CN103184225B

CN103184225B - 一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途

Info

Publication number: CN103184225B
Application number: CN201310076265.5A
Authority: CN
Inventors: 李文卉; 付宝权; 曲自刚; 盖文燕; 谢志宙; 刘静宜
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2033-03-11
Also published as: CN103184225A

Abstract

本发明公开一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途。本发明的一种多头带绦虫绵羊脑多头蚴抗原基因是氨基酸序列为SEQ№1的Tm82。本发明的多头带绦虫抗原基因Tm82可用于制备脑多头蚴的免疫疫苗。

Description

一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途

技术领域

本发明涉及一种寄生虫的基因，确切讲是一种多头带绦虫抗原基因，以及其重组蛋白与用途。

背景技术

脑多头蚴病（Cerebral coenurosis）俗称脑包虫病，又称眩倒病或蹒跚病(gid or sturdy)，是多头带绦虫（Taenia multiceps）的中绦期幼虫脑多头蚴（Coenurus cerebralis）寄生于绵羊和山羊等有蹄类反刍动物的脑内引起的一种严重致死性的寄生虫病，人也可作为中间宿主感染。其成虫寄生于犬科肉食兽的小肠。脑多头蚴病的致死率可达100%，给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。该病呈全球性分布，是一种重要的人畜共患寄生虫病（参见Sharma DK and Chauhan PPS. Coenurosis status in Afro-Asian region: a review [J]. Small Rumin Res, 2006, 64:197-202. 另参见Scala A and Varcasia A. Updates on morphobiology, epidemiology and molecular characterization of coenurosis in sheep[J]. Parassitologia, 2006,48(1-2):61-63.）。目前，脑多头蚴病的诊断及治疗仍面临技术挑战(参见Scott PR. Diagnosis and treatment of coenurosis in sheep [J]. Vet Parasitol, 2012, 189(1):75-78.)。目前已研制成功的的带科绦虫重组疫苗，包括羊带绦虫、牛带绦虫、猪带绦虫、细粒棘球绦虫等。众所周知，这些疫苗抗原都来自于六钩蚴蛋白45W、16K、18K、Eg95中的一种或多种簇族，而且这些蛋白在不同的绦虫种间具有一定的相似性 (Lightowlers MW, Cestode vaccines: origins, current status and future prospects[J].Parasitology, 2006, 133: 27-42.)。尽管这些宿主保护性抗原间的DNA或蛋白序列间仅仅有很低的同源性，但它们的氨基酸序列都有一些共同的特性：一是都具有预测的信号肽序列，二是都具有一个或两个拷贝的保守型的基序(参见Lightowlers MW, Flisser A, Gauci CG, et al. Vaccination against cysticercosis and hydatid disease[J]. Parasitol Today, 2000, 16: 191-196.)，把这个基序定义为纤维结合蛋白区域III (Fn III) (Bork P, Doolittle RF. Fibronectin type III modules in the receptorphosphatase CD45 and tapeworm antigens[J]. Protein Sci, 1993, 2:1185 -1187.)。

