CN1800406A - 一种用转基因植物表达医用蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

技术领域：基因工程领域本发明要解决如何在植物体特定组织中表达医用蛋白，提高医用蛋白表达量，并保证医用蛋白免疫活性的问题。本发明以防治Hp感染为例，采用植物生物反应器原理，将与Hp免疫原性相关Hp cagA或ureB和粘膜免疫佐剂CTB融合基因转入水稻基因组中，并利用特异表达启动子使在转基因水稻籽粒中大量、稳定表达，通过品种选育和蒙古沙鼠免疫试验，获得含有高免疫活性医用蛋白的转基因水稻，作为防治Hp感染的疫苗来源。今后，人们尤其是高危人群，在医生指导下，食用一定量的功能性大米或其制品，以达到根治和预防Hp感染、降低Hp相关性疾病的发病率、增强预防胃癌能力的目的。

Description

一种用转基因植物表达医用蛋白的方法

技术领域    基因工程领域

背景技术    1，植物生物反应器是国际生物工程药物研究的前沿领域。通过转基因技术，以农作物为表达系统生产试剂和药物、单克隆抗体、酶制剂和结构蛋白、抗原(疫苗)等，安全廉价，与微生物和转基因动物相比，具有明显的优越性。80年代提出利用转基因植物生产人类所需要的各种药物原料的分子农业(molecular farming)的概念，目前部分产品已经上市并赢利。1995年《Science》发表利用转基因植物生产口服疫苗的设想。植物生物反应器打破了传统的医药生产模式，开创了生物医药工程学和植物基因工程交叉的新领域，具有良好的产业化前景。

2，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是广泛感染于人类消化道的微需氧菌，已确认是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子，并被WHO列为与胃癌发生密切相关的病原菌，认为是人类第I类致癌原(Group I carcinogen)。由于常规药物治疗存在副作用大，耐药菌株逐渐增多等缺点。因此，疫苗的使用将是预防Hp感染的最有效方法。幽门螺杆菌基因工程疫苗一直是国内外研究的热点，但迄今尚无产品问世。通过转基因技术，用植物作为生物反应器大量生产廉价、安全的口服Hp疫苗不仅具有较高的科研价值，而且具有巨大的经济效益和社会效益。Hp存在多种保护性抗原，如尿素酶(urease)、细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin assiociated protein，CagA)、空泡毒素A(vaculoting cytotoxinA，VacA)等，其中尿素酶主要活性部位存在于细菌表面，表达量高且高度保守，尿素酶B亚单位因具有无毒性和很强的免疫原性，而成为Hp疫苗有效成份的候选者。霍乱毒素B亚单位(CTB)是霍乱毒素(CT)的免疫原部分，霍乱毒素及其B亚单位是迄今为止发现的最强的、能刺激机体粘膜反应的免疫原。据文献报道，以CTB为免疫佐剂配合Hp相关抗原口服免疫蒙古沙鼠，能使其产生针对Hp感染的保护性免疫。

3，我国是慢性胃疾病的高发国家，胃癌位居我国恶性肿瘤死亡的前列，因此，预防和根治Hp感染对大幅度降低慢性胃病及胃癌的发生，保护人民身体健康具有极其重要的意义。病理学研究表明，细胞毒素相关蛋白A(Cag A)是Hp菌株具有高毒力的标志。Cag A蛋白具有免疫保护作用，是Hp重要的保护性蛋白抗原。但是目前还无法人工培养Hp和制备防治Hp的免疫药物。本发明采用植物生物反应器的原理，以农杆菌Ti质粒为载体，将外源基因Hp cagA或ureB基因和粘膜免疫佐剂CTB融合基因转入水稻基因组中，使转基因植物大量、稳定表达Hp的CagA或ureB蛋白抗原，在蒙古沙鼠模型中验证其防治Hp感染的作用。

发明内容    以防治Hp感染为例，将与Hp免疫原性相关基因导入水稻，并利用特异表达启动子使基因在水稻籽粒中表达，通过选育和蒙古沙鼠免疫试验，获得具有能够表达免疫活性医用蛋白的水稻品系。

