CN102604993A

CN102604993A - 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102604993A
Application number: CN2012100054746A
Authority: CN
Inventors: 高国; 舒特俊; 陈剑清; 张耀洲
Original assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guizhou Gui'an Precision Medicine Co ltd
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-01-10
Also published as: CN102604993B

Abstract

本发明涉及一种免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法及其产品，属于生物医药技术领域。本发明利用PCR技术在口服免疫佐剂基因下游连入连接肽序列片段，然后利用重叠延伸PCR技术将连有连接肽序列的口服免疫佐剂基因与蛋白抗原基因进行融合，然后构建融合基因的重组家蚕杆状病毒并利用家蚕生物反应器进行目的蛋白的表达。本发明采用家蚕生物反应器表达了口服免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白，不仅实现了蛋白的高效表达，而且将口服免疫佐剂与抗原蛋白融合表达作为分子内免疫佐剂增强了免疫效果。

Description

免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法，尤其涉及免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)由Barry J. Marshall和J. Robin Warren于1983年首次发现，是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的革兰氏阴性菌，是慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC) 将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。目前全球近50%的人口感染了幽门螺杆菌，在发展中国家其感染率可高达70%以上，严重影响了人类的健康。现有的治疗幽门螺杆菌的手段主要是联合应用抗生素及抑酸剂，但存在耐药性广泛，副反应大，治疗费用高且易复发等缺点。

免疫治疗可能是有效控制幽门螺杆菌的最有效、最有前景的方法之一，幽门螺杆菌疫苗的研制已经成为目前研究的热点。目前已发现尿素酶(UreA和UreB)、空泡毒素(VacA)、热休克蛋白(HspA和HspB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)、细胞毒素相关蛋白(CagA)、黏附素(Adhesin) 等亚单位蛋白或其融合蛋白均可以作为免疫原刺激机体产生保护性免疫反应，其中尿素酶B亚单位(UreB)由于缺乏尿素酶活性却保留了其免疫原性、在幽门螺杆菌中高度保守而被确定为幽门螺杆菌疫苗研究的首选抗原。为了增强幽门螺杆菌蛋白的免疫原性一般将其与粘膜佐剂联合应用，目前幽门螺杆菌疫苗常用免疫佐剂是霍乱毒素(Cholera toxin，CT)和大肠杆菌不耐热毒(Heat-labile enterotoxin，LT)，但都具有明显肠毒性，现在多采用CT的B亚单位(CTB)以及LT的B亚单位(LTB)代替全毒素作为免疫佐剂。

在口服蛋白亚单位疫苗生产中蛋白亚单位抗原的表达量成为制约其成本的关键因素，因此寻找低成本表达抗原蛋白的方法势在必行。目前家蚕生物反应器主要是利用家蚕杆状病毒表达系统实现对外源基因的表达。其优势主要有： 1)表达量高：利用杆状病毒polh基因和p10基因的强启动子驱动外源基因的高效表达；2)可容纳大的外源基因：杆状病毒基因组在大小上差异很大(88~165kbp)，病毒可以容纳较大的外源基因片段而不影响自身正常的复制和包装；3)适合于表达毒性蛋白：由于重组杆状病毒极晚期基因启动子驱动的外源基因的表达是在子代芽殖、有感染力病毒成熟之后进行的，因此，表达具有细胞毒性的蛋白不会影响病毒的复制；4)具转录、翻译后加工：家蚕杆状病毒表达系统具有很强的转录、翻译后加工能力，表达产物在结构、生物活性、免疫原性和糖基化修饰等方面与天然蛋白具有很强的相似性；5)安全性好：昆虫杆状病毒只在无脊椎动物细胞中复制，对脊椎动物和植物细胞而言并非病原体，因此昆虫杆状病毒表达系统对使用者是安全无害的(家蚕杆状病毒的表达宿主有家蚕细胞、家蚕幼虫和蚕蛹，但家蚕幼虫和蚕蛹使用范围较广，因其便于注射操作)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB), 该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5580。

