CN113293235A - 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明针对蛙病毒3型(FV3)核衣壳蛋白(MCP)基因保守区设计一对特异性引物，通过反应体系的优化、反应特异性和敏感性试验，建立了一种针对FV3的PCR检测方法，该方法最低检测限可达1.2拷贝数的病毒粒子，具有简便、快速、敏感度好、特异性高、低成本等特点，可用于FV3蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调研。

Description

一种用于蛙病毒检测的引物及其应用

技术领域

本发明属于水生生物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种用于蛙病毒检测的引物及其应用。

背景技术

蛙病毒被称为冷血动物杀手，宿主范围广泛，迄今发现可感染鱼类、两栖类、爬行类等近百种水生生物，给水产养殖业造成重大经济损失。2009年，世界动物卫生组织(OIE)正式将蛙病毒感染列入必须报告的水生动物疫病之一。我国每年由蛙病毒所致的水产病害损失就高达数十亿元。我国自1996年分离获得蛙病毒属模式株蛙病毒3型(Frog virus 3，FV3)以来，蛙病毒在各地陆续被发现和报道。2013年，湖北宜昌某石蛙养殖场曾发生大规模FV3感染，主要临床症状表现为体表出血、后肢溃疡、活动无力、发病7天后达到死亡高峰，累积死亡率最高可到80％。随后，2016年四川某黑斑蛙养殖场爆发FV3感染，死亡率高达90％。蛙病毒已经成为危害我国蛙类养殖的流行性致病因素。目前对于蛙病毒感染，尚缺乏有效治疗手段，主要以早期诊断预防为主。因此，建立快速、灵敏、高效的蛙病毒检测方法，及时发现病原体并进行早期防控，是控制蛙病毒感染的重要手段。

MCP是虹彩病毒的主要组成部分，约占整个病毒多肽的40％-45％，并且在虹彩病毒科中高度保守，可利用其同源性的差异进行病毒进化与检测方面的研究，当前许多关于蛙病毒的检测方法都是基于MCP序列设计引物。王庆等根据MCP中的保守序列设计特异性引物，利用双重PCR方法特异性扩增LMBV，而对FV3不进行扩增，最低检测限达6.5pg。李江宇等通过对蛙病毒属MCP进行分析，建立了一种可用于检测蛙病毒属13种病毒成员并能进行初步分类的三重荧光PCR方法，该方法中，对各种蛙病毒的检测限均达到了10²拷贝。张旻等利用STIV的MCP设计特异性引物，建立了特异性检测EHNV和TFV的巢式PCR方法，可检测10²拷贝数的病毒粒子。以上方法虽极大地推动了蛙病毒检测研究，但双重PCR、三重PCR操作较为繁琐，易发生气溶胶污染产生假阳性，且检测耗时久；荧光PCR方法又对仪器设备要求高，引物成本也相对较高，在蛙病毒的检测应用中有一定的局限性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明针对蛙病毒属FV3病毒MCP序列设计特异性引物，仅使用一般的PCR方法就能达到较好的检测效果，对设备要求低，反应时间短，操作简单成本低，且特异性好，对TiLV,NVV,ISKNV,KHV,IHHNV,MSRV,MrNV,LMBV等其他毒株无交叉反应，灵敏度高，检测限可达1.2个拷贝数，可为蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供有效技术手段。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于蛙病毒检测的引物，所述的引物的序列如下所示：

FV3-1-5’：CCTCCATCCCAGTCAGCA；SEQ:ID:NO:1；

FV3-1-3’：CAGCAAACGGACACTTCAT；SEQ:ID:NO:2。

本发明还提供了一种上述引物的应用方法，一种蛙病毒的检测方法，其步骤如下：

(1)待测样品DNA的提取；

(2)PCR扩增：利用权利要求1所述引物进行扩增；

(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小；

(4)结果与判定：查看PCR产物是否扩出蛙病毒346bp的MCP基因保守区的片段。

作为本发明所述的蛙病毒检测方法的一种优选实施方式，所述的步骤(2)中的PCR扩增体系为20μL，在PCR反应管内分别加入2×Taq PCR Master Mix10μL，模板用量为0.3～4μL，FV3-1上下游引物用量各为0.3～1.0μL，用无菌水补充至20μL；同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心进行PCR反应；

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，42℃～60℃退火35s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃终延伸10min。

作为本发明所述的蛙病毒检测方法的一种优选实施方式，所述PCR扩增体系模板用量为1.0μL，FV3-1混合引物用量为2.0μL；所述PCR扩增的反应程序的退火温度为50℃。