●构建不含抗生素选择标记的高效、特异和安全的表达载体。

●攻克植物生物反应器的关键技术，建立了功能性作物的技术平台。

●研究目的基因表达产物(免疫蛋白含量)随世代和环境变化的规律。

●选育具有较高免疫活性的株系进行生产技术的公关。

具体实施方式

                         实施例1

以通过农杆菌介导法将CagA和CTB融合基因导入水稻为例。本实施例不排除其它的试验方法和措施，包括试验材料等。

一、表达载体的构建

1.根据genebank中公布的CagA以及CTB基因的序列分别设计引物

CagA-F 5-’CGCGAGGATCCATGACTAACGAAACTATTGA-3’(BamHI)；

CagA-R 5-′GCGACGGtaCCTTAAGATTTTTGGAAACCAC-3′(KpnI)；

CTB-F 5-’CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’(KpnI)；

CTB-F 5-’CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’(KpnI)；

CTB-R 5-’GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3’(XhoI，BamHI)。

CTB-R 5-’GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3’(XhoI，BamHI)。

从H.pylori DS115DNA中扩增CagA和CTB基因的全序列。为下一步克隆方便，在各引物的5’端设计酶切位点。

2.BamH+KpnI双酶切CagA基因纯化片段和中间载体pbluescriptII KS(+)，回收约3.4kb的CagA基因片断及约3kb的中间载体pbluescriptII KS(+)片断，定量按3∶1的比例将两个片断混和进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌。挑取重组菌株，提取质粒酶切鉴定。得到重组中间质粒KS-CagA。

3.KpnI+XhoI双酶切CTB基因纯化片断和质粒KS-CagA，回收约400bp的CTB基因片断及约6.4kb的KS-CagA质粒片断，定量按3∶1的比例将两个片断混和进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌。挑取重组菌株，提取质粒酶切鉴定。得到含有CagA-CTB串连基因的重组中间质粒KS-CagA-CTB。

4.BamHI单酶切中间载体KS-CagA-CTB和经改造的pCAMBIA1301双元载体，回收约3.8kb的CagA-CTB串连基因片断和约12kb的pCAMBIA1301双元载体片断，将pCAMBIA1301双元载体片断进行去磷酸化，定量按3∶1的比例将两个片断混和进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌。挑取重组菌株，提取质粒酶切鉴定。最终得到可用于农杆菌介导转化植物的双元表达载体p1301-CagA-CTB。

二、农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平、卡那霉素平板上划线，28℃培养。挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。加入10ml预冷的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。加入4ml预冷的含15％甘油的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

三、双元载体转化农杆菌EHA105

取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min。再在37℃水浴5min或42℃水浴lmin，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml卡那霉素的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。也可以将上述双元载体质粒DNA用电激法导入EHA105感受态细胞，28℃培养到形成单菌落。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液进行PCR鉴定。

四、根癌农杆菌介导的水稻转化

准备开花后12-15天左右的脆茎水稻未成熟种子，经表面灭菌后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB)上，暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基(NB)上，在相同条件下继代培养5天左右；或者准备水稻成熟胚，同样条件下诱导愈伤组织，挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织在适量农杆菌悬浮液(OD 0.3-0.5)中浸泡15-20min，转入固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/l潮霉素的选择培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的选择培养基上继续筛选14天至长出抗性愈伤组织。从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至12-15hrs/日的光照条件下培养，经过15-25天左右，长出绿点。30-40天后进一步分化出小苗。当抗性愈伤组织分化的苗或芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右，在温室内移栽入土。

其中：

YM(液体)培养基KH₂PO₄0.5g/l+甘露醇10g/l+谷氨酰胺2g/l+NaCl0.2g/l+MgSO₄0.2g/l+酵母浸膏0.3g/l，pH 7.0。

诱导培养基MS(籼稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe盐+B5微量+B5有机+2，4-D 1.5-4.5mg/l+脯氨酸300-1000mg/l+谷氨酰胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+麦芽糖/蔗糖20-30g/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH5.8。

继代培养基    同诱导培养基，但是2，4-D改为2.0-3.0mg/l。

共培养(固体)培养基    MS(籼稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe盐+B5微量+B5有机+2，4-D 2.0-3.0mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+肌醇500-2000mg/l+乙酰丁香酮100μM+麦芽糖/蔗糖20-30g/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH5.5。

