CN111254225A - 一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法，属于PCR技术领域。本发明提供的鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，包括引物、EasyTaq PCR SuperMix、阴性对照液和阳性对照液；其中，所述引物包括针鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。本发明所述的鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法，可以同时快速、高效、准确的检测鳜鱼蛙病毒和弹状病毒，省时省力，为染病的鳜鱼争取更多的治疗时间，对于后续研究及防控具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法，属于PCR技术领域。
背景技术
鳜鱼为近年来水产养殖户们青睐的品种，其肉质鲜美，营养价值高，格外受群众欢迎。然而，鳜鱼蛙病毒(Siniperca chuatsi ranairidovirus，SCRIV)和鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)是近年来引起鳜鱼发病的主要病毒性病原，是对鳜鱼养殖业危害极大的两种病毒，一旦感染发病，鳜鱼存活率极低，且没有有效的治疗方法，给养殖户们带来极大的经济损失。
当前，在实验室检测SCRIV和SCRV病毒最常见的方法为聚合酶链式反应检测法。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)又被称为无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。聚合酶链式反应像是一种生物体外的特殊DNA复制，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高等特点。近年来的流行病学研究中发现存在SCRIV和SCRV混合的感染的现象，目前，实验室检测主要为分别进行SCRIV和SCRV PCR检测，需要进行两次PCR对不同的病毒进行检测，该方法费时费力。
鳜鱼虹彩病毒和鳜鱼弹状病毒等病毒性疾病的高发，限制着鳜鱼养殖产业的发展，这两种病毒引起的疾病一旦发病一般没有有效的治疗方法，致死率高，而且鳜鱼更是常发生多种病毒混合感染的情况，给养殖中疾病的防控加大了难度，因此快速有效地诊断病原尤为关键，且尽早检出这两种病毒具有重要的现实意义。
发明内容
目前，鳜鱼蛙病毒(SCRIV)及弹状病毒(SCRV)的防治方面没有特效药物，因此SCRIV和SCRV的早期监测和诊断显得尤为重要，然而常规的PCR检测方法单次只能检测一个病毒，需要大量的时间，操作也相当复杂，拖延了检测进度，进而错过最佳治疗时间。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供同时快速、准确、高效的检测鳜鱼蛙病毒(SCRIV)及弹状病毒(SCRV)双重PCR检测试剂盒及检测方法。
本发明所述的鳜鱼蛙病毒(SCRIV)及弹状病毒(SCRV)双重PCR检测试剂盒及检测方法一旦建立成功，一次PCR的时间下能检测两种病毒，省时省力，争取更多的治疗时间，对于后续研究及防控具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，包括引物、EasyTaq PCR SuperMix、阴性对照液和阳性对照液；其中，所述引物包括针鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。
作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述针鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物为SCRIV-400-F/SCRIV-400-R；所述针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物分别为SCRV-280-F/SCRV-280-R；其中，所述引物序列如下所示：
SCRIV-400-F：AGTACACCATGCCAGAGGCCAAGC；SEQ ID NO：1；
SCRIV-400-R：CCATGTCCCTGACTGAGCTGCTC；SEQ ID NO：2；
SCRV-280-F：GTGGCAGCAATTGACATGTTCTTC；SEQ ID NO：3；
SCRV-280-R：GATACTTTGGACAATCCCATGTC；SEQ ID NO：4。
作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述EasyTaq PCR SuperMix为2×EasyTaq PCR SuperMix，所述阴性对照液为无菌ddH2O，所述阳性对照液为a和b；
a：提取鳜鱼蛙病毒的DNA为模板，以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRIV作为阳性对照；
b：以鳜鱼弹状病毒的cDNA为模板(提取鳜鱼弹状病毒的总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板)，以SCRV-N-F/SCRV-N-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRV作为阳性对照；
其中，所述SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R和SCRV-N-F/SCRV-N-R引物序列如下所示：
SCRIV-MCP-F：ATGTCTTCTGTTACGGGTTCTGGC；SEQ ID NO：5；
SCRIV-MCP-R：TTACAGGATGGGGAAACCCATG；SEQ ID NO：6；
SCRV-N-F：ATGGAAAACCAAATCATCAAGAG；SEQ ID NO：7；
SCRV-N-R：TCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC；SEQ ID NO：8。
