CN112359148A

CN112359148A - 用于快速检测三种鱼类病毒的pcr引物组及其应用

Info

Publication number: CN112359148A
Application number: CN202011478208.6A
Authority: CN
Inventors: 梁红茹; 马赛亚; 付小哲; 李宁求; 林强; 刘礼辉; 牛银杰; 罗霞; 黄志斌
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112359148B

Abstract

本发明公开一种用于快速检测三种鱼类病毒的三重PCR引物组及其应用，涉及基因检测技术领域；本发明公开一种用于快速检测三种鱼类病毒的三重PCR引物组，包括传染性脾肾坏死病毒ISKNV引物、鳜鱼蛙病毒SCRIV引物和鳜弹状病毒SCRV引物；所述三重PCR引物组具有高灵敏度，检出时间上也要比常规PCR提早2‑3小时，大大提高了临床诊断的效率，可为ISKNV、SCRIV和SCRV这三种病毒感染的流行病学调查提供更为丰富的参考依据，对后续的研究和防治也具有重要意义。

Description

用于快速检测三种鱼类病毒的PCR引物组及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及用于快速检测三种鱼类病毒的PCR引物组及其应用。

背景技术

鳜鱼养殖历史悠久，是我国优质淡水鱼之一，其以产量高、肉嫩、刺少、味甜、蛋白质丰富等营养价值而被消费者喜爱。然而随着我国鳜鱼养殖技术、设备和饲料市场的迅速扩张和发展，传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鳜鱼蛙病毒(Siniperca chuatsi ranairidovirus，SCRIV)和鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)等病毒病已成为制约鳜鱼养殖业可持续发展的主要因素。ISKNV是鳜鱼大规模暴发传染病的主要病原之一，临床症状通常表现为脾、肾坏死；SCRIV属虹彩病毒科，该属大部分病毒都能使鱼体患病，且发病率和死亡率均较高；SCRV具有极强的致病性，临床症状通常表现为内脏、皮肤和鱼鳍出血，死亡率高达90％。这三种病毒具有毒力强、致死率高等特点，是近些年引起鳜、鲈、鳢等发病的主要病毒病原体，而且在流行病学调查研究中发现，这三种病原经常会混合感染，一旦发病，就会导致极高的死亡率，目前尚未发现有效的治疗措施，因此，ISKNV、SCRIV和SCRV三种病毒严重威胁着鳜、鲈、鳢等养殖业的健康和经济的发展。目前还未有ISKNV、SCRIV和SCRV的特效治疗药物，因而高效简便的诊断技术就显得尤为重要。

目前许多研究已经建立了ISKNV、SCRIV和SCRV单一以及双重的PCR检测方法，但这些常规检测方法单次只能检测1-2种病毒类型，且存在易出现交叉感染、耗时耗力等缺点。

多重PCR(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)也称复合PCR,是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术,即在一个反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段。多重PCR既有单一PCR的特异性和敏感性,又较之快捷和经济,在引物和PCR反应条件的设计方面表现出很大的灵活性。多重PCR还能提供内部对照,指示模板的相对数量和质量，同时，多重PCR法检测可有效避免上述单一以及双重的PCR检测方法的弊端。因此，在没有特效治疗药物的情况下，建立多重PCR检测方法可以对病原进行快速诊断，可为ISKNV、SCRIV和SCRV这三种病毒感染的流行病学调查提供更为丰富的参考依据，对后续的研究和防治也具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供用于快速检测三种鱼类病毒的三重PCR引物组及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明建立的三重PCR检测方法可以对病原进行快速诊断，可为ISKNV、SCRIV和SCRV这三种病毒感染的流行病学调查提供更为丰富的参考依据，对后续的研究和防治也具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：本发明提供一种用于检测三种鱼类病毒的PCR引物组，所述PCR引物组包括：

(1)检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组，序列如下所示：

ISKNV-550-F：CCTTAATTTGCCCATTCCCCTCTTC，

ISKNV-550-R：AGTAGTCTACTCCCATCTGGTGGAG；

(2)检测鳜鱼蛙病毒SCRIV的引物组，序列如下所示：

SCRIV-400-F：CATTATCCCGTGGGTTGGTTTAC，

SCRIV-400-R：GGACCCTAGCTCCTGCTTGAC；

(3)检测鳜弹状病毒SCRV的引物组，序列如下所示：

SCRV-780-F：CTGGACATCCTTTGGAATCGAG，

SCRV-780-R：TTCACCAGCTCTGCAGATGTTC。

本发明还提供一种根据所述的PCR引物组在制备检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV、鳜鱼蛙病毒SCRIV和/或鳜弹状病毒SCRV的产品中的应用。