上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)的制备方法，包括以下步骤：

(1)由PCR扩增的方法获得口服免疫佐剂CTB基因序列与幽门螺杆菌抗原蛋白ureB基因序列，并且在口服免疫佐剂CTB基因与抗原蛋白ureB基因之间加入一段连接肽序列Linker，构建CTB-Linker-ureB融合基因；

(2)步骤(1)所得CTB-Linker-ureB融合基因用BamH I和EcoR I进行双酶切后回收，连接到载体pBacPAK8，使该融合基因置于多角体蛋白基因启动子控制之下，转化TG₁大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到重组转移质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB)；

(3) 取步骤(2)所得的重组转移质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB)和线性化的家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染BmN细胞，通过空斑筛选法筛选阳性，即得到所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)。

上述步骤1)中利用PCR技术在口服免疫佐剂基因下游连入一段连接肽序列Linker：AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，然后利用重叠延伸PCR技术将连有连接肽序列的口服免疫佐剂基因与幽门螺杆菌抗原蛋白基因进行融合。

上述连接肽序列Linker是编码为(Gly₄Ser)_n的柔性肽段，其中1≤n≤6。

上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

上述蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

(2)针刺接种法接入家蚕蚕蛹或幼虫；

(3)收集表达的权利5所述蛋白。

本发明进一步提供上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB) 在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。

本发明还提供上述蛋白在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。

本发明具有以下有益效果：

(1)人们对家蚕的驯养已有数千年的历史，积累了丰富的经验，并且现代家蚕人工饲料养殖技术使得家蚕一年四季都可以养殖，大大降低了以家蚕幼虫和蚕蛹作为为宿主进行外源基因的表达的成本；

(2)抗原蛋白在家蚕生物反应器中高效表达，解决了口服蛋白亚单位疫苗生产中抗原蛋白需求量的制约瓶颈，而且将口服免疫佐剂与抗原蛋白融合表达作为分子内免疫佐剂增强了免疫效果；小鼠口服实验表明蚕蛹表达的融合蛋白在小鼠血清中产生了明显的免疫效应，为下一步利用蚕蛹生产幽门螺杆菌口服蛋白亚单位疫苗提供了基础。

(3)利用家蚕生物反应器将口服免疫佐剂蛋白与抗原蛋白融合表达，并在两者之间加入连接肽片段：融合蛋白中口服免疫佐剂作为分子内佐剂比单独应用更能增强抗原蛋白的免疫原性，并且连接肽片段保证了融合蛋白中两蛋白亚单位的构象不发生改变；本疫苗采用口服给药，减轻了注射给药的痛苦，且蚕蛹粉有促进蛋白抗原口服吸收的作用，增强蛋白抗原的免疫原性。

附图说明

图1为CTB基因PCR扩增的电泳分析图；M：DNA 标记；1：阴性对照; 2：PCR 产物；

图2为CTB-Linker PCR扩增的电泳分析图；M：DNA 标记；1：阴性对照； 2：PCR 产物；

图3 为ureB基因PCR扩增的电泳分析图；M：DNA 标记; 1：阴性对照；2: PCR 产物；

图4为CTB-Linker-ureBPCR融合的电泳分析图；M：DNA标记；1：阴性对照；2：融合PCR 产物；

图5为pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB)的PCR-双酶切鉴定图； M：DNA标记；1：PCR 产物；2：双酶切产物；

图6为BmNPV-(CTB-Linker-ureB)的PCR鉴定图；M：DNA标记; 1：阴性对照；2：引物为M13 F、M13 R的PCR产物；3：引物为CTB上游引物、M13 R的PCR产物；4：引物为CTB 上游引物、ureB下游引物的PCR产物；

图7为r(CTB-Linker-UreB) 融合蛋白在BmN细胞中表达产物的SDS-PAGE分析图；M：预染分子量标准蛋白；1：正常细胞总蛋白; 2：正常细胞上清；3：正常细胞沉淀；4：发病细胞总蛋白；5：发病细胞上清；6：发病细胞沉淀；