(液体共培养培养基无Gelrite)。

选择培养基    MS(籼稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe盐+B5微量+B5有机+2，4-D 2.0-3.0mg/l+脯氨酸300-500mg/l+谷氨酰胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000m/l+麦芽糖/蔗糖20-30g/l+头孢霉素250mg/l+潮霉素50mg/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH 5.8。

分化培养基    MS(籼稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe盐+B5微量+B5有机+NAA 0.1-0.5mg/l+KT 4-8mg/l+脯氨酸300-500mg/l+谷氨酰胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+麦芽糖/蔗糖20-30g/l+头孢霉素250mg/l+潮霉素50mg/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH 5.8。

生根培养基    1/2 MS/N6大量+MS-Fe盐+B5微量+蔗糖10-20g/l+琼脂0.8％，pH 5.8。

五、转基因植株的检测和选育

在转基因植株(T0)成活后，取样进行PCR检测，保留PCR阳性的植株，常规管理。PCR检测是任何分子生物学实验室都能进行的基本检测技术。转基因株系的提纯和选育同时进行。

方案1、取转基因阳性植株(T0)的穗子进行花药培养，花药培养的技术已经得到广泛应用，一般实验室和技术人员都可操作，具体方法见：中国水稻科学，1993，7：227-231；1996，10：37-42或者Plant Breeding，1996，115：295-300。花药培养再生植株按单株采收种子。每株系取50-100粒种子按株系在含50mg/l的潮霉素水溶液中发芽，考查发芽率。选发芽率和对照相仿的株系的发芽种子播种。单本或者多本插，常规管理，以原始亲本为对照。分子检测和蒙古沙鼠免疫试验。

方案2、转基因阳性植株(T0)按单株采收种子。每株系取50-100粒种子(T1)在含50mg/l的潮霉素水溶液中发芽，考查发芽率，以原始亲本为对照。选发芽率约为对照3/4的株系的发芽种子播种。单本或者多本插，常规管理。T2代试验，对发芽率和对照无异的株系进行检测和蒙古沙鼠免疫试验。种子在含50mg/l的潮霉素水溶液中发芽，发芽率正常的株系进入新品种的选育程序。

六、Western Blot检测方案

1.将目的基因与原核表达载体pSBETSH相连接，连接产物转入大肠杆菌TG1，分别用PCR和酶切的方法筛选阳性克隆。

2.将构建好的原核表达载体转入表达菌株BL21(DE3)pLysS，经PCR验证后用于诱导表达。挑取单个阳性菌落到5ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜。次日以1∶100稀释到5ml新鲜的含Kan的LB液体培养基中，继续培养约2hrs，取1ml作为对照。再在剩余培养液中加IPTG至终浓度达到1mmol/l，诱导表达培养2hrs后取菌液1.5ml，离心收集菌体沉淀，用于SDS-PAGE检测。

3.将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)plysS，IPTG诱导，进行表达检测。经IPTG诱导后的菌株会出现一条非常明显的蛋白条带，与预期融合蛋白的分子量大小一致，而在空载菌诱导中没有此蛋白条带出现。不诱导的重组质粒菌中虽有此蛋白带出现，但条带比经过诱导的重组质粒菌条带要淡。诱导的表达菌株经超声波裂解后的上清中有很浓的表达带，沉淀中虽有相应的条带，但比上清要弱得多，表明所表达的融合蛋白大部分是可溶的。

4.采用SDS-PAGE，层析等方法对目的蛋白进行纯化。取一份蛋白放入研钵，加一定量的生理盐水充分研磨，用注射器注射小鼠，每只小鼠每次注射0.5ml。每隔7天免疫一次，第三次免疫后3天断头取血。血液4℃放置8hrs，14000rpm离心5min，收集上层血清。采用吸附的方法去除非目的蛋白的抗体。