作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL、引物SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R各1μL或SCRV-N-F/SCRV-N-R各1μL、鳜鱼蛙病毒的DNA模板或鳜鱼弹状病毒的cDNA模板1μL、无菌ddH2O补充至25μL；
作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃终延伸10min。
作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接中，所述回收纯化的扩增产物的体积为4μL，所述pEASY-T1载体的体积为1μL；即将4μL回收纯化的扩增产物与1μL pEASY-T1载体连接。
另外，本发明还提供采用所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒及弹状病毒的双重PCR方法，包括如下步骤：
(1)待测样品DNA的提取；
(2)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2ml PCR反应管内分别加入2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL，SCRIV-400-F/SCRIV-400-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R混合的引物用量为1～6μL，P-SCRIV和P-SCRV混合的模板1μL，用无菌ddH2O补充至25μL；同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心进行PCR反应；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃～66℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min；
(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的预期大小；
(4)结果与判定：查看PCR产物是否能同时扩出鳜鱼蛙病毒400bp的MCP基因保守区和鳜鱼弹状病毒280bp的N基因保守区的片段。
优选地，采用所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒及弹状病毒的双重PCR方法，步骤(2)中，所述SCRIV-400-F/SCRIV-400-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R混合的引物用量组成：上游引物与下游引物的用量相同，当SCRIV-400-F/SCRIV-400-R的用量分别各为0.5μL、0.5μL、0.5μL、1μL、1μL、1μL、1.5μL、1.5μL或1.5μL时，对应的SCRV-280-F/SCRV-280-R的用量分别各为0.5μL、1μL、1.5μL、0.5μL、1μL、1.5μL、0.5μL、1μL或1.5μL；所述退火的温度为57℃、58℃、59℃或66℃。
优选地，所述RANA-400-F/RANA-400-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R混合的引物用量组成：当所述RANA-400-F/RANA-400-R的用量分别各为1μL，所述SCRV-280-F/SCRV-280-R的用量分别各为0.5μL；所述退火的温度为58℃。
双重PCR是在同一反应体系中加入2对引物，同时扩增出2条目的条带的技术。退火温度为58℃，当SCRIV-400-F/SCRIV-400-R的用量分别各为0.5μL，SCRV-280-F/SCRV-280-R的用量分别各为1μL(上游引物与下游引物的用量相同)，双重PCR反应体系扩增目的条带最准确，不扩增出其他病毒DNA模板，证明本发明所述的鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法特异性强，能作出准确的病毒区分和诊断。
优选地，采用本发明所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒及弹状病毒的双重PCR方法检测鳜鱼蛙病毒DNA及弹状病毒DNA的检测下限都为0.001ng/μL。说明了本发明所述的鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法敏感性较高，目前临床采集到的SCRIV或SCRV样品其DNA含量一般都在0.001ng/μL之上，因此本发明所述的试剂盒和检测方法可以直接应用于普遍临床样品的检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的鳜鱼蛙病毒(SCRIV)及弹状病毒(SCRV)双重PCR检测试剂盒及检测方法，可以同时快速、高效、准确的检测鳜鱼蛙病毒和弹状病毒，省时省力，为染病的鳜鱼争取更多的治疗时间，对于后续研究及防控具有重要意义；
(2)采用本发明所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒DNA及弹状病毒DNA的检测下限都为0.001ng/μL，说明了本发明所述的鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法敏感性较高，因此本发明所述的试剂盒和检测方法可以直接应用于普遍临床样品的检测。
附图说明
图1为SCRIV MCP基因PCR扩增的试验电泳图谱；其中，M.DNA Marker DL2000；1.MCP基因扩增产物(引物为SCRIV-MCP1300 F/SCRIV-MCP1300 R)；2.阴性对照组。
图2为SCRV N基因PCR扩增的试验电泳图谱；其中，M.DNA Marker DL2000；1.N基因扩增产物(引物为SCRV-N-F/SCRV-N-R)；2.阴性对照组。
图3为PCR引物特异性实验的电泳图谱；其中，M.DNA Marker；1.引物SCRV-280--F/SCRV-280-R单一PCR扩增N基因保守区；2.引物SCRIV-400-F/SCRIV-400-R单一PCR扩增MCP基因保守区；3.引物SCRV-280--F/SCRV-280-R+SCRIV-400-F/SCRIV-400-R双重PCR扩增N和MCP基因的保守区；4.阴性对照。
图4为SCRV和SCRIV双重PCR检测法退火温度的优化的试验电泳图谱；其中，M.DNAMarker DL2000；1-10.分别为退火温度57-66℃的PCR产物；11.阴性对照组。