图8为 r(CTB-Linker-UreB) 融合蛋白在BmN细胞中表达产物的Western blotting分析图；M：预染分子量标准蛋白；1：正常细胞总蛋白；2：正常细胞上清；3：正常细胞沉淀；4：发病细胞总蛋白；5：发病细胞上清；6：发病细胞沉淀；

图9为r(CTB-Linker-UreB)融合蛋白在蚕蛹中表达产物的SDS-PAGE分析图；M：预染分子量标准蛋白 1：正常蚕蛹匀浆上清; 2：正常蚕蛹匀浆沉淀; 3：发病蚕蛹匀浆上清；4：发病蚕蛹匀浆沉淀；

图10为r(CTB-Linker-UreB)融合蛋白在蚕蛹中表达产物的Western blotting分析图；M：预染分子量标准蛋白；1：正常蚕蛹匀浆上清；2：正常蚕蛹匀浆沉淀；3：发病蚕蛹匀浆上清；4：发病蚕蛹匀浆沉淀；

图11为小鼠口服蚕蛹表达的r(CTB-Linker-UreB)融合蛋白后血清中特异性抗幽门螺杆菌UreB IgG抗体滴度图。

具体实施方式

应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

以下结合实施例对本发明做详细说明：本实例在意本发明技术方案为前提的条件下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程（以下所用抗体均为进口试剂，其他均为国产分析纯试剂）。

实施例1：CTB-Linker-ureB融合基因(如SEQ ID NO：1所示)的构建

首先利用重叠延伸PCR技术将口服免疫佐剂CTB基因和幽门螺杆菌ureB基因进行融合；为了保证融合基因表达后两蛋白亚单位空间结构不受影响，在CTB基因和ureB之间连入了

一段连接肽序列(Linker) (如SEQ ID NO：6所示)：

AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，编码(Gly4Ser)3的柔性肽段，保证融合蛋白中两蛋白亚单位空间结构不受影响。这一连接肽最初是由Husotn等人于1988年根据Fab片段X射线衍射分析资料设计，后来发现该肽段较长且柔软，能够降低融合蛋白中各个蛋白亚间的空间位阻，从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠而成为通用连接肽，广泛应用于融合蛋白的表达(图1、图2、图3、图4)。

1. CTB基因的扩增

根据GenBank登录号U25679.1公布的CTB的基因序列设计一对引物用于扩增CTB基因，并在上游引物(如SEQ ID NO：2所示)的5’端加入BamH I 酶切位点(下划线表示)。下游引物(如SEQ ID NO：3所示)带有连接肽的部分片段(划线部分表示)。

CTB上游引物：5’-CGCGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’；

CTB下游引物：5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCATTTGCCATACTAATTGCGG-3’；

利用设计的CTB引物，以重组杆状病毒BmNPV-CTB-INS（该重组杆状病毒已经由中国200310121132.1专利申请“表达CTB和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其应用”公开，并且在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCC No.1033) 基因组DNA为模板扩增CTB基因(见图1)，琼脂糖凝胶电泳回收CTB基因片段。

2. CTB-Linker基因的构建

设计一段连接肽序列:

AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，以CTB上游引物和此连接肽序列作为引物，以回收的CTB片段为模板进行PCR扩增（TOYOBO公司的KOD-plus），将连接肽序列连接在CTB基因的3’端，琼脂糖凝胶回收扩增的片段，即为连接有连接肽序列的CTB-Linker(见图2)。