作为本发明所述的蛙病毒检测方法的一种优选实施方式，所述阳性对照液为携带有特异性引物FV3-1PCR扩增产物的质粒溶液。

作为本发明所述的蛙病毒检测方法的一种优选实施方式，所述待测样品DNA的获得步骤中待测样品为浸泡过疑感染动物的无菌水。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明应用针对蛙病毒属FV3病毒MCP序列设计的特异性引物，仅使用一般的PCR方法就能达到较好的检测效果：第一，对设备要求低，单一引物，操作简单，可以普遍推广；第二，灵敏度高，检测限可达1.2个拷贝数，可以在不对动物组织进行破坏的前提下有效检出，简化了操作流程；第三，特异性好，针对单一病毒，可以做FV3染病排查，为后续治疗提供参考依据。本发明可为蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供有效技术手段。

附图说明

图1为FV3-1引物PCR检测结果图，其中M：DNA marker，1：扩增产物。

图2为不同引物(A)、模板(B)、退火温度(C)条件下FV3-1引物PCR扩增效果图，其中M：DNA marker；A:1-10引物用量依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μL；B:1-10模板用量依次为0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4μL；C:1-10Tm设定依次为42，44，46，48，50，52，54，56，58，60℃。

图3为FV3-1引物扩增特异性检测。M：DNA marker，1-13:阴性对照，阳性对照，WSSV,CEV,SHIV,TiLV,NVV,ISKNV,KHV,IHHNV,MSRV,MrNV,LMBV。

图4为FV3-1引物敏感性试验结果图，其中M：DNA marker；1-10依次为1.2×10⁹-1.2×10⁰copy/μL梯度稀释模板。

图5为FV3-2引物敏感性试验结果图，其中M：DNA marker；1-10依次为1.3×10⁹-1.3×10⁰copy/μL梯度稀释模板。

图6为FV3-3引物敏感性试验结果图，其中M：DNA marker；1-10依次为2.7×10⁹-2.7×10⁰copy/μL梯度稀释模板。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明以下实施例所述的病原与细胞、试剂与器材、引物如下所示：

1.实验用的病原与细胞

FV3购买自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。神经坏死病毒(Nervous necrosisvirus，NNV)来源于本实验室。虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridovirus，SHIV)核酸、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)核酸、鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)核酸、大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass ranavirus，LMBV)核酸、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)核酸由中国水产科学院珠江水产所提供。对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal andhaematopoietic necrosis virus，IHHNV)核酸、对虾白斑综合症病毒(White spotsyndrome virus，WSSV)核酸、罗非鱼罗湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)cDNA、加州鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)cDNA、罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV)cDNA由广东省动物疫病预防控制中心提供。

2.试剂与器材

2×Taq Master PCR Mix、pMD19-T载体、E.coli DH5α感受态细胞、DNA DL2000marker购自Takara公司。质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司。琼脂糖凝胶等其他试剂购自上海生工。PCR扩增仪(S1000)、核酸定量仪(ND2000)均由本实验室提供。

3.引物

根据GenBank中登记的FV3的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列(MT578298.1)，使用Primer 5.0软件设计1对新的特异性引物FV3-1。根据现有技术中蛙病毒检测方法的筛选结果，选取两对扩增效果稳定的引物FV3-2、FV3-3进行检测方法灵敏度比对，其中FV3-2引物来自中华人民共和国水产行业标准蛙病毒病检测方法，FV3-3引物参见Mao等人的研究。引物信息如表1。

表1引物信息表

实施例1

本实施例为构建标准重组质粒P-FV3作为本发明的阳性对照液。

试验方法：

以购买自美国标准生物品收藏中心(ATCC)的FV3毒株DNA为模板，以FV3-1为引物进行PCR扩增，该PCR反应总体系为20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL、模板1μL、10mmol/L上下游FV3-1引物各0.5μL，灭菌水8μL。反应参数设置为95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火35s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃终延伸10min。扩增产物使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测并送上海生工进行测序确认扩增片段是否正确。

阳性目的条带经胶回收纯化后与pMD19-T载体进行连接后转化至DH5α感受态细胞。将感受态细胞涂布在含氨苄青霉素的培养板上。37℃过夜培养，挑取单克隆菌落进行菌液PCR分析，进一步选取阳性菌株送上海生工进行测序验证。测序正确的菌株经扩大培养后，提取质粒，获得标准重组质粒P-FV3-1，并存放于-20℃作为标准品用于后续试验。