5.提取转基因植物的蛋白质，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，再分别用原核表达的蛋白质和标准蛋白作为对照。SDS-PAGE分离后的凝胶(不染色)置于转移缓冲液中(含20％甲醇和0.037％SDS的Tris-Gly缓冲液)浸泡30min，然后将已浸泡过的凝胶，硝酸纤维滤膜，滤纸及海绵依次叠放在支架上。转移2---5hrs，转移完成后，用蒸馏水冲洗硝酸纤维素膜。把硝酸纤维素膜放入培养皿中，加入封闭液，在摇床上平台上于室温封闭1hr，弃去封闭液，按0.1ml/cm²的量加入用封闭液稀释的第一抗体(鼠抗血清)。在室温下反应2hrs。放射自显影：曝光3min至10min。显影后清水漂洗，再定影。

实施例2

以通过基因枪轰击法将UreB+CTB融合基因和CagA+CTB融合基因同时导入水稻中花11为例。本实施例不排除其它的试验方法和措施，包括试验材料等。

一、表达载体的构建

本试验采用分别构建UreB+CTB融合基因表达载体和CagA+CTB融合基因表达载体

(一)UreB+CTB融合基因表达载体的构建

1.合成有关引物，序列为：

CTB 5’primer： 5’-GGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’

CTB 3’primer： 5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCATTTGCCATACTAATTGCGG-3’

ureB 5’primer：5’-GGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3’

ureB 3’primer：5’-TGCACTGCAGCTAGAAAATGCTAAAGAGTTG-3’

Linker：5’-AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC-3，

Wx pro 5’primer：5’-CCCGAGCTCCACGTCAGATCGAGACCAAG-3’

Wx pro 3’primer：5’-GTAATTGTTGTAAAAATAGGTTGTCTAGCTGTTGCTGT-3’

ΩK 5’primer：5’-TATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAA

                   CAACATTACAATTACTATTTAC-3’

ΩK 3’primer：5’-CCCGGTACCCGCCATGGTTTATTGTAAATAGTAATTGTA

                   ATGTTGTTTGTTG-3’

NOS ter 5’primer：5’-CGCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAAT-3’

NOS ter 3’primer：5’-CGCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGAT-3’

2.PCR法构建CTB-ureB融合基因

从H.pylori DS115中抽提H.pylori DNA，吸取少量抽提产物和少量含CTB基因的质粒pGEM-CTB，反应体系中加入CTB 5’primer、Linker和ureB 3’primer三条引物，扩增获得CTB-ureB融合基因。

3.PCR法改造Wx pro序列，构建Wx pro-ΩK融合序列

ΩK5’和3’引物直接退火延伸获得产物ΩK。以质粒p13W4为模板，Wxpro5’primer和Wxpro 3’primer为引物，进行PCR反应，获得Wxpro-ΩK融合序列。

4.PCR法合成NOS终止子序列

在50μl体系中，加入p13W4和其它各组分，进行PCR反应，

5.CTB-ureB融合基因的克隆

纯化后的CTB-ureB PCR产物用Pst I和Kpn I双酶切，然后与用同样酶切的pUCl9连接，获得CTB-ureB融合基因重组子pUCU。

6.CTB-ureB融合基因植物表达载体的构建

用Hind III和Pst I双酶切p13W4中扩增得到的NOS终止子序列，与用相同酶切的pCAMBIA1300连接，得到质粒pCN。从质粒pUCU上用Pst I和Kpn I切下CTB-ureB片段，然后与用相同酶切的pCN连接，获得质粒pCUN。再用Sac I和Kpn I双酶切pCUN和Wx pro-ΩK，最后进行连接，得到质粒pWCUN，完成CTB-ureB融合基因植物表达载体的构建。