本发明还提供一种用于检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV、鳜鱼蛙病毒SCRIV和鳜弹状病毒SCRV的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括权利要求1所述的三种PCR引物组。

进一步的，所述的PCR试剂盒的PCR反应条件为95℃5min；95℃30s，56-60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃7min。

进一步的，所述PCR反应条件为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃7min。

进一步的，PCR反应时，所述传染性脾肾坏死病毒ISKNV引物、鳜鱼蛙病毒SCRIV引物和鳜弹状病毒SCRV引物的体积比为0-1.5：0-1.5：0-1.5，且传染性脾肾坏死病毒ISKNV引物、鳜鱼蛙病毒SCRIV引物和鳜弹状病毒SCRV引物的体积不同时为0。

进一步的，三重PCR反应时，所述传染性脾肾坏死病毒ISKNV引物、鳜鱼蛙病毒SCRIV引物和鳜弹状病毒SCRV引物的体积比为1：1.5：0.5。

本发明公开了以下技术效果：多重PCR成功建立的关键技术是引物设计以及反应条件的优化，本发明通过设计引物、优化反应条件建立了三重PCR检测方法，可以检测出病毒DNA的最低浓度为0.01ng/μL，可以达到较高的敏感性，可以满足普遍临床样品的检测。本发明建立的三重PCR检测方法可特异性的检测出ISKNV、SCRIV和SCRV三种常见病毒，与单一PCR方法检测患病鱼样品的阳性率结果一致。与单一PCR相比，本发明建立的三重PCR检测方法具高灵敏度的同时，检出时间上也要比常规PCR提早2-3小时，大大提高了临床诊断的效率。

因此，本发明建立的针对三种病原菌检测的三重PCR法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、经济性强等优点，可为传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒的鉴别诊断和发病机理的研究提供丰富的参考依据和技术支持，同时对传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒后续的研究和防治也具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为以ISKNV-MCP-F/ISKNV-MCP-R为引物扩增ISKNV的MCP基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为DNA Marker，1为ISKNV的MCP基因，2为ddH₂O阴性对照；

图2为以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物扩增SCRIV的MCP基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为DNA Marker，1为SCRIV的MCP基因，2为ddH₂O阴性对照；

图3为以SCRV-N-F/SCRV-N-R扩增SCRV的N基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为DNA Marker，1为SCRV的N基因，2为ddH₂O阴性对照；

图4为引物的特异性验证的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA Marker，1为引物ISKNV-550-F/ISKNV-550-R单一PCR扩增MCP基因保守区，2为引物SCRIV-400-F/SCRIV-400-R单一PCR扩增MCP基因保守区，3为引物SCRV-780-F/SCRV-780-R单一PCR扩增N基因保守区，4为引物ISKNV-550-F/ISKNV-550-R+SCRIV-400-F/SCRIV-400-R+SCRV-780-F/SCRV-780-R三重PCR扩增MCP、MCP和N基因的保守区，5为ddH₂O阴性对照；

图5为确定最佳退火温度实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNAMarker，1-10分别为退火温度56-65℃的PCR产物，11为ddH₂O阴性对照；

图6为确定最佳引物用量实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNAMarker，1-23和25-28(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R)引物用量分别为0.5/0.5/0.5，0.5/0.5/1，0.5/0.5/1.5，0.5/1/0.5，0.5/1/1，0.5/1/1.5，0.5/1.5/0.5，0.5/1.5/1，0.5/1.5/1.5，1/0.5/0.5，1/0.5/1，1/0.5/1.5，1/1/0.5，1/1/1，1/1/1.5，1/1.5/0.5，1/1.5/1，1/1.5/1.5，1.5/0.5/0.5，1.5/0.5/1，1.5/0.5/1.5，1.5/1/0.5，1.5/1/1，1.5/1/1.5，1.5/1.5/0.5，1.5/1.5/1，1.5/1.5/1.5μL，24和29为ddH₂O阴性对照组；

图7为三重PCR检测方法的敏感性检测实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA Marker，1-8分别为10^-1至10^-8倍稀释的ISKNV+SCRIV+SCRV扩增产物；9为ddH₂O阴性对照组；