上述构建的标准重组质粒P-FV3-1使用核酸分析仪测定重组质粒DNA的质量浓度，并换算成质粒拷贝浓度：质粒浓度(拷贝/μL)＝6.02×10²³(拷贝/mol)×质粒质量浓度(g/μL)/质粒分子数。

试验结果：以FV3-1为引物扩增蛙病毒3型(FV3)核衣壳蛋白(MCP)基因，片段大小346bp，将此片段与pMD19-T载体进行连接，经PCR鉴定和测序公司测序，证实该片段与预期相符，证明已成功构建标准重组质粒P-FV3-1。

需要说明的是本发明同时以上述方法成功构建标准重组质粒P-FV3-2和P-FV3-3。

实施例2

本实施例为本发明所述的一种蛙病毒(FV3)检测方法，该方法应用FV3-1引物对待测样品进行PCR扩增，所述引物的序列如下：

FV3-1-5’：CCTCCATCCCAGTCAGCA；SEQ:ID:NO:1；

FV3-1-3’：CAGCAAACGGACACTTCAT；SEQ:ID:NO:2。

对蛙病毒进行PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)待测样品DNA的提取；

(2)PCR扩增：采用20μL的PCR扩增体系，在PCR反应管内分别加入2×Taq PCRMaster Mix 10μL、模板1μL、10mmol/L上下游引物各0.5μL，灭菌水8μL，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心进行PCR反应；所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火35s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃终延伸10min。

(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小；

(4)结果与判定：查看PCR产物是否扩出蛙病毒MCP基因保守区的片段。

同时，将扩增产物送上海生工进行测序确认扩增片段是否正确。

试验结果：如图1所示，设计的FV3-1引物可以从待测样品中扩增得到预期目的片段；扩增片段经回收纯化后进行测序，并与Genbank中登记的FV3序列进行比对，扩增片段的同源性为100.0％，由此可见本发明所述的应用FV3-1引物所做的蛙病毒PCR检测方法准确性高。

实施例3

本实施例为PCR检测方法扩增条件的优化。

试验方法：

FV3-1引物试验中，使用阳性质粒模板浓度为1.2×10⁶copy/μL，扩增反应使用Takara公司2×Taq Master PCR Mix 20μL体系进行，Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、酶浓度等指标对实验结果影响不大，因此反应体系仅优化引物浓度、模板浓度和退火温度。

10mmol/L上下游引物添加量分别0.1μL，0.2μL，0.3μL，0.4μL，0.5v，0.6μL，0.7μL，0.8μL，0.9μL，1μL，PCR扩增后电泳确定引物浓度。

模板添加量分别为0.3μL,0.4μL,0.5μL,1μL,1.5μL,2μL,2.5μL,3μL,3.5μL,4μL，PCR后电泳确定最优模板浓度。

以引物合成公司推荐的退火温度为中心，上下进行扩展，设定退火温度梯度，产物电泳后确定最佳退火温度。

试验结果：不同的引物用量、不同的模板用量以及不同的退火温度条件下，FV3-1引物PCR扩增效果如图2所示。上下游引物添加量在0.3-1.0μL范围内均能扩增出目的条带，使用0.9μL/1μL引物时，扩增条带最亮(图2A)；模板添加量达到1.0μL时，扩增条带明显变亮，3.0μL时，扩增条带最亮(图2B)。Tm值在42-60℃范围内，均能进行有效扩增，48℃时条带明显变亮，但在58℃以后，条带变暗，50℃、52℃扩增条带最亮(图2C)。

因此，FV3-1引物的PCR反应体系优化如下：2×Taq PCR Master Mix 10μL，上下游引物各1μL，DNA模板3μL，灭菌水5μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火35s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃终延伸10min。

实施例4

本实施例为FV3-1为引物的PCR检测方法的特异性检测

试验方法：以WSSV,CEV,SHIV,EHP,TiLV,NVV,ISKNV,KHV,IHHNV,MSRV,MrNV,LMBV的核酸产物各取3μL为模板，灭菌水作为阴性对照，标准重组质粒P-FV3-1为阳性对照，在最佳条件下进行PCR扩增，验证该方法的特异性。

试验结果：在实施例3所述的最佳条件下进行PCR扩增(其PCR扩增同实施例2)，用以检测此方法的特异性，结果如图3显示，FV3-1只对目的条带进行扩增，以WSSV,CEV,SHIV,EHP,TiLV,NVV,ISKNV,KHV,IHHNV,MSRV,MrNV,LMBV的核酸产物为模板时，该引物均未扩增出条带，表明该引物特异性良好。