图5为SCRIV和SCRV双重PCR检测法引物用量的优化的试验电泳图谱；其中，M.DNAMarker DL2000；1～9(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R&SCRV-280-F/SCRV-280-R)引物用量分别为0.5/0.5，0.5/1，0.5/1.5，1/0.5，1/1，1/1.5，1.5/0.5，1.5/1，1.5/1.5μL；10.阴性对照组。
图6为SCRIV和SCRV双重PCR检测法的敏感性试验电泳图谱；其中，M.DNA MarkerDL2000；1～9.分别为10-1至10-8倍稀释的SCRV+SCRIV扩增产物；10.阴性对照组。
图7为SCRIV和SCRV双重PCR检测法的特异性试验电泳图谱；其中，M.DNA MarkerDL2000；1.IPNV；2.GCRV；3.KHV；4.SGIV；5.NNV；6.ISKNV；7.TiLV；8.SVCV；9.SCRIV；10.SCRV；11.SCRIV+SCRV为模板的阳性对照；12.阴性对照组。
图8为SCRV和SCRIV疑似临床样品的单一SCRV PCR检测的电泳图谱；其中，M.DNAMarker DL2000；1～21.分别对应1～21号临床样品；22.阳性对照；23.阴性对照组。
图9为SCRV和SCRIV疑似临床样品的单一SCRIV PCR检测的电泳图谱；其中，M.DNAMarker DL2000；1～21.分别对应1～21号临床样品；22.阳性对照；23.阴性对照组。
图10为SCRV和SCRIV疑似临床样品的双重PCR检测的电泳图谱；其中，M.DNAMarker DL2000；1～21.分别对应1～21号临床样品；22.阳性对照；23.阴性对照组。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明以下实施例所述的病原与细胞、试剂与器材、引物如下所示：
1.实验用的病原与细胞
鳜鱼蛙病毒(SCRIV)、鳜弹状病毒(SCRV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、神经坏死病毒(NNV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)，均由中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室保存及提供。
2.试剂与器材
TaKaRa DNA Marker，购于宝生物工程(大连)有限公司；Ipure快速质粒小提试剂盒，购于广州艾基生物技术有限公司；pEASY-T1 Cloning Kit、大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞、2×EasyTaq PCR SuperMix，购于北京全式金生物技术有限公司。PCR仪(晶格，中国)，核酸电泳仪(北京六一，中国)，凝胶成像系统VerSa Doc2000(Bio-Rad，美国)，微量分光光度计(南京五义，中国)。
3.引物
根据GenBank中SCRIV MCP基因(GenBank登陆号：MG941005.1)和SCRV N基因的(GenBank登录号：NC008514.1)，针对SCRIV的MCP基因及其保守区分别设计引物：SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R和SCRIV-400-F/SCRIV-400-R；针对SCRV的N基因及其保守区分别设计引物：SCRV-N-F/SCRV-N-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R；各个引物由广州艾基生物科技有限公司合成，引物信息如表1。
表1引物信息
实施例1
本实施例为构建标准重组质粒P-SCRIV和P-SCRV作为本发明所述试剂盒的阳性对照液。
试验方法：
1、以感染SCRIV临床样品的DNA为模板，以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物进行PCR扩增。该PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL，引物SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R各1μL，模板1μL，用无菌ddH2O补充至25μL。同时以ddH2O代替模板作阴性对照。该PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min30 s，共30个循环；72℃终延伸10min。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物纯化后取4μL与1μL的pEASY-T1载体连接，并转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，培养后提取质粒后进行PCR鉴定，同时将质粒送去广州艾基生物科技有限公司测序，构建标准重组质粒(P-SCRIV)。
2、以感染SCRV临床样品的cDNA为模板(提取鳜鱼弹状病毒的总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板)，以SCRV-N-F/SCRV-N-R为引物进行PCR扩增。该PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL,引物SCRV-N-F/SCRV-N-R各1μL，模板1μL，用ddH2O补充至25μL，同时以ddH2O代替模板作阴性对照。反应参数为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min30s，共30个循环；72℃终延伸10min，反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物纯化后提取4μL与1μL的pEASY-T1载体进行连接，并转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，培养后提取质粒后进行PCR鉴定，同时将质粒送去广州艾基生物科技有限公司测序，构建标准重组质粒(P-SCRV)。