图8为三重PCR检测方法的反应特异性检测实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA Marker，1为IPNV，2为GCRV，3为KHV，4为SGIV，5为NNV，6为ISKNV，7为TiLV，8为SVCV，9为ISKNV，10为SCRIV，11为SCRV，12为阴性对照组，13为ISKNV+SCRIV+SCRV为模板的阳性对照；

图9为临床样品的单一ISKNV PCR检测实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA Marker，1-22分别对应1-22号临床样品，23为阳性对照，24为ddH₂O阴性对照组；

图10为临床样品的单一SCRIV PCR检测实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA Marker，1-22分别对应1-22号临床样品，23为阳性对照，24为ddH₂O阴性对照组；

图11为临床样品的单一SCRV PCR检测实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA Marker，1-22分别对应1-22号临床样品，23为阳性对照，24为ddH₂O阴性对照组；

图12为为临床样品的单一SCRV PCR检测实验的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA Marker，1-22分别对应1-22号临床样品，23为阳性对照，24为ddH₂O阴性对照组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

材料与仪器：

鳜鱼蛙病毒(SCRIV)、鳜弹状病毒(SCRV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)，均由中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室保存及提供。

PCR仪(晶格，中国)，核酸电泳仪(北京六一，中国)，凝胶成像系统VerSa Doc2000(Bio-Rad，美国)，微量分光光度计(南京五义，中国)。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购置得到。

实施例1传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法的建立

1.1引物的设计与合成

根据GenBank中ISKNV的MCP基因序列(HQ317460.1)及其保守区分别设计引物：ISKNV-MCP-F/ISKNV-MCP-R；SCRIV的MCP基因序列(MG941005.1)及其保守区分别设计引物：SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R；SCRV的N基因序列(NC008514.1)及其保守区分别设计引物：SCRV-N-F/SCRV-N-R。

引物由广州艾基生物科技有限公司合成，引物信息如表1。

表1

1.2标准重组质粒的构建

以感染ISKNV的临床样品的DNA为模板，以ISKNV-MCP-F/ISKNV-MCP-R为引物进行PCR扩增ISKNV的MCP基因，片段大小约1300bp(图1)。该PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5μL，引物ISKNV-MCP-F/ISKNV-MCP-R各1μL，模板1μL，用ddH₂O补充至25μL。同时以ddH₂O代替模板作阴性对照。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min30 s，共30个循环；72℃终延伸10min。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。取4μL纯化后的PCR扩增产物与1μL的pEASY-T1载体连接，并转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，培养后提取质粒后进行PCR鉴定，同时将质粒送去广州艾基生物科技有限公司测序，构建标准重组质粒(P-ISKNV)。

以感染SCRIV的临床样品为模板，以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物进行PCR扩增SCRIV的MCP基因，片段大小约为1392bp(图2)。该PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCRSuperMix 12.5μL，引物SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R各1μL，模板1μL，用ddH₂O补充至25μL。同时以ddH₂O代替模板作阴性对照。该PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min30s，共30个循环；72℃终延伸10min。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。取4μL纯化后的PCR扩增产物与1μL的pEASY-T1载体连接，并转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，培养后提取质粒后进行PCR鉴定，同时将质粒送去广州艾基生物科技有限公司测序，构建标准重组质粒(P-SCRIV)。

以感染SCRV的临床样品为模板，以SCRV-N-F/SCRV-N-R为引物进行PCR扩增SCRV的N基因，片段大小约1290bp左右(图3)。该PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCR SuperMix12.5μL，引物SCRV-N-F/SCRV-N-R各1μL，模板1μL，用ddH₂O补充至25μL，同时以ddH₂O代替模板作阴性对照。反应参数为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min30s，共30个循环；72℃终延伸10min，反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。取4μL纯化后的PCR扩增产物与1μL的pEASY-T1载体进行连接，并转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，培养后提取质粒后进行PCR鉴定，同时将质粒送去广州艾基生物科技有限公司测序，构建标准重组质粒(P-SCRV)。