(二)UreB+CTB融合基因表达载体的构建同实施例1。

二、表达载体转化大肠杆菌和质粒的提取

1.感受态细胞的制备

电击转化用感受态细胞的制备：从LB培养基(Tryptone 10g/l，Yeast extract5g/l，NaCl 5g/l，琼脂20g/l，pH 7.0)平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于装有50ml LB液体培养基的250ml的三角瓶中，37℃振荡培养12-16hr，直至对数生长后期。从该菌悬液中取出2.0ml，转入装有200ml LB液体培养基的500ml的细菌培养瓶中(按1∶100的体积比例加入)，37℃再振荡培养大约3hr至OD600达到0.5左右。将培养液转入离心管(250ml平底离心管)，冰上放置10min，然后4℃，4,000g离心15min(水平转头最好)，尽量去净上清液。加入200ml(同原菌液等体积)灭菌预冷的10％的甘油，轻轻颠倒混匀后，4℃，4,000g离心15min。倒掉上清，将沉淀用100ml(原菌液体积的1/2)灭菌预冷的10％的甘油洗一遍。4℃，4,000g离心15min，将沉淀用50ml(原菌液体积的1/4)灭菌预冷的10％的甘油再洗一遍，倒掉上清，加入10ml左右预冷的10％甘油，混匀后迅速分装到EP管中，每管40μl，迅速放入液氮中速冻，最后放于-80℃备用。

也可以制备用于热击转化的感受态细胞：菌的活化和菌液培养同前，200ml培养好的菌液冰上放置10min，然后于4℃，4,000g离心5min，加入40ml冰冷的CaCl₂溶液(0.1M CaCl2，0.01M Tris，pH 7.0，10mM DTT)轻轻悬浮沉淀，混匀后冰浴20min。4℃，4,000g离心5min，加入4ml冰冷的0.1M CaCl₂溶液轻轻悬浮沉淀，混匀后冰浴2-5hr。加灭菌甘油至总体积的15％(v/v)，混匀后冰浴12-18hr。第二天取出混匀后迅速分装到EP管中，每管100μl，放入液氮中速冻，最后放于-80℃备用。

2.转化

连接产物用于电击转化前要经过乙醇沉淀，70％乙醇清洗，真空干燥后溶于4μl无菌ddH₂O。电击转化具体步骤如下：打开电击转化仪，将参数设置为电压2.5KV，电容25μF，电阻200Ω。从-80℃冰箱中取出感受态细胞，放置冰上，待其融化后，加入2μl连接产物，快速轻轻吸吐混匀，冰浴1min。将上混合物转入-20℃预冷的电击转化杯中(加后轻甩，使菌液铺满杯底)，用吸水纸将杯壁外的水擦净，电击。取出转化杯，立即加入1ml SOC培养基(LB+10mM MgCl₂+10mM MgSO₄+20mM过滤除菌的葡萄糖)并混匀，将上述混合物转入一灭菌的离心管中，37℃，200rpm振荡培养1hr，取200μl涂板。

连接产物可直接用于热击转化，从-80℃取出感受态细胞，放置冰上，待其融化后，将连接产物全部加入其中，快速轻轻吸吐混匀，冰浴30min。于42℃水浴中放置1min，取出冰浴2min左右。加入500μl SOC培养基，37℃，200rpm振荡培养1hr。取200μl涂板。

3.重组克隆的筛选与鉴定

用无菌牙签挑取转化后生长的单菌落接种于含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养16hr，用于质粒提取。然后通过酶切质粒、电泳检测，对重组转化子进行鉴定。

4.质粒的提取

将过夜培养的细菌转入1.5ml EP管，13,000rpm离心30s收集菌体；倒掉大部分上清，留约50-100μl(包括沉淀的菌体)；加300μl TENS(含有0.1M NaOH和0.5％SDS的TE缓冲液)，涡旋混和直至混合物发粘；加入150μl 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀；13,000rpm离心10min，取上清，加入900μl无水乙醇，混匀；放置-20℃ 30min；13,000rpm离心5min，用70％的乙醇将沉淀洗两遍，真空干燥后溶于适量的TE缓冲液。

三、基因枪轰击导入外源基因

取开花后12-15天左右的水稻未成熟种子，经表面消毒后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB)上，暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基(NB)上，在相同条件下继代培养5天左右。将愈伤组织转移到高渗培养基上，愈伤组织紧密地排在培养皿的中央，培养过夜。

称取60mg直径1μm的金粉于1.5ml的离心管内，加1ml无水酒精，振荡1min，10000rpm离心10sec，弃上清，重复一次，将金粉悬浮于1ml无菌水中，-20℃保存。吸取50μl金粉悬浮液，加20μl 0.1M亚精胺，50μl 2.5M CaCl₂，2.5μg UreB+CTB融合基因表达载体DNA和2.5μg CagA+CTB融合基因表达载体DNA。振荡3min，10000rpm离心20sec，弃上清，无水酒精漂洗2次，加60μl无水酒精定容。取20μl金粉悬液置于1100psi型的可裂膜上，晾干后用BiolisticTM PDS-1000基因枪，真空度28，压力1100psi轰击愈伤组织。每皿愈伤组织轰击2次。

