性试验示意图；图4坐标中标号：M为DL2000Marker；1为原倍；2为101倍稀释；3为102倍稀释，4为103倍稀释；5为104倍稀释；6为105倍稀释；7为106倍稀释；8为107倍稀释；9为108倍稀释；10为109倍稀释；11为1010倍稀释；12为1011倍稀释；－为阴性对照；图4坐标中标号：a：2000bp；b：1000bp；c：750bp；d：500bp；e：250bp；f：100bp。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1
用于禽腺病毒血清4型PCR检测的引物和检测方法的建立
1、引物设计
根据禽腺病毒血清1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型基因组序列分析，选择非结构蛋白ITR与结构蛋白ORF0基因序列设计合成如下引物：
SEQ ID NO.1上游引物:5’-ATATAACCGCGTCTTTTGA-3’
SEQ ID NO.2下游引物:5’-GCGATATCGGCGTTTTC-3’
上游引物设计于禽腺病毒血清4型基因组ITR基因序列10bp～50bp区间，下游引物设计于ORF0基因序列546bp～606bp区间。如图1、图2所示。所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，预计扩增禽腺病毒血清4型536bp的片段。
现有的禽腺病毒血清型分型引物设计均基于结构蛋白的保守基因(Hexon、penton、fiber基因)，通过测序比对确定血清型；发明人打破常规，多次试验发现，腺病毒基因组非结构蛋白ITR与结构蛋白ORF0区间存在极窄的特异区间，可用于设计引物PCR方法区分禽腺病毒血清4型与其他血清型。
2、提取总DNA
采取病死鸡肝脏组织，称重后，置于研钵，加入液氮5ml，将病料研磨完全，按照1:2(M/V)加入PBS缓冲液，将匀浆好的病料反复冻融3次后，10000rpm，离心15min，取上清液200μl于离心管。
采用病毒DNA提取试剂盒提取DNA(全式金生物公司，中国北京)，具体操作如下：取上述样品加入20μl Proteinase K，200μlBB5，涡旋混合15s，置于56℃孵育15min，加入250μl无水乙醇，涡旋混合15s，室温放置5min，将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000g离心1min，弃去滤液，加入500μl WB5，12000g离心1min，弃去滤液，并重复清洗1次，12000g离心1min，去除残留的乙醇。将离心柱转入新的离心管，向离心柱加入35μlH2O，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱DNA。
3、PCR反应
PCR扩增检测体系25.0μl，其各种成分及终浓度分别为：抽提DNA 2μl，2×Taq Mix12.5μl，上游引物终浓度0.5μmol/L，下游引物终浓度0.5μmol/L，DNA-RNA Free H2O加至25μl；上述反应体系经，预变性：94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃35s，72℃35s，35个循环；72℃5min的程序进行PCR扩增，同时设置标准品与PCR阴性对照。
扩增产物检测：扩增产物4μl，通过1％琼脂糖凝胶电泳，加入Goldenview，凝胶成像系统下观察结果。
4、产物测序
将扩增产物克隆至T载体，送测序公司测序。测序结果显示，扩增片段为536bp，其序列如SEQ ID NO.3所示，经BLAST分析显示，该序列为禽腺病毒血清4型ITR与ORF0片段序列。
实施例2
试剂盒的特异性鉴定
取禽腺病毒TJ株(血清4型)和禽腺病毒血清1、2、3、4、8a、8b、11型，鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型、鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽传染性贫血病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡网状内皮增生病毒、减蛋综合征病毒、鸡传染性喉气管炎病毒，提取总DNA，进行PCR扩增。特异性检验病毒来源的如表1所示：
表1
Figure BDA0002346172680000061
Figure BDA0002346172680000071
Figure BDA0002346172680000081
结果如图3所示，禽腺病毒TJ株、中国兽医药品监察所禽腺病毒血清4型和标准品均扩增到与预期大小相同的DNA片段；而其它血清型禽腺病毒(1、2、3、8a、8b、11血清型)、鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型、鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽传染性贫血病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡网状内皮增生病毒、减蛋综合征病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均未扩增到DNA片段，说明试剂盒特异性高。
本发明实施例中将检测试剂盒应用于国内可分离到的禽腺病毒血清1、2、3、4、8a、8b、11型，实际该检测试剂盒可应用于禽腺病毒的全部12个血清型。
实施例3
试剂盒敏感性
禽腺病毒TJ株(血清4型)提取总DNA作为标准品，采用核酸测定试剂盒确定核酸浓度为3.5×103ng/μl，进行PCR敏感性实验，将其进行10倍系列稀释后进行PCR扩增。
结果如图4所示，模板稀释至3.5×10-4ng/μl，仍然可以检测到目的片段。因此，本发明建立的禽腺病毒血清4型检测试剂盒可以检测到3.5×10-4ng/μl禽腺病毒DNA，表明敏感性高。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 瑞普（保定）生物药业有限公司
<120> PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(上游引物)
<400> 1
atataaccgc gtcttttga 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(下游引物)
<400> 2
gcgatatcgg cgttttc 17
<210> 3
<211> 536
<212> DNA
<213> 人工序列(扩增片段序列)
<400> 3
atataaccgc gtcttttgac acacttacaa ccgccgcgcg cagcgcggct gagtcattgc 60
atgaatttcc gggtttgcgc actagggttc tgaactttga tctcatgacg ccagtttcgc 120
tttcgcgtgt agttcgaaac tggcaacgcc tgggcaaagt cctaacgtga tgtgtaattt 180
aagtgttttt cccggtacat cccatatcct tgaaatgttt accgttcgtt gcaagtttga 240
aggtcatgtt ttattcgctt gtttgtgtta aatatttacg tttcagtgta cttcggtcag 300
taattgtact aattgcgggt caagtgacag ccttaatagc accacgagtt tagatatcga 360
tcagatacca ttacccgttg tcacgaaagg tatttttcca ctccgtttaa gggacggtcc 420
tcacgatata agtactggcg agtccgtcct ttcgttacag atcttcctat gagctatagg 480
agaactgttc ctcttactcg ctgtgcattg cttgacgctg aaaacgccga tatcgc 536

Claims (4)

1.一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒，其特征在于：所述的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒包括引物和标准品，所述的引物为上游引物和下游引物，
所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
上游引物设计于禽腺病毒基因组ITR基因序列10bp～50bp区间，下游引物设计于ORF0基因序列546bp～606bp区间；
所述标准品为禽腺病毒血清4型核酸DNA。
2.根据权利要求1所述PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：权利要求1所述上游引物、下游引物、2×Taq Mix、标准品和PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
3.根据权利要求2所述PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒，其特征在于：所述标准品DNA模板的浓度为3 .5×103 ng/μl。
4.用于权利要求1-3任一项所述的一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒的PCR扩增体系，其特征在于：所述PCR扩增对象包括检测样品DNA、标准品和PCR阴性对照，所述PCR扩增检测体系包括25 .0μl扩增体系，其各种成分及终浓度分别为：2×Taq Mix 12.5μl，上游引物终浓度0 .5μmol/L，下游引物终浓度0 .5μmol/L，检测样品DNA、标准品或PCR阴性对照2μl，DNA-RNA Free H2O加至25μl。
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