CN103882018A - 一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用 - Google Patents

一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用 Download PDF

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胡志华
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Abstract

本发明公开了一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对。本发明还公开了一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法。本发明还公开了一种鸽细环病毒的检测试剂盒。本发明还公开了一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法扩增得到的全基因组序列,所述全基因组序列具有两个主要的ORF,编码Rep复制蛋白的ORF1和编码Cap外壳蛋白的ORF2,ORF1对应第464–923位核苷酸序列,编码154个氨基酸,ORF2对应第788–1189位核苷酸序列,编码134个氨基酸,第1457–1462位核苷酸序列对应polyA序列区。

Description

一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用
技术领域
本发明涉及病毒检测领域,具体涉及一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用。
背景技术
细环病毒(Torque teno virus,TTV)是继甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后又发现的一种新型肝炎相关病毒,最初是由日本学者于1997年运用代表性差异分析(representational difference analysis,RDA)技术从输血后非甲至非戊型肝炎病人血浆中分离鉴定出的一种新病毒,并把该病毒以患者名字命名为TTV,又称输血传播病毒。该病毒在人群中感染率较高,据各国对不同人群TTV感染的流行病学调查发现,人群中TTV阳性率一般在10%以上。TTV宿主范围很广,除人类、非人灵长类和和野生动物外,猪、牛、羊、猫、狗、家禽等多种动物体内也相继发现TTV感染,且该病毒具有种属特异性。由于TTV广泛存在于健康/非健康人或动物体内,其具体的感染机制和生物学意义尚不清楚。
根据物种不同所报道的TTV基因组长度也不同。感染人和猿的TTV基因组长度在3.7kb–3.9kb之间,感染猪和狗的TTV基因组长度分别为2.8kb和2.9kb左右,而在猫体内获得的TTV基因组长度约为2.1kb。TTV基因组分为编码区和非编码区(UTR)两个部分,其中UTR特定区域内核苷酸序列较为保守。对于TTV编码区组成的报道不尽相同,有人认为TTV含有4个开放阅读框(open reading frame,ORF),也有人认为其含有6个ORF,但是目前研究较多的是已经确定的2个ORF,即ORF1和ORF2,并认为ORF1可能编码病毒的衣壳蛋白(Rep),ORF2可能编码病毒的非结构蛋白(Cap)。
TTV为单股环状DNA病毒。尽管不同物种TTV基因组长度不同,并且其DNA呈现出高度变异的特点,但是物种间TTV却具有一些相似的基因结构,即:翻译开始于ssDNA,UTR拥有GC含量在90%左右的GC富集区,ORF1和ORF2均具有一小部分的重叠。TTV的4个ORF位于互补的正链上,该病毒可以通过mRNA的剪辑作用产生其他的转录本。研究认为,TTV的ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep蛋白),ORF2编码最大的核衣壳蛋白(Cap蛋白)。不同物种ORF1编码的蛋白长度不等,但均存在被称作是Rep结构域的滚环复制结构域,并具有与CAV的VP1蛋白相似的N端精氨酸富集区。ORF2的编码蛋白与CAV编码蛋白具有类似的一个氨基酸结构域,并认为该结构域可能与病毒感染细胞期间病毒或细胞蛋白的调节有关。此外,研究认为,Cap蛋白可能会参与机体的先天性免疫应答和获得性免疫应答,这对TTV致病机理的研究有重要意义。
到目前为止,TTV对宿主的致病性尚不清楚,但有数据显示其和其他病毒共感染会引起一些疾病。2006年kekarainen等研究人员发现TTV和PCV2混合感染能导致仔猪断奶后多系统呼吸综合征(PMWS)的发生。2008年另有报道TTV能促进PRRS的爆发。2009年Tuijak等对商业化疫苗、药品及实验室常用酶进行猪TTV的检测,结果在猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒和猪肺炎支原体疫苗等中都检测到TTV的存在。
TTV感染呈全球性分布,在人群以及家畜、家禽等动物中感染率较高。目前鸽养殖现已成为畜牧业中相对独立的新兴产业,世界食品消费市场把肉鸽列为优质肉食。国内市场对乳鸽需求量日益增大,发展鸽养殖潜力巨大,市场前景十分广阔。在我国鸽群细环病毒明显高感染率的背景下,尽快了解鸽细环病毒全基因组序列与其他病毒株的同源性、基因结构和功能以及各分离株之间的遗传变异和进化的关系,对我国鸽市场的稳定发展具有十分重要的现实意义和市场价值。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对。
本发明所要解决的第二个技术问题是一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种鸽细环病毒的检测试剂盒。
技术方案:为实现上述目的,本发明提供的一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对,所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法,包括以下步骤:
1)引物的设计与合成:根据GenBank已发表的人TTV基因序列,使用引物设计软件设计引物;
2)鸽细环病毒的PCR检测:鸽细环病毒基因组DNA提取,将病毒基因组DNA进行PCR检测获得阳性DNA样品;