轰击后的材料转入新鲜配制的继代培养基(NB)上黑暗恢复培养。2-7天后转入含有50mg/l潮霉素的选择培养基上培养抗性愈伤，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的选择培养基上继续筛选14天至长出抗性愈伤组织。从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至12-15hrs/日的光照条件下培养，经过15-25天左右，长出绿点。30-40天后进一步分化出小苗。当抗性愈伤组织分化的苗或芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右，在温室内移栽入土。

其中：诱导培养基、继代培养基、选择培养基、分化培养基和生根培养剂与例1的相同，高渗培养基为诱导培养基+2，4-D 1.5-4.5mg/l+0.5mol/l甘露醇，pH 5.8。

转基因植株的检测和选育可以与例1的相同，分子检测后挑选同时检出UreB和CagA的单株或者株系供品种选育。

                           实施例3

以通过花粉管导入法将含UreB+CTB融合基因和CagA+CTB融合基因的双价基因导入为例。本实施例不排除其它的试验方法和措施，包括试验材料等。

一、双价基因表达载体的构建

构建方法如例1和例2，区别是将两个融合基因构建到同一个表达载体中。

二、表达载体转化大肠杆菌和质粒的提取

1.感受态细胞的制备

与例2的相同。

2.转化

与例2的相同。

3.重组克隆的筛选与鉴定

与例2的相同。

4.质粒的提取

与例2的相同。

三、花粉管导入外源基因

本操作在水稻(中花11号)抽穗开花时进行，事先需要观察中花11号在当地的始花时间和扬花高峰时间。在清晨水稻始花前挑选当天将有大约20个小穗开花的穗子，剪去已经开花的所有小穗。在水稻扬花的高峰期，剪去全部没有开花的小穗。1hrs后，每个小穗剪去大约2/3的内颖，柱头和约1/3的花柱，保留外颖。用移液枪将10μl质粒DNA滴在花柱的切口上，质粒DNA的浓度为50-300μg/ml。1hrs后用同样体积和浓度的质粒DNA再滴一次，然后套袋并挂牌。25-30天后采收穗子脱粒，种子(T0)干燥后保存。由T0种子长出的水稻植株称为T1代植株。

转基因植株的检测和选育可以与例1的相同。分子检测后挑选同时检出UreB和CagA的单株或者株系供品种选育。

本发明的预期效果

1.应用含有与Hp免疫原性相关基因的Ti载体已经成功地转化了水稻，，说明该Ti载体具有很好的实用性。

2.转基因水稻可以稳定表达与Hp免疫原性相关基因，

蒙古沙鼠口服后可产生相关的抗体。

Claims (7)

1、一种用转基因植物表达医用蛋白的方法，其特征是以防治Hp感染为例，将与Hp免疫原性相关基因导入水稻，并利用特异表达启动子使基因在水稻籽粒中表达，通过品种选育和蒙古沙鼠免疫试验，获得具有能够表达免疫活性医用蛋白的水稻。

2、如权利要求1所述的方法，其特征是所述的医用蛋白可以是CagA(细胞毒素相关蛋白A)、ureB(尿素酶B亚单位)、CagA与免疫佐剂CTB(霍乱毒素B亚单位)的融合蛋白、ureB与CTB的融合蛋白。

3、如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的导入采用农杆菌转化、基因枪轰击、原生质体培养或花粉管导入的方法。

4、如权利要求3所述的方法，其特征是所导入的基因为单价基因、双价基因或多价基因。

5、如权利要求4所述的方法，其特征是所述的选育是对转基因植物直接进行选育或以转基因植物为亲本进行的杂交转育。

6、如权利要求4或5所述的方法，其基因表达的检测方法为Westernblotting检测。

7、如权利要求4或5或6所述的方法，其特征是所述的免疫活性试验是采用蒙古沙鼠的免疫试验。