3. ureB基因的扩增

根据GenBank登录AY714224.1公布的ureB的基因序列设计一对引物扩增ureB基因。上游引物(如SEQ ID NO：4所示)带有连接肽的部分序列(划线部分表示)；下游引物(如SEQ ID NO：5所示)的5’端加入EcoR I酶切位点(下划线表示)。

ureB上游引物: GGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTATTAGCAGAAAAGAATATG ；

ureB下游引物：CCGGAATTCCTAGAAAATGCTAAAGAGTTG；

利用设计的ureB引物，以重组杆状病毒BmNPV-UreB（苏州大学贡成良教授赠予，已由2009年中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集（2）中的“幽门螺杆菌尿素酶 B 亚单位在家蚕杆状病毒系统中的表达”公开）基因组DNA为模板扩增ureB基因(见图3)，琼脂糖凝胶电泳回收ureB基因片段。

4. CTB-Linker-ureB融合基因的获得

以CTB上游引物和ureB下游引物作为引物，以回收的CTB-Linker和ureB基因为模板进行重叠延伸PCR(见图4)，琼脂糖凝胶电泳回收扩增的片段，即为CTB-Linker-ureB融合基因(如SEQ ID NO：1所示)。

实施例2：重组转移质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB)的构建

对实施例1所得CTB-Linker-ureB融合基因的5’和3’端分别用BamH I酶和EcoR I酶(Fermentas公司)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后片段；同时用BamH I酶和EcoR I酶对pBacPAK8载体（Invitrogen公司）进行酶切并用琼脂糖凝胶电泳回收酶切后片段；然后用T4连接酶(Fermentas公司)将回收的融合基因连接到酶切后的pBacPAK8载体，使重组基因置于多角体蛋白基因启动子控制之下，转化TG₁大肠杆菌感受态细胞（Invitrogen公司），筛选阳性克隆，得到重组转移质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB) (见图5)，对其进行基因测序，由测序结果可知融合基因成功克隆至pBacPAK8载体。

实施例3：家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)的构建

1.线性化病毒DNA的获得

家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6（Clontech公司）接种培养的BmN细胞（Invitrogen公司），27℃培养72 h后，收集病毒培养液，提取Bm-BacPAK6病毒基因组DNA，并用Bsu36内切酶对Bm-BacPAK6病毒基因组进行酶切使之线性化。

2.重组转移载体质粒与线性化病毒DNA的共转染

(1) 将生长状态良好的BmN细胞铺于50 ml培养瓶中，27℃培养4 ~12 h使细胞贴壁；

(2) 取A离心管加入重组转移载体质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB) 5μl、线性化病毒DNA 20 μl (约1 μg)，用HBS（20mM HEPES, N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸；15mM NaCl）将总体积补足至50 μl，混匀；

(3) 取B离心管加脂质体10μl，用HBS将总体积补足至50μl；

(4) 将A和B混合均匀，室温放置15 min，吸去培养瓶中已贴壁细胞的上清，用无血清培养基(1×SF-900 II SFM(Invitrogen公司) )洗两次，每次2 ml；

(5) 加入2 ml无血清培养基，将上述的100μl混合液滴入，轻轻移动培养瓶使混合液均匀分布；加入2 ml无血清培养基，将上述的100μl混合液滴入，并轻轻转动培养瓶，混合液均匀分布；

(6) 27℃继续培养4~ 6天，在显微镜中能观察到细胞出现感染症状，将共转染细胞的培养液转接至另一瓶生长状态良好的细胞，待感染细胞破裂后，收集上清，并分装置于4℃保存。

3. 家蚕重组杆状病毒的筛选

(1)分别将1×10⁵个生长状态良好的家蚕细胞均匀铺于4个35 mm培养皿中，贴壁培养6~12 h用完全培养基（1×SF-900 II SFM :1×FBS, 1:10(v:v), Invitrogen公司）分别以10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释重组病毒液，吸去培养皿中的培养基，分别加入各稀释度的病毒液1 ml，27 ℃培养1 h；

(2)吸去感染液，将预先保温于40℃水浴中的2％低熔点琼脂糖和完全培养基（SF-900 II SFM :1×FBS，1:10（v:v），Invitrogen公司)按1:1(v:v)混合后，在每个平皿中各铺入2 ml混合液，待凝胶凝固后将平皿倒置27℃培养2-5天，其间每隔6 h需在显微镜下观察，以免多个空斑融合成片；