上世纪八十年代，已经有脑多头蚴病的免疫预防的报道，免疫抗原常采用多头带绦虫六钩蚴体外培养物或虫体粗抗原（参见Edwards GT and Herbert IV. Preliminary investigations into the immunization of lambs against infection with Taenia multiceps metacestodes[J].Vet Parasitol,1982,9(3-4):193-199. 另参见Verster A, Tustin RC. Preliminary report on the stimulation of immunity to the larval stage of Taenia multiceps [J]. J S Afr Vet Assoc, 1982, 53(3): 175-176.另参见Verster A and Tustin RC. Immunization of sheep against the larval stage of Taenia multiceps[J]. Onderstepoort J Vet Res, 1987, 54(2):103-105.另参见张文宝，哈江，蔡宏，等. 另参见多头带绦虫六钩蚴代谢物对绵羊脑包虫病的免疫效果观察[J].中国兽医科技,1991，21(12): 35-36. 另参见窦兰清，付宝权，柴忠威，等.多头带绦虫抗原特性的研究—囊液和囊壁粗抗原的免疫原性 [J].中国兽医技，1996，26(12):5-7.另参见窦兰清，付宝权，柴忠威，等. 另参见多头带绦虫抗原特性的研究—原头节及其排泄分泌抗原的免疫原性[J].中国兽医科技，1997，27(8):9-11.）。近年，多头带绦虫Tm16和Tm18重组疫苗绵羊攻虫试验也显示了它们的有效性（参见Gauci C, Vural G, Oncel T, et al. Vaccination with recombinant oncosphere antigens reduces the susceptibility of sheep to infection with Taenia multiceps [J]. Int J Parasitol, 2008, 38 (8-9):1041-1050.另参见Varcasia A, Tosciri G, Coccone GN, et al. Preliminary field trial of a vaccine against coenurosis caused by Taenia multiceps[J].Vet Parasitol, 2009,162(3-4):285-289.）。通过构建cDNA文库从中筛选基因是获取抗原性基因行之有效的手段，国外学者从羊带绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选到保护性抗原基因45W，成功地研制了羊囊尾蚴基因重组疫苗（Johnson KS, Harrison GB, Lightowlers MW, et al. Vaccination against ovine cysticercosis using a defined recombinant antigen[J]. Nature ,1989, 338, 585-587.）。近年来国内学者成功构建了猪带绦虫、亚洲带绦虫cDNA质粒文库并进行了EST测序分析，获得了成虫表达基因数据（黄江，胡旭初，包怀恩，等. 亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序[J].热带医学杂志，2007，7(2):116-118.另参见黄江，胡旭初，徐劲，等. 猪带绦虫成虫cDNA质粒文库的构建及EST测序[J].中国人兽共患病学报，2008，24(12):1126-1128.）。

发明内容

本发明提供一种多头带绦虫抗原性基因，以及这一基因所编码蛋白的制备方法和可能的用途。本发明的一种多头带绦虫绵羊脑多头蚴抗原基因为Tm82，其氨基酸序列为SEQ №1，其核苷酸序列为SEQ №2.

本发明的多头带绦虫绵羊脑多头蚴抗原基因Tm82是对脑多头蚴cDNA 文库的EST（Expression sequence Tag,表达序列标签）进行测序分析，发现标号为Tm82的基因序列与多头带绦虫已知抗原性基因Tm16编码的蛋白具有相似性，然后通过去除载体序列及polyA尾巴，得到具有完整ORF编码框的Tm82序列。

本发明的Tm82重组基因的制备方法是以以脑多头蚴cDNA表达文库为模板，用SEQ№3和SEQ№4为引物进行PCR扩增后进行纯化处理，再将经纯化处理后的产物与pGEX-4T-1质粒分别用EcoRⅠ、XhoⅠ进行双酶切，回收产物以T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，获得重组表达质粒pGEX-Tm82，再转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基培养，收集菌体进行SDS-PAGE将大量增菌诱导表达的菌体离心富集细菌培养物沉淀，用pH7.4 PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次后超声裂解表达菌，分别收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式后用GST琼脂糖树脂纯化，得目标蛋白。

本发明的多头带绦虫抗原基因Tm82可用于制备脑多头蚴的免疫疫苗。相关的实验表明，本发明的基因为多头带绦虫的抗原性基因。用本发明的Tm82重组蛋白受试羊只进行免疫后，可对羊脑多头蚴病感染产生一定的保护作用。

附图说明

图1是实施例一Tm82基因所编码蛋白的跨膜区预测结果

ProtScale分析蛋白亲疏水性分析(窗口大小默认值为9)时，结果表明该蛋白质存在2个高分值（Scare>1.5，当Scare>0时表示疏水性）分别分布在5～15, 85～95域；而低分值（Scare＜0）表示亲水性峰则位于20、40、50、70、100、130氨基酸位点附近，表明该蛋白总体亲水性较高，ProtScale图形输出见图1。