实施例5

本实施例为蛙病毒PCR检测方法灵敏度检测

利用实施例1构建的3种阳性质粒作为标准品，将测定的质粒质量浓度换算成拷贝浓度后，依次进行10倍梯度稀释，以各浓度梯度的质粒作为模板，取1μL进行PCR检测，其中P-FV3-1的最大浓度为1.2×10⁹copy/μL，P-FV3-2的最大浓度为1.3×10⁹copy/μL，P-FV3-3的最大浓度为2.7×10⁹copy/μL，对应以FV3-1、FV3-2和FV3-3为引物，在实施例3所述的最佳条件下进行PCR扩增(其PCR扩增同实施例2)验证敏感性。

试验结果：如图4第10泳道所示，当模板加入量为1.2拷贝时，FV3-1引物仍能扩增出清晰的目的条带，本发明所述的应用FV3-1引物所做的蛙病毒PCR检测方法最低可检出1.2个拷贝数的FV3质粒模板。如图5第7泳道所示，当模板加入量为1.3×10³拷贝时，扩增条带隐约可见，因此，FV3-2引物最低可检出1.3×10³个或是1.3×10⁴个拷贝数的FV2质粒模板。如图6第8泳道所示所示，当模板加入量为2.7×10²拷贝时，扩增条带变的很难分辨，几乎看不到，因此，FV3-3引物最低可检出2.7×10³个拷贝数的FV3质粒模板。通过对比可知，本发明应用FV3-1引物的蛙病毒检测方法的灵敏度高于其它两个引物的检测方法，且有显著的差别。

实施例6

本实施例为PCR检测方法在临床样品上的应用。

应用本发明所述的FV3病毒检测方法对采自广东省、江西省的各大蛙类养殖场样品进行检测，以实施例3所述的最佳条件下进行PCR扩增，检出的阳性样本扩增产物进一步进行测序分析，进一步验证本发明所述的蛙病毒PCR检测方法的有效性和准确性。本实施例中样品DNA的获取方式除了用常规的以动物组织为材料的提取方法(表2中方法1)；还以浸泡过疑感染动物的无菌水作为源材料提取样品DNA(表2中方法2)，省去了部分前处理过程，使检测方法更简单快捷。

试验结果：如表2所示，以FV3-1为引物的PCR检测方法对采集的153份临床蛙类养殖样品进行检测，共检出FV3阳性样本12份。两种DNA获取方法阳性样品数检出情况一致，进一步测序检测表明，检出片段序列为FV3。该结果进一步证实了本发明应用FV3-1引物的PCR检测方法的准确性与可靠性。

同时，用浸泡过疑感染动物的无菌水作为源材料提取样品DNA，既节省了样品前处理的时间，提高了检测效率，又从另一个角度证实了本方法的灵敏度高。

表2临床蛙类样品FV3病毒PCR检测结果

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 仲恺农业工程技术学院

<120> 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCTCCATCCC AGTCAGCA 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CAGCAAACGG ACACTTCAT 19

Claims (6)

1.一种用于蛙病毒检测的引物，其特征在于，所述引物的序列如下所示：

FV3-1-5’：CCTCCATCCCAGTCAGCA；SEQ:ID:NO:1；

FV3-1-3’：CAGCAAACGGACACTTCAT；SEQ:ID:NO:2。

2.一种蛙病毒的检测方法，其特征在于，步骤如下：

(1)待测样品DNA的提取；

(2)PCR扩增：利用权利要求1所述引物进行扩增；

(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小；

(4)结果与判定：查看PCR产物是否扩出蛙病毒346bp的MCP基因保守区的片段。

3.根据权利要求2所述的蛙病毒的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的PCR扩增体系为20μL，在PCR反应管内分别加入2×Taq PCR Master Mix10μL，模板用量为0.3～4μL，FV3-1上下游引物用量各为0.3～1.0μL，用无菌ddH2O补充至20μL；同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心进行PCR反应；

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，42℃～60℃退火35s，72℃延伸40s，35个循环；72℃终延伸10min。

4.根据权利要求3所述的蛙病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系模板用量为1.0μL，FV3-1上下游引物用量各为1.0μL；所述PCR扩增的反应程序的退火温度为50℃。

5.根据权利要求3所述的蛙病毒的检测方法，其特征在于，所述阳性对照液为携带有权利要求3所述扩增产物的质粒溶液。

6.根据权利要求2所述的蛙病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中待测样品为浸泡过疑感染动物的无菌水。

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