3)以上述的阳性DNA样品为模板,将所述的背对背引物对扩增PTTV全基因组序列得到PCR产物:PCR反应体系为:LA Taq1μL,10×LA PCR Buffer I5μL,dNTP Mixture8μL,模版DNA4μL,上游引物P1和下游引物P2各1μL,ddH2O30μL;PCR反应程序为:95℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,40个循环;72℃再延伸8分钟;
4)PCR扩增产物分析并测序。
一种鸽细环病毒的检测试剂盒,它包含所述的引物对。
其中,上述的鸽细环病毒的检测试剂盒,包括:
1)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P115μL,核苷酸序列如SEQ ID NO:2的下游引物P215μL,2×PCR pre-mix200μL,ddH2O100μL组成;
4)阴性对照:非鸽细环病毒的DNA600μL;
3)阳性对照:鸽细环病毒基因组DNA600μL。
一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法扩增得到的全基因组序列,所述全基因组序列具有两个主要的ORF,编码Rep复制蛋白的ORF1和编码Cap外壳蛋白的ORF2,ORF1对应第464–923位核苷酸序列,编码154个氨基酸,ORF2对应第788–1189位核苷酸序列,编码134个氨基酸,第1457–1462位核苷酸序列对应polyA序列区。
有益效果:与现有技术相比,本发明的优点如下:本发明提供的背对背引物对能准确扩增出江苏6个地区的鸽细环病毒的全基因组序列,全基因片段大小约为1585bp,BLAST比对结果证实获得了6个PTTV全基因序列,将其上传至GenBank数据库,取得了6个江苏株PTTV全基因序列对应的登录号,序列名称及登录号分别为:NJGC(KF372027)、NJLH(KF477317)、NJPK(KF477318)、NJJN(KF477319)、NTHA(KF477320)和ZJDY(KF477321)。本发明还对该全基因序列进行了同源性分析,该试剂盒具有较高的特异性和稳定性,构建了进化树,并进而研究其基因结构和功能以及各分离株之间的遗传变异和进化的关系,通过分析得出,不同地区和不同物种的TTV在亲缘关系上表现出明显的分歧。同时本发明的试剂盒检测灵敏度达5pg,是一种快速准确检测鸽细环病毒的方法。因此本试剂盒可以作为快速检测鸽细环病毒的有效工具。
附图说明
图1PTTV全基因序列的同源性分析;
图2全基因序列系统发育进化树分析;
图3Rep基因系统发育进化树分析;
图4Cap基因系统发育进化树分析;
图5部分阳性病料的PCR鉴定电泳图;
图6PTTV毒株全基因扩增的PCR产物电泳图。
具体实施方式
实施例1:试剂盒的制备。
1、病毒及病料的来源和处理
从江苏的南京浦口、江宁、六合、高淳、南通海安、镇江丹阳的6个鸽场采集到144份血清或组织样品。参见表1
表1本实验所检测的鸽血清或组织样品
Figure BDA0000492902040000041
取0.5-2.0g内脏组织于无菌研钵,加生理盐水研磨,反复冻溶2-3次后5000rmp离心5min,取上清于-20℃保存。鸽圆环阳性病料,鸡贫血阳性病料,猪圆环阳性病料由实验室保存。
2、试剂
DNA抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Geneaid公司,DNA Marker、DNAMix、10×LA PCR Buffer I、LA Taq酶、dNTP Mixture和pMD18-T载体试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司,DH5α感受态细胞购自天根(北京)公司,引物由上海博亚生物工程有限公司合成。其它试剂均为进口或国产分析纯。
3、引物的设计与合成
根据GenBank已发表的人TTV基因序列,使用Primer Premier5.0软件设计2对引物(表2),分别用于PTTV检测和全基因扩增使用。引物由英潍捷基(上海)有限公司合成。
表2本实验所用引物序列
Figure BDA0000492902040000042
Figure BDA0000492902040000051
PTTV1即为本发明的上游引物P1,PTTV2即为本发明的下游引物P2。
阴性对照:非鸽细环病毒的DNA;
阳性对照:鸽细环病毒基因组DNA。
实施例2:鸽细环病毒(PTTV)的PCR检测
参照Geneaid公司的病毒核酸提取试剂盒说明书抽提144份血清或组织样品的病毒基因组DNA。
取2μL上述模板DNA进行PTTV的PCR检测,PCR反应体系为:Mix12.5μL,引物对NG343、NG344各1μL,DNA模版2μL,ddH2O8.5μL(瞬时离心混匀)。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性45s,58℃退火30s,72℃延伸40s,40个循环;72℃再延伸10min。取2μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。(见图5)
采用PCR技术,对从江苏6个鸽场采集到的144份鸽血清或组织样品进行PTTV检测,扩增出约500bp的特异性片段,与预计一致。任选六份阳性PCR产物送公司测序,经BLAST比对证实为PTTV。6个鸽场的144份样品中共有103份样品为PTTV阳性,阳性检出率为71.5%(103/144)。首次证实我国鸽群中存在PTTV感染,江苏地区鸽群中PTTV检出率较高,可能对鸽养殖业构成潜在威胁。
实施例3:PTTV全基因的克隆和测序
从6个鸽场各任选一份PTTV阳性DNA样品,使用引物对PTTV1和PTTV2扩增PTTV全基因。PCR反应体系为:LA Taq1μL,10×LA PCR Buffer I5μL,dNTP Mixture8μL,模版DNA4μL,引物对PTTV1和PTTV2各1μL,ddH2O30μL(瞬时离心混匀)。PCR反应程序为:95℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,40个循环;72℃再延伸8分钟。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后(图6),切下含目的条带的凝胶,参照Geneaid公司的凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。
