CN102816868A

CN102816868A - 一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重pcr方法

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Publication number: CN102816868A
Application number: CN2012103167089A
Authority: CN
Inventors: 王庆; 曾伟伟; 刘春�; 李凯彬; 王芳; 王英英; 石存斌; 吴淑勤
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2032-08-30
Also published as: CN102816868B

Abstract

本发明公开了一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，通过设计的两对特异性引物和优选的反应体系、反应条件，可同时检测、鉴别蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒，该发明方法敏感性强、特异性高，可以快速、准确地对大口黑鲈虹彩病毒进行诊断和种属鉴定。

Description

一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法

技术领域

本发明涉及PCR技术领域，特别涉及一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR技术。

背景技术

大口黑鲈（Micropterus salmoides，或Largemouth bass），俗称加州鲈，原产于北美密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、耐低温、肉质鲜美和容易捕捞等特点，已成为我国重要的淡水养殖品种。从20世纪90年代开始，我国池塘养殖大口黑鲈发生病害的问题越来越复杂，如烂鳃病、肠炎病、腐皮病、水霉病、车轮虫病、杯体虫病等，导致大口黑鲈发病的病原主要是嗜水气单胞菌，柱状黄杆菌，霉菌和寄生虫，确诊由病毒感染导致发病的报道较少。大口黑鲈虹彩病毒（LMBV，又称SCRV）通常指的是虹彩病毒科（Iridoviridae）的蛙病毒属（Ranavirus），最早分离自1991年美国佛罗里达州Lake Weir市的野生大口黑鲈。1995年美国南卡罗莱纳州的Santee-Cooper 水库养殖的大口黑鲈暴发鱼灾（fish kill）引起人们高度关注。该病毒的特点是不仅可以导致大面积鱼爆发疾病死亡引起鱼灾，也可以是不表现任何症状的隐性带毒，因此对大口黑鲈健康养殖带来巨大威胁。2009年邓国成等人报道了大口黑鲈溃疡病是由虹彩病毒感染引起的，这是国内对大口黑鲈溃疡病毒性病原的首次报道。而虹彩病毒科中另外一个重要的病毒属肿大细胞病毒属（Megalocytivirus），对鱼的致病性更强，该类病毒引起的鱼类疾病呈逐年上升趋势，患病鱼死亡率达30-100%。马冬梅等人研究证实大口黑鲈的肝脾肿大症由肿大细胞病毒属虹彩病毒引起，实验室大口黑鲈攻毒试验显示100%死亡率（马冬梅等，大口黑鲈肝脾肿大病病原研究,中国水产科学,2011,18(3),654-659）。两种不同种属虹彩病毒对大口黑鲈养殖的影响，引起广大科研人员和基层养殖户对该类病原的高度关注。

在虹彩病毒中，研究比较清楚的结构蛋白是主衣壳蛋白（MCP）。MCP占整个病毒粒子多肽的40-45％，是虹彩病毒粒子中丰度最高的蛋白，并且在虹彩病毒科中高度保守，因此可以利用MCP的同源性差异进行虹彩病毒分子进化方面的研究。1999年Mao J等人综合大口黑鲈病毒蛋白合成分析，限制性片段长度多态分析（RFLP），MCP和DNA甲基转移酶（DMet）基因序列分析的结果，明确了大口黑鲈虹彩病毒的分类地位为虹彩病毒科蛙病毒属成员。Mao J等人比较了LMBV与蛙病毒3（FV3）等的MCP和DMet基因的氨基酸序列，以及它们的限制性内切酶图谱，结果显示LMBV与蛙病毒代表株FV3有一定差距。在国际病毒分类委员会第八次报告中将LMBV归类为蛙病毒属的Santee-Cooper ranavirus种。目前，针对大口黑鲈蛙病毒属的常规PCR和荧光定量PCR检测方法虽然已有报道，但尚缺乏一种能快速、准确地同时对大口黑鲈蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒进行检测的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可同时检测、鉴别蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒的双重PCR检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，包括以下步骤：

1）从待检大口黑鲈的组织器官提取基因组DNA；

2）以基因组DNA为模板，使用分别根据大口黑鲈虹彩病毒科蛙病毒属和肿大细胞病毒属的MCP基因序列设计合成的两对引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；其中引物序列如下：