图2 是Tm82基因所编码蛋白序列的信号肽预测

SignalP分析表明Tm82蛋白第1位到第17位氨基酸残基的信号肽分值为0.762（域值为0.450），说明该蛋白含有信号肽序列，见图2。

图3 是Tm82蛋白结构域预测及与其它已知绦虫保护性抗原的结构域比对

SMART分析可以看出，Tm82蛋白与Tm16蛋白的结构域最为相似，见图3。

图4至图6是实施例中Tm82基因在不同发育时期的转录情况核酸电泳图，其中：

图4是提取的总RNA。图中M: DL2000 DNA Marker；1:成虫；2: 脑多头蚴；3: 六钩蚴；

图5是Tm82基因的RT-PCR电泳图。图中M: DL2000 DNA Marker；1:成虫；2: 脑多头蚴；3: 六钩蚴；4: 阴性对照；

图6是actin 基因的RT-PCR电泳图。图中M: DL2000 DNA Marker；1:成虫；2: 脑多头蚴；3: 六钩蚴；4: 阴性对照。

图7 是实施例三去除信号肽序列后Tm82基因序列的PCR扩增电泳图

图中M: DNA分子质量标准；1:Tm82基因PCR；2:阴性对照。

图8是实施例三Tm82重组蛋白的表达

图中M: 蛋白质标准分子量标准，1: 空载体菌诱导前；2～3:空载体菌诱导后；4: 空载体菌表达纯化后；5: Tm82重组菌诱导前；6～7: Tm82重组菌诱导后；8: Tm82重组菌表达纯化后。

具体实施方式

本发明以下结合实施例作进一步详述。

一、Tm82基因序列分析

1.Tm82 基因编码蛋白的大小

Tm82基因组成的长度为402 bp开放阅读框，共编码133个氨基酸，其氨基酸序列见SEQ№1，碱基序列见SEQ№2。

2.Tm82蛋白理化性质分析

应用ProtParam分析，Tm82基因编码133个氨基酸残基组成的多肽的理论分子质量为14834.3 ku，理论等电点为9.37，原子组成是C₆₇₀H₁₀₇₉N₁₈₃O₁₈₆S₅。该蛋白由19种氨基酸组成，其中Ala最为丰富，Cys和Gln含量最少。负电荷残基(Asp，Glu)16个，正电荷残基（Arg，Lys）20个。不稳定系数（instability index）为40.69（大于40为不稳定），表明该蛋白状态不稳定。ProtScale分析蛋白亲疏水性分析(窗口大小默认值为9)时，结果表明该蛋白质存在2个高分值（Scare>1.5，当Scare>0时表示疏水性）分别分布在5～15, 85～95域；而低分值（Scare＜0）表示亲水性峰则位于20、40、50、70、100、130氨基酸位点附近，表明该蛋白总体亲水性较高。

3.跨膜区及信号肽预测

TMHMM预测Tm82不产生跨膜螺旋。SignalP分析表明Tm82蛋白第1位到第17位氨基酸残基的信号肽分值为0.762（域值为0.450），说明该蛋白含有信号肽序列。

4.Tm82结构域的预测及与其它已知绦虫保护性抗原的比对

从SMART分析图可以看出，Tm82蛋白与Tm16蛋白的结构域最为相似。SMART分析Tm82蛋白与其它已知带科绦虫宿主保护性抗原均含有纤维结合蛋白III 型结构域(fibronectin type III domain，Fn III )，且大多数也都含有信号肽序列，详见表1：