参照试剂盒说明书要求,将上述胶回收产物与pMD18-T载体建立10μL的连接体系(pMD-181μL,Solution I4μL,胶回收产物5μL),16℃水浴连接4-5小时。
参照《分子克隆指南》,将上述连接反应液转化DH5α感受态细胞中,涂布含氨苄青霉素的LB平板上,37℃恒温培养箱中放置30min后倒置孵育12-16h。
挑取单克隆,经PCR鉴定为阳性的重组菌送公司测序。
从每个鸽场任选一份PTTV阳性样品进行全基因扩增、测序,首次获得了江苏6株PTTV的全基因片段,大小约为1585bp,与预计一致。BLAST比对结果证实获得了6个PTTV全基因序列,将其上传至GenBank数据库,取得了6个江苏株PTTV全基因序列对应的登录号,序列名称及登录号分别为:NJGC(KF372027)、NJLH(KF477317)、NJPK(KF477318)、NJJN(KF477319)、NTHA(KF477320)和ZJDY(KF477321)。
实施例4全基因序列的比较分析
测序结果首先经NCBI的BLAST比对确认。使用DNAstar7.1和Clustal X1.8生物信息学软件对PTTV全基因序列进行比对分析和同源性分析,以MEGA5软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树。
应用DNAStar中的MegAlign软件包将本实验所获得的江苏6株PTTV全基因序列(NJGC、NJLH、NJPK、NJJN、NTHA和ZJDY)进行同源性分析(图1)。
图1结果显示,本实验所获得的江苏6株PTTV全基因序列间同源性高达99.7%–100%,表明我国江苏地区鸽群中PTTV毒株之间具有很高的同源性,地域差异不明显。
目前已有大量研究表明,TTV与圆环病毒科环圈病毒属的鸡贫血病毒(CAV)和圆环病毒属的鸽圆环病毒(PiCV)在病毒结构和编码蛋白上高度相似。因此,从GenBank中选取国内外CAV和PiCV各两个全基因序列一起进行分析。将本实验获得的这6株PTTV全基因序列与GenBank中登录的国内外TTV、PiCV、CAV共14株全基因序列(表1)构建系统发育进化树(图2)。
表3本实验参考的来源于GenBank的毒株背景资料
Figure BDA0000492902040000061
Figure BDA0000492902040000071
进化树结果显示,上述20株PTTV、CAV、PiCV和TTV代表毒株全基因序列可明显分为两大分支,本研究自测6株PTTV与CAV、PiCV亲缘关系十分相近,共同构成第一大分支;人、类人猿、猪和猫TTV毒株亲缘关系相近,共同构成第二大分支。各物种间毒株序列继续分化为不同亚支,个体差异不明显。上述结果表明,宿主种属相同的物种间亲缘关系相近,处于进化树上的同一分支,但由于TTVDNA呈高度异质性,因此不同地区和不同物种的毒株在亲缘关系上呈现出一定的差异,分子进化方向上表现出不同的趋势。本实验获得的江苏6株PTTV毒株亲缘关系高度接近,并且与宿主同为禽类的CAV和PiCV毒株亲缘关系也十分接近,分子进化方式相似。
实施例5:PTTV Rep和Cap基因序列分析
对本实验所获得的江苏6株PTTV全基因序列分析表明,PTTV与圆环病毒相似具有两个主要的ORF:编码Rep复制蛋白的ORF1和编码Cap外壳蛋白的ORF2。6株PTTV毒株的ORF V1均对应第464–923位核苷酸序列,编码154个氨基酸。ORF C1对应第788–1189位核苷酸序列,编码134个氨基酸(表4)。值得注意的是,与哺乳动物不同,PTTV的UTR区域并未发现明显的GC富集区(GC含量在60%左右),且序列起始端没有明显的TATA-box(TATAAA)特征,但有第1457–1462位核苷酸序列所对应的polyA序列区(AATAAA)。
表4不同TTV毒株ORF结构特征
Figure BDA0000492902040000081
注:a:ORF编码的氨基酸数目;b:ORF起始位置
Rep基因进化树分析:对本实验获得的6株PTTV毒株和表3中14株毒株的ORF1(Rep)基因进行进化树分析(图3)。结果显示,上述20株PTTV、CAV、PiCV和TTV代表株的Rep基因可明显分为两大分支,本研究自测6株PTTVRep基因与猫、猪TTV、CAV、PiCV亲缘关系相近,共同构成第一大分支。人、类人猿和一株猪TTV Rep基因构成另一大分支。并且猪TTV的Rep基因继续分化为亚支。上述结果表明,PTTV和CAV、PiCV毒株不仅全基因亲缘关系相近,Rep基因亲缘关系仍十分相近,处于进化树上的同一分支。由于TTV基因组DNA的异质性和不同毒株Rep基因的差异,使得宿主同为哺乳动物的TTVRep基因在亲缘关系上呈现出一定的差异。
Cap基因进化树分析:同样,对上述20株PTTV、CAV、PiCV和TTV代表株ORF2编码的核衣壳蛋白(Cap)基因进行进化树分析(图4)。结果显示,20株Cap基因也明显分为两大分支。6株PTTV与猪、人各一株TTV和CAV共同构成第一大分支,PiCV与人、类人猿、猫和猪TTV的Cap基因构成第二大分支,猪TTVCap基因继续分化为亚支。上述结果表明,PTTV与CAVCap基因仍具有相近的亲缘关系,处于进化树上的同一分支。而宿主同为鸽的PTTV和PiCV由于Cap基因的异质性亲缘关系较远。值得注意的是,PiCV与类人猿、猫TTVCap基因亲缘关系十分相近,位于同一亚支上,这或许是因为Cap基因特殊的结构和功能造成物种间亲缘关系的差异。
上述对不同宿主、不同物种毒株的Rep和Cap基因进化数分析显示,进化树均主要分为两大分支。宿主同为禽类的PTTV与CAV和宿主同为哺乳动物的某些人、猪TTVRep和Cap基因亲缘关系均十分相近,处于同一分支。由于TTV基因的高度异质性及Rep、Cap基因特有的结构和功能,使得一些同源宿主间、甚至同一物种不同毒株间的亲缘关系都表现出明显的差异,处于进化树上的不同分支或者分化为不同的亚支。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0000492902130000011