上述构建的标准重组质粒P-SCRIV和P-SCRV分别用超微量分光光度计在260nm和280nm测定质粒的浓度，并统一稀释到10ng/μL，存放于-20℃备用；上述SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R、SCRV-N-F/SCRV-N-R引物序列如表1所示。
试验结果：
1、以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物扩增SCRIV的MCP基因，片段大小约1392bp(图1)，将此片段与T1载体连接，PCR鉴定和测序公司测序，证实该片段与预期相符，证明已成功构建标准重组质粒P-SCRIV。
2、以SCRV-N-F/SCRV-N-R扩增SCRV的N基因，片段大小约1290bp左右(图2)，经过PCR鉴定和测序公司测序，证实该片段与预期相符，证明已成功构建标准重组质粒P-SCRV。
实施例2
本实施例为本发明所述的一种鳜鱼蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)双重PCR检测试剂盒及建立SCRIV和SCRV的双重PCR检测方法
1.一种鳜鱼蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)双重PCR检测试剂盒，包括各引物分别加1μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL、阳性对照液2μL、阴性对照液补足至25μL；其中，所述引物包括针鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物SCRIV-400-F/SCRIV-400-R，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物SCRV-280-F/SCRV-280-R，其引物序列如表1所示；所述阳性对照液为实施例1构建标准重组质粒的混合物P-SCRIV 1μL+P-SCRV 1μL，所述阴性对照液为无菌ddH2O。
2.建立鳜鱼蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的双重PCR检测方法
试验方法：分别进行单一PCR扩增和双重PCR扩增来验证引物的特异性
对SCRIV的DNA进行单一PCR扩增：PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCRSuperMix 12.5μL，引物SCRIV-400-F/SCRIV-400-R各1μL，模板P-SCRIV 1μL，用ddH2O补充至25μL。
对SCRV的DNA进行单一PCR扩增：PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCRSuperMix 12.5μL，引物SCRV-280-F/SCRV-280-R各1μL，模板P-SCRV 1μL，用ddH2O补充至25μL。
采用本实施例的试剂盒对SCRIV和SCRV的进行双重PCR检测，包括如下步骤：
(1)待测样品DNA的提取；
(2)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×EasyTaq PCRSuperMix 12.5μL、SCRIV-400-F/SCRIV-400-R+SCRV-280-F/SCRV-280-R各1μL、模板P-SCRIV 1μL+P-SCRV 1μL、用ddH2O补充至25μL；同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心进行PCR反应；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min；
(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的预期大小；
(4)结果与判定：查看PCR产物是否能同时扩出鳜鱼蛙病毒400bp的MCP基因保守区和鳜鱼弹状病毒280bp的N基因保守区的片段。
试验结果：
结果如图3所示，单一PCR时，能扩出SCRIV MCP基因保守区约400bp的片段和SCRVN基因保守区约280bp的片段；双重PCR时，能同时扩出SCRIV 400bp的MCP基因保守区和SCRV280bp的N基因保守区；阴性对照组无扩增条带；由此可见，采用本发明所述的SCRIV和SCRV双重PCR检测试剂盒检测两种病毒的方法与单一PCR检测两种病毒的方法的结果，其准确度相同。
双重PCR是在同一反应体系中加入2对引物，同时扩增出2条目的条带的技术。引物的设计及用量是影响双重PCR扩增效果最关键的因素。本实施例根据目前已报道的SCRIVMCP基因和SCRV N基因序列信息中的保守区域，结合每对引物的特异性和引物之间可能产生的反应等因素后分别设计引物，扩增片段分别为400bp和280bp，片段大小差异较明显，能在2％的琼脂糖凝胶电泳中明显区分且无其他非特异性条带。
实施例3
本实施例为SCRIV和SCRV双重PCR检测方法扩增条件的优化
试验方法：
本实施例SCRIV和SCRV双重PCR检测方同实施例2，除退火温度以及引物用量不同之外。退火温度依次从57℃、58℃、59……66℃，用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。在确定最佳退火温度后，进行引物的用量优化，(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)或者(SCRV-280-F/SCRV-280-R)引物用量分别设置为0.5/0.5(每对引物的上下游引物均为相同用量)，0.5/1，0.5/1.5，1/0.5，1/1，1/1.5，1.5/0.5，1.5/1和1.5/1.5。同时以ddH2O代替模板作阴性对照所得PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
试验结果：
最佳退火温度：在最佳退火温度试验的10个扩增结果中，57℃至66℃均可扩增出目的条带(图4)，其中58℃目的条带最亮，该温度下N基因和MCP基因的保守区扩增条带均比其他退火温度扩增条带更清晰且特异，定为最佳退火温度。