(3)在显微镜下观察空斑出现后，用蓝色记号笔在小培养皿上做好标记，再在超净台上用灭菌枪头挑出空斑，释放在200μl培养基中，取80μl接种于事先培养有BmN细胞的96空斑，并做好标记，继续培养34天，在出现明显感染症状的孔中加入1μl X-gal(Invitrogen公司)，27℃继续培养24h，挑选白色孔，进入下一轮空斑筛选，经过3~4轮的筛选后可获得纯化的该家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)。

4.家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)的鉴定

(1) PCR鉴定

提取重组杆状病毒基因组DNA，并以此为模板，分别以M13 F和M13 R（通用引物）、目的基因上游引物和M13 R、目的基因上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，根据扩增片段的大小判断是否阳性（见图6）。

(2) SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定

将经PCR鉴定呈阳性的家蚕重组杆状病毒接种BmN细胞，27℃培养72 h，待细胞发病（显微镜观察）后收集细胞并对细胞表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析，结果显示，在76kDa位置有特异性条带(见图7、图8)，说明该家蚕重组杆状病毒在家蚕BmN细胞中成功表达。

实施例4：免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗的获得

1. 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗的分离及纯化

测定实施例3所得家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB) 的滴度后接种家蚕蚕蛹或幼虫(品种为箐松×皓月)，蚕蛹发病后低温冻存，SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示，r(CTB-Linker-UreB)融合蛋白(如SEQ ID NO：7所示)在蚕蛹中成功表达(图9、图10)；ELISA检测结果显示，该融合蛋白在蚕蛹中的表达水平为0.12 mg/g蚕蛹。

将冻存的蚕蛹与磷酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)按500g:1L的比例用匀浆机进行匀浆，匀浆2 min, 冰浴2 min，重复操作10次；然后20℃，6000 rpm离心30min, 去除沉淀后将上清液用9层脱脂棉纱布过滤去除油脂，重复操作3次；然后4℃，12000 rpm 离心30 min, 去除沉淀后将上清液用9层脱脂棉纱布过滤进一步去除油脂，重复操作3次；将所得上清液用超滤系统30kDa超滤膜包超滤浓缩至200ml, 然后于冻干机中冻干后低温（-80℃）保存。然后，将蚕蛹冻干粉用磷酸盐缓冲液(pH7.4)以50mg:1ml比例溶解，采用ELISA法对融合蛋白进行定量。

2.口服疫苗的效果(小鼠口服实验鉴定融合蛋白的免疫原性)

ICR小鼠，健康雌性，6~8周龄，体重18~22 g，由天津市奥易德实验用品有限公司提供。将24只小鼠随机分为3组，Ⅰ组为正常蚕蛹粉对照组；Ⅱ组为UreB标准品对照组；Ⅲ组为r(CTB-Linker-UreB) 融合蛋白实验组。小鼠免疫前禁食禁水12h，饲喂针灌服胃酸中和液(0.2 M的碳酸氢钠溶液) 0.5 ml/只，30 min开始灌服抗原。标准品对照组口服UreB蛋白标准品200 μg/只(UreB标准品购自上海领潮生物科技有限公司，用磷酸盐缓冲液pH7.4稀释至200 μg/ml，小鼠灌胃1 ml/只)；r(CTB-Linker-UreB) 融合蛋白实验组口服融合蛋白蚕蛹冻干粉2 g(约含200 μg融合蛋白，溶于1ml 磷酸盐缓冲液pH7.4中，小鼠灌胃1 ml/只)；正常蚕蛹粉对照组灌服2 g正常蚕蛹冻干粉(正常蚕蛹冻干粉处理方法与融合蛋白蚕蛹冻干粉处理方法相同)。小鼠每周免疫1次，共免疫4次。第一次免疫前眼底静脉丛取血作为阴性血清对照；以后每次免疫前眼底静脉丛取血，共取4次。每次所取血液37℃孵育30 min, 3000 g离心10 min, 收集血清于-20℃保存备用。