Claims (5)

1.一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对,其特征在于,所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)引物的设计与合成:根据GenBank已发表的人TTV基因序列,使用引物设计软件设计引物;
2)鸽细环病毒的PCR检测:鸽细环病毒基因组DNA提取,将病毒基因组DNA进行PCR检测获得阳性DNA样品;
3)以上述的阳性DNA样品为模板,将权利要求1所述的背对背引物对扩增PTTV全基因组序列得到PCR产物:PCR反应体系为:LA Taq1μL,10×LA PCR Buffer I5μL,dNTP Mixture8μL,模版DNA4μL,上游引物P1和下游引物P2各1μL,ddH2O30μL;PCR反应程序为:95℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,40个循环;72℃再延伸8分钟;
4)PCR扩增产物分析并测序。
3.一种鸽细环病毒的检测试剂盒,它包含权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求2所述的鸽细环病毒的检测试剂盒,其特征在于包括:
1)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P115μL,核苷酸序列如SEQ ID NO:2的下游引物P215μL,2×PCR pre-mix200μL,ddH2O100μL组成;
2)阴性对照:非鸽细环病毒的DNA片段600μL;
3)阳性对照:鸽细环病毒基因组DNA片段600μL。
5.一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法扩增得到的全基因组序列,其特征在于,所述全基因组序列具有两个主要的ORF,编码Rep复制蛋白的ORF1和编码Cap外壳蛋白的ORF2,ORF1对应第464–923位核苷酸序列,编码154个氨基酸,ORF2对应第788–1189位核苷酸序列,编码134个氨基酸,第1457–1462位核苷酸序列对应polyA序列区。
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