表1 Tm82蛋白结构域与其它已知绦虫保护性抗原的结构域比对

。

二、Tm82基因在不同发育时期的转录情况

1. RNA的提取，应用Trizol法，具体步骤如下：

（1）取新鲜的脑多头蚴原头节约100 mg，置于微型匀浆器中，同时加入1mL的Trizol在冰浴中迅速超声至无可见组织块。

（2）转移液体至DEPC处理的微量离心管中，室温静置5 min；加0.2 mL酚-氯仿抽提液，剧烈震荡约15 s，室温孵育2~3 min。

（3）12 000×g，4℃离心15 min后，将上层液体转至另一干净离心管中，加入200 μL氯仿再抽提一次。

（4）将抽提后的上层液体转至干净离心管中，加入500 μL异丙醇，室温静置10 min，吸去上清液体，加入1 mL 75%乙醇洗涤、混匀样品。

（5）7 500×g，4 ℃离心5 min，彻底吸弃上清。

（6）真空干燥RNA沉淀5 min，用100 μL无核酸酶水溶解RNA，置56 ℃孵育10 min后，进行下面的反转录。

2. 反转录PCR

应用TakaRa公司的primeScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒对三个时期（成虫、脑多头蚴、六钩蚴）的总RNA进行反转录，反应体系如下：每个样本相同量的总RNA (1 μg) ，oligo dT primer (50 μM) 1 μL，dNTP Mixture (2.5 mM) 4 μL，用RNase free H₂O补充至反应总体积为13 μL，65℃孵育5 min，然后迅速置冰上急冷5 min，短暂离心将上述反应液收集于管底，接着依次加入5×primeScript buffer 4 μL，RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5 μL，PrimeScriptReverse Transcriptase (200 U/μL) 1μL，最后用RNase free H₂O补充至反应体积为20 μL。将上述反应液42℃孵育60 min，70℃孵育15 min，然后置冰上冷却，得到的每个cDNA可用于PCR。选取Tm82基因ORF序列设计引物，选取脑多头蚴actin蛋白作为RT-PCR的标准对照，actin扩增片段参照脑多头蚴EST序列Tm97 122～520位设计引物。以上各自PCR扩增产物经测序证实反转录后的产物是目的基因。

三、Tm82重组蛋白的制备

1. Tm82基因表达引物的设计及目的基因的扩增

根据Tm82的基因序列，在信号肽序列之后设计表达引物序列，并在上、下游引物序列前加上保护性碱基及EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点，模板是脑多头蚴cDNA表达文库。上游引物序列SEQ №3（5′-CCGGAATTCTTGGAAGAAGCTGGTGAAAGCGTA-3′），下游引物SEQ №4（5′-CCGCTCGAGCTAGAGGAGGGGCATTCGTCTGA-3′）。PCR反应总体积为50 μL，扩增体系组成为10×PCR反应缓冲液5.0 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）4.0 μL，Tm82上游引物（10 μmol/L）与下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，模板是Tm82的EST所对应的测序菌液，无菌去离子水补足至50 μL。同时设立不加模板的反应管作为阴性对照。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。反应结束后取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，并测序验证序列。结果成功扩增到Tm82目的基因。将上述PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化。

2. Tm82重组蛋白的表达

随后将Tm82 PCR纯化产物及pGEX-4T-1质粒，分别用EcoRⅠ、XhoⅠ进行双酶切，回收产物以T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，获得重组表达质粒pGEX-Tm82，并测序验证正确后转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基37℃培养过夜培养，用终浓度为1 mM 的IPTG 诱导表达4 h，表达带有GST标签的Tm82融合蛋白。收集菌体进行SDS-PAGE将大量增菌诱导表达的菌体离心富集细菌培养物沉淀，用pH7.4 PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次，在强度40%的条件下超声裂解表达菌15 min，4oC，12000×g 离心15 min，分别收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式后，将可溶性的蛋白上清用GST琼脂糖树脂纯化说明书纯化。同时将空质粒pGEX-4T-1转化到BL21，同上述条件表达，纯化。

3. Tm82重组蛋白的纯化

采用北京韦氏博慧色谱科技有限公司谷胱甘肽琼脂糖树脂为填料。具体纯化步骤如下：

1) 取GST琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积为1 mL；

2) 用缓冲液1（50 mM Tris-HCl，pH8.3）平衡5个床体积，流速为1 mL/min；

3) 将表达上清用缓冲液1对比稀释，0.45 μm 滤膜过滤，上样。流速为1 mL/min；

4) 用缓冲液再洗10个床体积，流速为1 mL/min；

5) 用缓冲液2（50 mM Tris-HCl含还原型谷胱甘肽，pH8.3）洗脱，流速为1 mL /min，收集洗脱峰。最后将纯化后的重组蛋白根据SDS-PAGE蛋白电泳检测没有杂带后，用紫外分光光度计测定浓度，°C保存备用。

四、Tm82重组蛋白的疫苗试验

1）多头带绦虫虫卵的收集

用新鲜收集的脑多头蚴原头节饲喂给已驱虫的犬，感染三个月后，安乐处死犬，取小肠，收集多头带绦虫成虫，用生理盐水中洗涤干净后，将其末端3～5节成熟孕卵节片用生理盐水洗涤后剪碎使虫卵释放，用100目铜网过滤除去虫体体壁碎片，8000×g离心10 min，沉淀则为虫卵，光学显微镜下计数备用。