最佳引物用量：实验设置的9个引物用量中，(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R&SCRV-280-F/SCRV-280-R)为0.5/0.5，1/0.5，1.5/0.5时，双重PCR都能成功扩增出明显的目的条带(图5)，而在1/0.5引物浓度下，N基因和MCP基因的保守区扩增条带均比其他退火温度扩增条带更清晰且特异，因此选择(SCRV-280-F/SCRV-280-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)为0.5/1为最佳引物用量。
由上述两个实验可得，优化后的双重PCR反应条件如下，反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL，引物SCRIV-400-F/SCRIV-400-R 1μL、SCRV-280-F/SCRV-280-R 0.5μL，模板P-N和P-MCP各1μL用ddH2O补充至25μL；该PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃终延伸10min。
在扩增条件优化中，3组引物用量比、10个退火温度均能扩增得到两条目的条带，而且得到的效果都比较好，通过比较后选择58℃为最佳的退火温度，(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R&SCRV-280-F/SCRV-280-R)＝1︰0.5为最佳引物用量。优化的双重PCR反应体系可以准确地扩增目的条带且不扩增出其他病毒DNA模板，证明该方法特异性强，能作出较为准确的病毒区分和诊断。
实施例4
本实施例为SCRIV和SCRV双重PCR检测方法的敏感性检测
试验方法：取质粒P-SCRIV和P-SCRV各1μL(浓度为10ng/μL)，用ddH2O进10倍系列稀释。稀释完成后取10-1至10-10倍稀释的模板，在上述实施例3所述的最佳条件下进行PCR扩增(其PCR扩增同实施例2)，同时以ddH2O代替模板作阴性对照确定该方法可检测DNA的最低量。
试验结果：取所保存的P-SCRIV和P-SCRV质粒各1μL(浓度为10ng/μL)，分别用ddH2O进10倍系列稀释。稀释完成后取10-1至10-10倍稀释的模板，按最佳体系进行双重PCR扩增。结果(图6)显示，在稀释倍数为10-3倍时仍能扩增出2条明显的目的条带，而在稀释倍数10-4倍后只能扩出属于SCRV的目的条带，说明该检测方法对SCRIV和SCRV DNA的检测下限均为0.001ng/μL。
在本实施例的敏感性试验中，双重PCR可检测到10-3倍稀释梯度的样品，即本发明建立的双重PCR检测对于SCRV和SCRIV DNA的检测下限都为0.001ng/μL，说明本发明所述的试剂盒及检测方法敏感性较高，目前临床采集到的SCRIV或SCRV样品其DNA含量一般都在0.001ng/μL之上，因此可以直接应用于普遍临床样品的检测。
实施例5
本实施例为SCRIV和SCRV双重PCR检测方法的特异性检测
试验方法：分别取IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、ISKNV、TiLV、SVCV的核酸产物1μL作为模板，以SCRV、SCRIV、SCRV+SCRIV混合模板为阳性对照，用ddH2O代替模板作为阴性对照，在最佳条件下进行PCR扩增，验证该方法的特异性。
试验结果：在实施例3所述的最佳条件下进行PCR扩增(其PCR扩增同实施例2)，用以检测此方法的特异性，结果如(图7)：以IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、ISKNV、TiLV、SVCV核酸产物为模板均未扩出目的条带，以SCRV、SCRIV、SCRV+SCRIV混合模板分别成功扩出目的条带。
实施例6
本实施例为SCRIV和SCRV双重PCR检测方法在临床样品上的应用
试验方法：对中国水产研究院珠江水产研究所于2019年所采集并保存21份疑似感染SCRV和SCRIV的样品分别进行单一PCR检测和双重PCR检测，以标准质粒P-SCRIV和P-ScRVP-SCRV+P-SCRIV代替模板作为阳性对照组，用ddH2O代替模板作为阴性对照组。
试验结果：如图8、9、10的结果表明，单一PCR检测与双重PCR检测的结果基本一致；SCRV阳性7份(2、4、11、12、13、17、19号样品)，阳性率为33％；SCRIV阳性样品有4份(6、11、15、18号样品)，阳性率为19％；SCRV和SCRIV混合感染阳性样品有1份(11号样品)，阳性率为4％。
本实施例的结果表明：对保存在本研究所的21份疑似SCRIV和SCRV的样品进行双重PCR检测，检测出SCRIV阳性4份；SCRV阳性7份；SCRIV和SCRV混合感染阳性为1份，而且单一PCR检测的结果与双重PCR检测样品的结果完全一致，因此证明该方法准确率较高，适用于临床样品检测。同时SCRIV和SCRV可感染宿主的数量巨大，范围较广，该双重PCR检测方式可得到较为广泛的使用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法
<130> 2020
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtacaccat gccagaggcc aagc 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccatgtccct gactgagctg ctc 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggcagcaa ttgacatgtt cttc 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatactttgg acaatcccat gtc 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgtcttctg ttacgggttc tggc 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttacaggatg gggaaaccca tg 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggaaaacc aaatcatcaa gag 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcacaaagct tggtgtttca gc 22
Claims (9)