分别用超微量分光光度计在260nm和280nm测定三种质粒的浓度，并统一稀释到10ng/μL，置于-20℃以备用。

1.3ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR反应体系建立及优化

1.3.1引物的特异性验证

分别进行单一PCR扩增和三重PCR扩增来验证引物的特异性。

PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL，引物ISKNV-550-F/ISKNV-550-R或SCRIV-400-F/SCRIV-400-R或SCRV-780-F/SCRV-780-R或ISKNV-550-F/ISKNV-550-R+SCRIV-400-F/SCRIV-400-R+SCRV-780-F/SCRV-780-R各1μL，模板P-ISKNV 1μL或P-SCRIV 1μL或P-SCRV 1μL或P-ISKNV+P-SCRIV+P-SCRV各1μL，用ddH₂O补充至25μL。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃终延伸7min，同时用ddH₂O代替模板作阴性对照，对所得扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

单一PCR时，能扩增出ISKNV MCP基因保守区约550bp的片段、SCRIV MCP基因保守区约400bp的片段和SCRV N基因保守区约780bp的片段；三重PCR时，能同时扩增出ISKNV550bp的MCP基因保守区、SCRIV 400bp的MCP基因保守区和SCRV 780bp的N基因保守区；阴性对照组无扩增条带(图4)。

1.3.2三重PCR反应体系的优化

1.3.2.1确定最佳退火温度

为使同一三重PCR反应之中三个片段均得到有效扩增。

PCR反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL，引物ISKNV-550-F/ISKNV-550-R、SCRIV-400-F/SCRIV-400-R、SCRV-780-F/SCRV-780-R各1μL，模板P-ISKNV1μL或P-SCRIV 1μL或P-SCRV 1μL或P-ISKNV+P-SCRIV+P-SCRV各1μL，用ddH₂O补充至25μL。依次设定56℃、57℃、58℃……65℃10个退火温度。同时设立以ddH₂O代替模板的处理为阴性对照，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果如图5所示，在确定最佳退火温度实验的10个扩增结果中，可观察到56℃至65℃均可扩增出目的条带，其中60℃目的条带最亮，该温度下N基因和MCP基因的保守区扩增条带均比其他退火温度扩增条带更清晰且特异，因此将60℃确定为最佳退火温度。

1.3.2.2确定最佳引物用量

确定最佳退火温度后，进行引物不同用量的优化：设置27种(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R)的引物用量，分别为0.5/0.5/0.5，0.5/0.5/1，0.5/0.5/1.5，0.5/1/0.5，0.5/1/1，0.5/1/1.5，0.5/1.5/0.5，0.5/1.5/1，0.5/1.5/1.5，1/0.5/0.5，1/0.5/1，1/0.5/1.5，1/1/0.5，1/1/1，1/1/1.5，1/1.5/0.5，1/1.5/1，1/1.5/1.5，1.5/0.5/0.5，1.5/0.5/1，1.5/0.5/1.5，1.5/1/0.5，1.5/1/1，1.5/1/1.5，1.5/1.5/0.5，1.5/1.5/1，1.5/1.5/1.5μL，每对引物的上下游引物均为相同用量。同时设立以ddH₂O代替模板作阴性对照，所得PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

如图6所示，(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R)为1/1.5/0.5，1.5/1/1.5，1.5/1.5/1和1.5/1.5/1.5时，三重PCR都能成功扩增出明显的目的条带，本着节约成本且效果明显的可操作性原则，选择(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R)为1/1.5/0.5作为最佳引物用量。

1.3.2.3优化后的三重PCR反应条件

综合1.3.2.1和1.3.2.2两个实验，可得优化后的三重PCR反应条件如下，反应总体系为25μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL，引物ISKNV-550-F/ISKNV-550-R 1μL，SCRIV-400-F/SCRIV-400-R 1.5μL，SCRV-780-F/SCRV-780-R 0.5μL，模板P-ISKNV、P-SCRIV和P-SCRV各1μL用ddH₂O补充至25μL。

该PCR扩增反应参数为：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃终延伸7min。

1.4ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR的敏感性和特异性检测

1.4.1三重PCR反应敏感性检测

取浓度为10ng/μL的三种质粒P-ISKNV、P-SCRIV和P-SCRV各1μL，用ddH₂O混匀后进行10倍梯度稀释。稀释后取10^-1至10^-8倍稀释的三种阳性模板，利用优化后的最佳PCR体系和条件进行扩增，同时用ddH₂O代替模板作阴性对照，以确定三重PCR反应的敏感性。结果如图7所示，在稀释倍数为10^-4时仍能扩增出3条明显的目的条带，说明该检测方法对ISKNV、SCRIV和SCRV DNA的检测下限均为0.01ng/μL，因此本发明所建立的检测方法可以满足普遍临床样品的检测。