蛙病毒属引物Rana-mcp：

上游引物：tatgtgctcaactcttggctggtc（SEQ ID NO.1），

下游引物：ccacgatgggcttgacttctcc（SEQ ID NO.2）；

肿大细胞病毒属Mega-mcp：

上游引物：atgctcattgaacagtgccaggtg（SEQ ID NO.3），

下游引物：ggtggagccgaggggtgttc（SEQ ID NO.4）；

3）扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定，其中蛙病毒扩增产物长475bp，肿大细胞病毒扩增产物长262bp。

所述双重PCR反应体系为：待检DNA模板或阳性质控品或阴性质控品2μl，10×buffer 5μl，MgCl₂浓度1.5mmol/L，各引物浓度0.5μmol/L，dNTP 浓度0.4mmol/L，Taq酶2.5U，ddH₂O补齐至50 μl；

所述双重PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，55-58℃ 30s，72℃ 30s，反应30-35次循环；72℃ 10min；

优选的，退火温度为55℃；

优选的，反应循环数为30次。

一种大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，包括如下成分：10×PCR buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶、引物、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，所用引物序列分别为：

蛙病毒属引物Rana-mcp：

上游引物：tatgtgctcaactcttggctggtc（SEQ ID NO.1），

下游引物：ccacgatgggcttgacttctcc（SEQ ID NO.2）；

肿大细胞病毒属Mega-mcp：

上游引物：atgctcattgaacagtgccaggtg（SEQ ID NO.3），

下游引物：ggtggagccgaggggtgttc（SEQ ID NO.4）；

所述阳性质控品为SD-R和NH-M 的DNA模板，阴性质控品为无菌ddH₂O。

本发明的有益效果是：

本发明可同时检测蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒，该发明方法敏感性强、特异性高，可以快速、准确地对大口黑鲈虹彩病毒进行诊断和种属鉴定。

附图说明

图1为特异性试验电泳图谱；

图2为敏感性试验电泳图谱；

图3为病料检测试验电泳图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施案例进一步描述本发明。

引物的设计：根据GenBank中LMBV的MCP基因序列（登录号GU256635）和马冬梅等发表的大口黑鲈肝脾肿大症病毒的MCP基因序列，设计和筛选出两对特异性片段引物。各引物序列和预期扩增片段长度如下：

Figure 2012103167089100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例1

1. 试验用毒株

大口黑鲈蛙病毒属虹彩病毒SD-R株、肿大细胞病毒属NH-M株、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus HZ08，GCRV HZ08）、传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）和黄尾鰤腹水症病毒（Yellowtail ascites virus，YTAV）由本发明人分离、鉴定和保存；蛙病毒FV3、胖头鱼肌细胞（FHM）从ATCC购买（编号分别为VR-567和CCL-42）；鲤上皮瘤细胞（EPC）、草鱼肾脏细胞（CIK）从中国典型培养物保藏中心购买（编号分别为GDC174、GDC086）；鳜脑原代细胞（SCC）由本发明人所在实验室按常规方法建立和保存。

2. 病毒的增殖和病毒DNA、RNA的提取

大口黑鲈病毒SD-R株和FV3均采用FHM增殖，草鱼呼肠孤病毒HZ08株采用CIK增殖，传染性造血器官坏死病毒IHNV采用EPC增殖，以上细胞加入含5%胎牛血清M199培养基，28℃培养。大口黑鲈病毒NH-M株和黄尾鰤腹水症病毒YTAV采用SCC增殖，加入含5%胎牛血清L15培养基，28℃培养。待细胞病变（CPE）达85%以上即可收毒，并反复冻融三次。取病毒悬液200ul，按照OMEGA组织DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒说明书进行相关操作。同时提取不接种病毒的细胞DNA，作为阴性对照模板。

3. 双重PCR扩增

联合使用Rana-mcp和Mega-mcp上下游引物进行双重PCR扩增。反应体系为50μl：0.2 ml的PCR反应管中加入DNA模板2μl，10×buffer 5μl，MgCl₂（25mmol/L）3μl，Rana-mcp和Mega-mcp上下游引物（25μmol/L）各1μl，dNTP （2.5mmol/L）8μl，Taq酶（10U/μl）0.25μl，ddH₂O补齐至50μl。扩增条件为：使用95℃ 5min预变性，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，72℃延伸10min的PCR条件。

PCR扩增后的产物，用10g/L的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳25min，用凝胶成像系统观察并拍照。