1.一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物、EasyTaqPCR SuperMix、阴性对照液和阳性对照液；
其中，所述引物包括针对鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物为SCRIV-400-F/SCRIV-400-R；所述针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物为SCRV-280-F/SCRV-280-R；其中，所述引物序列如下所示：
SCRIV-400-F：AGTACACCATGCCAGAGGCCAAGC；SEQ ID NO：1；
SCRIV-400-R：CCATGTCCCTGACTGAGCTGCTC；SEQ ID NO：2；
SCRV-280-F：GTGGCAGCAATTGACATGTTCTTC；SEQ ID NO：3；
SCRV-280-R：GATACTTTGGACAATCCCATGTC；SEQ ID NO：4。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述EasyTaq PCR SuperMix为2×EasyTaqPCR SuperMix，所述阴性对照液为无菌ddH2O，所述阳性对照液为a和b；
a：提取鳜鱼蛙病毒的DNA为模板，以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRIV作为阳性对照；
b：以鳜鱼弹状病毒的cDNA为模板，以SCRV-N-F/SCRV-N-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRV作为阳性对照；
其中，所述SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R和SCRV-N-F/SCRV-N-R引物序列如下所示：
SCRIV-MCP-F：ATGTCTTCTGTTACGGGTTCTGGC；SEQ ID NO：5；
SCRIV-MCP-R：TTACAGGATGGGGAAACCCATG；SEQ ID NO：6；
SCRV-N-F：ATGGAAAACCAAATCATCAAGAG；SEQ ID NO：7；
SCRV-N-R：TCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC；SEQ ID NO：8。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL、引物SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R各1μL或SCRV-N-F/SCRV-N-R各1μL、鳜鱼蛙病毒的DNA模板或鳜鱼弹状病毒的cDNA模板1μL、无菌ddH2O补充至25μL；
所述PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃终延伸10min。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接中，所述回收纯化的扩增产物的体积为4μL，所述pEASY-T1载体的体积为1μL。
6.如权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒及弹状病毒的双重PCR方法，包括如下步骤：
(1)待测样品DNA的提取；
(2)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2ml PCR反应管内分别加入2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5μL，SCRIV-400-F/SCRIV-400-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R混合的引物用量为1～6μL，P-SCRIV和P-SCRV混合的模板1μL，用无菌ddH2O补充至25μL；同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心进行PCR反应；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃～66℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min；
(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的预期大小；
(4)结果与判定：查看PCR产物是否能同时扩出鳜鱼蛙病毒400bp的MCP基因保守区和鳜鱼弹状病毒280bp的N基因保守区的片段。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒及弹状病毒的双重PCR方法，步骤(2)中，所述SCRIV-400-F/SCRIV-400-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R混合的引物用量组成：上游引物与下游引物的用量相同，当SCRIV-400-F/SCRIV-400-R的用量分别各为0.5μL、0.5μL、0.5μL、1μL、1μL、1μL、1.5μL、1.5μL或1.5μL时，对应的SCRV-280-F/SCRV-280-R的用量分别各为0.5μL、1μL、1.5μL、0.5μL、1μL、1.5μL、0.5μL、1μL或1.5μL；所述退火的温度为57℃、58℃、59℃或66℃。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述RANA-400-F/RANA-400-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R混合的引物用量组成：当所述RANA-400-F/RANA-400-R的用量分别各为1μL，所述SCRV-280-F/SCRV-280-R的用量分别各为0.5μL；所述退火的温度为58℃。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒DNA及弹状病毒DNA的检测下限为0.001ng/μL。
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