1.4.2三重PCR反应特异性检测

分别取IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、ISKNV、TiLV、SVCV的核酸产物1μL作为模板，以ISKNV、SCRIV、SCRV、ISKNV+SCRIV+SCRV混合模板为阳性对照，用ddH₂O代替模板作为阴性对照，在最佳条件下进行PCR扩增，验证此法的特异性。结果如图8所示：以IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、ISKNV、TiLV、SVCV核酸产物为模板均未扩出目的条带，以ISKMV、SCRIV、SCRV和ISKNV+SCRIV+SCRV混合模板分别成功扩出目的条带。

1.5ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR方法的初步应用

对中国水产研究院珠江水产研究所于2019年所采集并保存22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一PCR检测和三重PCR检测，设立以标准质粒P-ISKNV、P-SCRIV和P-SCRV代替模板作为阳性对照组，用ddH₂O代替模板作为阴性对照组。

如图9-12所示，结果检出ISKNV阳性6份，阳性率为27％；SCRIV阳性9份，阳性率为41％；SCRV阳性样品有2份，阳性率为9％；其中ISKNV和SCRIV均为阳性的样品有2份，阳性率为9％；SCRIV和SCRV均为阳性的样品有2份，阳性率为9％；ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染阳性率为0。本发明建立的三重PCR检测与单一PCR检测的结果100％一致，因而表明本研究所建立的三重PCR检测方法可适用于临床样品的检测和病原学调查。

本发明建立的三重PCR检测方法可特异性的检测出ISKNV、SCRIV和SCRV三种常见病毒，具高灵敏度的同时，检出时间上也要比常规PCR提早2-3小时，大大提高了临床诊断的效率，而且还可为上述三种病毒感染的流行病学调查提供更为丰富的参考依据，对后续的研究和防治也具有重要意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 用于快速检测三种鱼类病毒的PCR引物组及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttaatttg cccattcccc tcttc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtagtctac tcccatctgg tggag 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggacatcc tttggaatcg ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcaccagct ctgcagatgt tc 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cattatcccg tgggttggtt tac 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaccctagc tcctgcttga c 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtctgcaa tctcaggtgc aaacg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttacagaggg aagcctgcgg cgccg 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggaaaacc aaatcatcaa gag 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcacaaagct tggtgtttca gc 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtcttctg ttacgggttc tggc 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttacaggatg gggaaaccca tg 22

Claims

1.一种用于检测三种鱼类病毒的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组至少包括以下一种：

(1)检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组，序列如下所示：

ISKNV-550-F：CCTTAATTTGCCCATTCCCCTCTTC，

ISKNV-550-R：AGTAGTCTACTCCCATCTGGTGGAG；

(2)检测鳜鱼蛙病毒SCRIV的引物组，序列如下所示：

SCRIV-400-F：CATTATCCCGTGGGTTGGTTTAC，

SCRIV-400-R：GGACCCTAGCTCCTGCTTGAC；

(3)检测鳜弹状病毒SCRV的引物组，序列如下所示：

SCRV-780-F：CTGGACATCCTTTGGAATCGAG，

SCRV-780-R：TTCACCAGCTCTGCAGATGTTC。

2.一种根据权利要求1所述的PCR引物组在制备检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV、鳜鱼蛙病毒SCRIV和/或鳜弹状病毒SCRV的产品中的应用。

3.一种用于检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV、鳜鱼蛙病毒SCRIV和/或鳜弹状病毒SCRV的PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂盒包括权利要求1所述的三种PCR引物组。

4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于：PCR反应条件为95℃ 5min；95℃30s，56-60℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环；72℃ 7min。

5.根据权利要求4所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应条件为95℃ 5min；95℃30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环；72℃ 7min。

6.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于，PCR反应时，所述传染性脾肾坏死病毒ISKNV引物、鳜鱼蛙病毒SCRIV引物和鳜弹状病毒SCRV引物的体积比为0-1.5：0-1.5：0-1.5，且传染性脾肾坏死病毒ISKNV引物、鳜鱼蛙病毒SCRIV引物和鳜弹状病毒SCRV引物的体积不同时为0。

7.根据权利要求6所述的PCR试剂盒，其特征在于，进行三重PCR反应时，所述传染性脾肾坏死病毒ISKNV引物、鳜鱼蛙病毒SCRIV引物和鳜弹状病毒SCRV引物的体积比为1：1.5：0.5。