4. 特异性试验

用上述双重PCR方法对大口黑鲈病毒SD-R株、NH-M株、虹彩病毒FV3的DNA，草鱼呼肠孤病毒HZ08株、传染性造血器官坏死病毒IHNV、黄尾鰤腹水症病毒YTAV的cDNA进行扩增，阴性对照以ddH₂O为模板。评价该双重PCR法鉴别检测的特异性。结果显示采用上述双重PCR方法，SD-R株扩增出475bp条带，NH-M株扩增出262bp条带，其他模板均无条带。阴性对照也没有任何条带出现，如图1所示，其中M为DNA Marker，1-7依次为SD-R，NH-M，FV3，HZ08，IHNV，YTAV和阴性对照的扩增结果。

5. 敏感性试验

用紫外分光光度计测定SD-R株和NH-M株模板DNA的浓度，分别为65ng/ml和145ng/ml，将两种模板等量混合，再进行10倍梯度稀释。对不同浓度混合模板进行双重PCR扩增后，电泳显示在稀释度为10^-4时，依然可以观察到清晰的特异性条带，表明双重PCR反应能检测病毒的最低含量分别为6.5pg和14.5pg，如图2所示，其中M为DNA Marker，1-6分别为SD-R和NH-M的稀释梯度10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，7为阴性对照。

实施例2

1. 病料采集

从佛山市南海区、顺德区收集到15个大口黑鲈样品。病料采集后，低温送至实验室。

2. 提取DNA模板

1) 分别取上述15个待检测鱼的脾脏组织50mg，剪碎后，加入0.5ml的裂解液，55℃消化1小时，期间不时轻轻摇动；

2) 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

3) 加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

4) 用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，去上清，室温静置干燥10分钟，加入50 μl TE溶解DNA，4℃贮存备用。

3. 病料检测

运用实施例1中所述双重PCR方法对提取的15个待检鱼DNA进行检测，以SD-R和NH-M的DNA模板作为阳性质控品，无菌ddH₂O作为阴性质控品。其中6份样品扩增出特异性条带，5份为引物Rana-mcp检测阳性，1份引物Mega-mcp扩增阳性。将扩增结果为阳性的PCR产物切胶后，按照OMEGA胶回收试剂盒的说明进行纯化回收。然后分别克隆进pMD18-T载体中，转化感受态细胞DH5α，选取阳性克隆重组质粒送Invitrogen公司进行序列测定，测序结果证实与GenBank中发表的序列一致，如图3所示，其中1-17依次为15个待检测鱼、阳性质控品和阴性质控品的扩增结果。

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tatgtgctca actcttggct ggtc 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccacgatggg cttgacttct cc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgctcattg aacagtgcca ggtg 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtggagccg aggggtgttc 20

Claims

1.一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，包括以下步骤：

1)从待检大口黑鲈的组织器官提取基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，使用分别根据大口黑鲈虹彩病毒科蛙病毒属和肿大细胞病毒属的MCP基因序列设计合成的两对引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；其中引物序列如下：

蛙病毒属引物Rana-mcp：

上游引物：tatgtgctcaactcttggctggtc（SEQ ID NO.1），

下游引物：ccacgatgggcttgacttctcc（SEQ ID NO.2）；

肿大细胞病毒属Mega-mcp：

上游引物：atgctcattgaacagtgccaggtg（SEQ ID NO.3），

下游引物：ggtggagccgaggggtgttc（SEQ ID NO.4）；

3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定，其中蛙病毒扩增产物长475bp，肿大细胞病毒扩增产物长262bp。

2.根据权利要求1所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于：所述双重PCR反应体系为：待检DNA模板或阳性质控品或阴性质控品2μl，10×buffer 5μl，MgCl₂浓度1.5mmol/L，各引物浓度0.5μmol/L，dNTP 浓度0.4mmol/L，Taq酶2.5U，ddH₂O补齐至50 μl。

3.根据权利要求1所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于：所述双重PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，55-58℃ 30s，72℃ 30s，反应30-35次循环；72℃ 10min。

4.根据权利要求3所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于：退火温度为55℃。

5.根据权利要求3所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于：反应循环数为30次。

6.一种大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，包括如下成分：10×PCR buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶、引物、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，所用引物序列分别为：

蛙病毒属引物Rana-mcp：

上游引物：tatgtgctcaactcttggctggtc（SEQ ID NO.1），

下游引物：ccacgatgggcttgacttctcc（SEQ ID NO.2）；

肿大细胞病毒属Mega-mcp：

上游引物：atgctcattgaacagtgccaggtg（SEQ ID NO.3），

下游引物：ggtggagccgaggggtgttc（SEQ ID NO.4）。

7.根据权利要求6所述的一种大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为SD-R和NH-M 的DNA模板，阴性质控品为无菌ddH₂O。