2）绵羊Tm82重组蛋白免疫试验

在犬感染脑多头蚴一个月后，同步对绵羊进行Tm82重组蛋白免疫试验，免疫程序如表2：

表2免疫程序

。

3）Tm82重组蛋白的免疫保护性分析

末次免疫后2周，所有绵羊经口感染2500个多头带绦虫虫卵，感染后1～2月，Tm82组的绵羊先后死去两只，感染对照组的绵羊则先后死去4只，感染后2～3月，绵羊均出现不同程度的精神沉郁，采食和饮水明显减少，有些羊只出现转圈或抽搐，个别羊只出现卧地。感染5个月后，Tm82组剩余的6只绵羊剖检大脑发现，发现1只绵羊没有包囊，其它5只绵羊大脑均发现1～4个大小为5～20 mm的包囊，并且整个大脑有多处和脑组织融合在一起的钙化灶，脑多头蚴原头节模糊不清，结果说明Tm82蛋白对绵羊脑多头蚴感染产生一定的保护性。

由以上内容可见，本发明的脑多头蚴Tm82重组蛋白能诱导绵羊产生一定的免疫保护力，是一种潜在的疫苗候选抗原。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途

<160> 序列表中序列的个数（如18）（注：CN1至CN8的基因序列与其氨基酸序列）

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> Tm82基因编码的氨基酸序列

<400>

Met Val Arg Phe Cys Phe Leu Leu Leu Ala Ala Ser Val Leu Thr

1 5 10 15

Ala Gly Leu Glu Glu Ala Gly Glu Ser Val Ala Leu Gly Arg Lys

20 25 30

Pro Val Ala Ala Glu Phe Arg Trp Arg Gly Met Asn Ser Thr Ala

35 40 45

Phe Arg Leu Ser Trp Asp Val Arg Arg Leu Val Glu Arg Arg Ala

50 55 60

Lys Tyr Ile Glu Val Leu Tyr Ala Lys Val Gly Glu Pro Asp Lys

65 70 75

Phe Lys Thr Met Ile Glu Arg Val Gly Lys Gly Glu Val Ile Val

80 85 90

Gly Gly Leu Leu Pro Asp Thr Glu Tyr Ser Val Glu Ala Ala Ala

95 100 105

Leu Ala Asp Gly Gly Thr Val Leu Asn Gln Thr Tyr Leu Phe Lys

110 115 120

Thr Pro Pro Asn Lys Glu Ile Arg Arg Met Pro Leu Leu

125 130 133

<210> 2

<211> 402

<212> DNA

<213> Tm82 基因核苷酸序列

<400>

atggtccgat tctgcttttt actgttggcg gcctcggtgc tgactgcggg attggaagaa 60

gctggtgaaa gcgtagcgtt gggcagaaaa cccgtcgcgg cagagtttcg ctggagggga 120

atgaattcga cagcgtttcg gttgagttgg gatgtgcgaa gactggttga gcgtcgcgca 180

aaatacattg aagtgcttta tgcgaaggtc ggggagccgg acaaatttaa gaccatgatc 240

gagcgcgtgg gcaagggaga agtcatagtt ggtgggttgc tccccgacac ggagtactcg 300

gttgaggcag cagccctcgc agatggtggc actgttttga atcaaaccta cttattcaaa 360

acaccgccta acaaggaaat cagacgaatg cccctcctct ag 402

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（多头带绦虫Tm82上游引物）

<400>

ccggaattct tggaagaagc tggtgaaagc gta 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（多头带绦虫Tm82下游引物）

<400>

ccgctcgagc tagaggaggg gcattcgtct ga 32

Claims

1.一种多头带绦虫绵羊脑多头蚴抗原基因Tm82，其特征在于Tm82所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

2.权利要求1所述的多头带绦虫绵羊脑多头蚴抗原基因Tm82的目标蛋白制备方法，其特征是以脑多头蚴cDNA表达文库为模板，用SEQ NO：3和SEQ NO：4为引物进行PCR扩增后进行纯化处理，再将经纯化处理后的产物与pGEX-4T-1质粒分别用EcoRⅠ、XhoⅠ进行双酶切，回收产物以T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，获得重组表达质粒pGEX-Tm82，再转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有100 μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基培养，收集菌体，将大量增菌诱导表达的菌体离心、富集细菌培养物沉淀，用pH7.4 PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次后超声裂解表达菌，分别收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式后用GST琼脂糖树脂纯化，得目标蛋白。

3.权利要求1所述的多头带绦虫绵羊脑多头蚴抗原基因Tm82用于制备脑多头蚴的免疫疫苗。