ELISA分析血清中抗体滴度，鉴定r(CTB-Linker-UreB) 融合蛋白的免疫原性，步骤如下：

(1)将UreB蛋白标准品用ELISA包被液(0.05 M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至5 μg /ml，200 μl/孔，包被96孔板， 4℃孵育过夜；

(2)用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗板(每次5 min，3次)；

(3)用1％BSA的磷酸盐缓冲液(pH7.4)37℃孵育1 h;

(4)用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗板(每次5 min，3次)；

(4)小鼠血清用磷酸盐缓冲液(pH7.4)以1：50(v:v)比例稀释后，再以1：3(v:v)比例系列（初始稀释比例是1:50，接下来按1:3比例稀释系列后就是1:150，1:450，1:1350，1:4050，1:12150，共6个梯度）稀释，37℃孵育1 h;

(5)用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗板(每次5 min，3次)

(6)用磷酸盐缓冲液(pH7.4)按1：5000（v:v）比例稀释辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG二抗，200 μl/孔，37℃孵育1 h;

(7)用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗板(每次5 min，3次);

(8)加底物：每孔加入TMB显色液（Solarbio公司）200μl，避光显色10 min;

(9)终止反应：每孔加入50 μl，2 M硫酸终止反应;

(10)酶标仪测定吸光值OD₄₉₂(图11)。

ELISA结果分析：小鼠口服蚕蛹表达的r(CTB-Linker-ureB)融合蛋白后血清中特异性抗幽门螺杆菌UreB抗体滴度分析显示蚕蛹表达的融合蛋白有较好的免疫原性，可以作为幽门螺杆菌口服疫苗的抗原。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津耀宇生物技术有限公司

<120> 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法

<130> 111632-I-CP-TJYU

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2118

<212> DNA

<213> CTB-Linker-ureB融合基因

<400> 1

atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60

ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatatatacg 120

ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180

attacgttta agaatggtgc aatttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240

tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 300

gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 360

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agcagaaaag aatatgtttc tatgtatggc cctactacag gcgataaagt gagattgggc 480

gatacagact tgatcgctga agtagaacat gactacacca tttatggcga agagcttaaa 540

ttcggtggcg gtaaaaccct aagagaaggc atgagccaat ctaacaatcc cagcaaagaa 600

gaactggatt taatcatcac taacgcttta atcgtggatt acaccggtat ttataaagcg 660

gatattggta ttaaagatgg caaaatcgct ggcattggta aaggcggtaa caaagacatg 720

caagatggcg ttaaaaacaa tcttagcgtg ggtcctgcta ctgaagcctt agccggtgaa 780

ggtttgatcg taactgctgg tggtattgac acacacatcc acttcatctc cccccaacaa 840

atccctacag cttttgcaag cggtgtaaca accatgattg gtggcggaac tggccctgct 900

gatggcacta acgcaaccac tatcactcca ggcagaagaa atttaaaatt catgctcaga 960

gcggctgaag aatattctat gaactttggt ttcttggcta aaggtaacgt ttctaacgat 1020

gcgagcttag ccgatcaaat tgaagctggt gcgattggct ttaaaatcca cgaagactgg 1080

ggtaccactc cttctacaat caatcatgcg ttagatgttg cagacaaata cgatgtgcaa 1140

gtcgctatcc acacagacac tttgaatgaa gccggttgcg tagaagacac tatggcagcc 1200

attgccggac gcactatgca cactttccac actgaaggcg ctggcggcgg acacgctcct 1260

gacattatta aagtggccgg tgaacacaac attctacctg cttccactaa ccccactatc 1320

cctttcaccg tgaatacaga agccgaacac atggacatgc ttatggtgtg ccaccacttg 1380

gataaaagca ttaaagaaga tgttcagttc gctgattcaa ggatccgccc tcaaaccatt 1440

gcggctgaag acactttgca tgacatgggg attttctcaa tcaccagttc tgactctcaa 1500

gctatgggtc gtgtgggtga agttatcacc agaacttggc aaacagctga caaaaacaaa 1560

aaagaatttg gccgcttgaa agaagaaaaa ggcgataacg acaacttcag gatcaaacgc 1620

tacttgtcta aatacaccat taacccagcg atcgctcatg ggattagcga gtatgtcggt 1680

tctgtagaag tgggcaaagt ggctgacttg gtattgtgga gtccagcatt ctttggtgtg 1740

aaacccaaca tgatcatcaa aggcggattc attgcattga gtcaaatggg tgatgcgaac 1800

gcttctatcc ctaccccaca accggtttat tacagagaaa tgttcgctca tcatggtaaa 1860

gctaaatacg atgcaaacat cacttttgtg tctcaagcgg cttatgacaa aggcattaaa 1920

gaagaattag ggcttgaaag acaagtgttg ccggtaaaaa attgcagaaa catcactaaa 1980

aaagacatgc aattcaacga cactaccgct cacattgaag tcaatcctga aacttaccat 2040

gtgttcgtgg atggcaaaga agtaacttct aaaccagcca ataaagtgag cttggcgcaa 2100

ctctttagca ttttctag 2118

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> CTB上游引物

<400> 2

cgcggatcca tgattaaatt aaaatttgg 29

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> CTB下游引物

<400> 3

accgccggat ccaccgccac catttgccat actaattgcg g 41

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> ureB上游引物

<400> 4

ggtggatctg gtggcggcgg atctattagc agaaaagaat atg 43

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> ureB下游引物

<400> 5

ccggaattcc tagaaaatgc taaagagttg 30

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Linker

<400> 6

agatccgccg ccaccagatc caccaccgcc ggatccaccg ccacc 45

<210> 7

<211> 705

<212> PRT

<213> r(CTB-Linker-ureB)融合蛋白

<400> 7

Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu

20 25 30

Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys

50 55 60

Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

65 70 75 80

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala

85 90 95

Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105 110

Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ser Arg Lys Glu

130 135 140

Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro Thr Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly

145 150 155 160

Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly

165 170 175

Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser

180 185 190

Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Asn

195 200 205

Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile

210 215 220

Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met

225 230 235 240

Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala

245 250 255

Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His

260 265 270

Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly

275 280 285

Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn

290 295 300

Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg Arg Asn Leu Lys Phe Met Leu Arg

305 310 315 320

Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn Phe Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn

325 330 335

Val Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile

340 345 350

Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly Thr Thr Pro Ser Thr Ile Asn

355 360 365

His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His

370 375 380

Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala

385 390 395 400

Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly

405 410 415

Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu

420 425 430

Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala

435 440 445

Glu His Met Asp Met Leu Met Val Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile

450 455 460

Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile

465 470 475 480

Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser

485 490 495

Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr

500 505 510

Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu

515 520 525

Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys

530 535 540

Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly

545 550 555 560

Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala

565 570 575

Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala

580 585 590

Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro

595 600 605

Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp

610 615 620

Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys

625 630 635 640

Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg

645 650 655

Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile

660 665 670

Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr His Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val

675 680 685

Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val Ser Leu Ala Gln Leu Phe Ser Ile

690 695 700

Phe

705

Claims

1.一种家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB), 该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5580。

2.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

3.根据权利2所述的方法，其特征在于，步骤1)中利用PCR技术在口服免疫佐剂基因下游连入一段连接肽序列Linker：

AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，然后利用重叠延伸PCR技术将连有连接肽序列的口服免疫佐剂基因与幽门螺杆菌抗原蛋白基因进行融合。

4.根据权利3所述的方法，其特征在于，所述连接肽序列Linker是编码为(Gly₄Ser)_n的柔性肽段，其中1≤n≤6。

5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

6.一种权利要求5所述蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(2)针刺接种法接入家蚕蚕蛹或幼虫；

(3)收集表达的权利5所述蛋白。

7.一种权利1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。

8.一种权利要求5所述的蛋白在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。