CN1456669A - 利用转基因生菜、番茄和烟草生产人胰岛素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用转基因生菜、番茄和烟草做为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物偏爱密码子的原则来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在C端加上KDEL的内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。将该基因置于CaMV 35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入生菜、番茄和烟草中，在生菜、烟草的叶片和茎中表达人胰岛素，在番茄的果实中表达人胰岛素。这种能制造人胰岛素的生菜和番茄不仅可以方便地成为一种口服产品，用于防治某些胰岛素依赖的和自体免疫障碍的糖尿病，而且可以从中提纯出人胰岛素做成注射用的剂型。

Description

利用转基因生菜、番茄和烟草生产人胰岛素的方法

本发明提供了一种利用生菜、番茄和烟草做为植物生物反应器来生产人胰岛素的方法。涉及按照植物偏爱密码子设计的人工合成的人胰岛素的DNA序列，包含所说的DNA序列的植物表达载体，用所说的植物表达载体转化植物愈伤组织的方法，以及由此产生的表达人胰岛素的转基因植物，特别是在叶片和茎中大量表达人胰岛素的转基因生菜、烟草和在果实中大量表达人胰岛素的转基因番茄。

生物反应器是近来未许多生物技术研发部门十分关注的领域。诸如奶牛、奶山羊乳腺生物反应器生产人的生长因子。在植物生物反应器研究中利用马铃薯块茎生产乙肝疫苗的研究受到广泛的重视。生菜和番茄做为可生食的蔬菜或果品，用它来生产口服的多肽类药物具有很大的应用潜力。人胰岛素对于胰岛素依赖的尿病患者的治疗是十分重要的。某些糖尿病患者的代谢调节与自体免疫功能相关。

口服胰岛素已被证明对某些类型的尿病治疗是有效的(Reddy S et at，Pancreas2000，20(1)：55-60；Ploix C et at，Diabetes 1999，48(1)2150-6；Ramiya VK，MaclarenNK，Horm Res 1997，48 suppl 4：67-70)。对于I型糖尿病的疗法，现在普遍使用的有两种，一种是注射胰岛素，另一种是移植。然而，注射胰岛素由于并非模仿胰腺β细胞分泌胰岛素的一般过程，因此只能够控制病情的发展，而不能够使疾病的状况有所改善，并且有可能引起视神经萎缩、皮肤过敏和神经痛等副作用；移植则经常会引起较强的免疫排斥反应。与此同时，现在所用的抑制免疫的非选择性药物由于它们的低效、低靶向性、毒性及一些其他的副作用如其导致的易感染性和伤口愈合过慢而愈发显得不适合。所以我们一直希望可以找到一种治疗方法，能够直接靶向与疾病相关的自身免疫过程而不影响其余的免疫系统的功能。注射疫苗基本上绕开粘膜，通常难于触发粘膜免疫应答，而可食疫苗却可以与消化道的衬里接触，即理论上说，它们可以同时激活粘膜应答和全身应答。这种双重效应可以增强对许多危险微生物的防御(William H.R.L.，2000)。

口服耐受性是对于口服蛋白质抗原特异的免疫反应，它最近被越来越多的人认为是一种治疗自身免疫疾病和防止移植排斥的好方法。作为一种达到口服耐受性的途径，口服胰岛素成为了一种新兴的治疗方法，并已引起人们的关注。它突破了传统的治疗方法，治疗目的在于干扰β细胞自身免疫的损害，意图在高血糖症出现之前阻止其破坏。实验表明，口服胰岛素可以对I型糖尿病的病情起到一定程度的改善，并且可以预防或延迟I型糖尿病的发生；同时对II型糖尿病也有一定的疗效。

在肠道中吞噬细胞、抗原反应细胞、淋巴细胞等作为感应器与效应器形成了一个庞杂的网络。肠道相关淋巴网状组织(gut-associated lymphoreticular tissue，GALT)就是由淋巴聚合而成的Peyer’s区(Peyer’s patches)和独立的淋巴结组成的。它与分散在肠固有层及上皮组织中的细胞共同组成了肠道的粘膜免疫系统(Muir A.and Ramiya V.，1996)。与它的解剖位置相对应，肠道粘膜免疫系统的一个基本功能就是防止食物中的外来的抗原进入全身免疫系统，以防止它们有可能产生的直接或间接的超敏反应。然而，在口服特定的抗原或与一些免疫附件相连的可溶性蛋白质时，它会发生抗原特异的全身应答反应(Stok W.et a1.，1994)。这种免疫二重性是试图治疗IDDM和其他自身免疫疾病实验的理论基础。自身抗原如胰岛素或谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)可以引发口服耐受性的产生，与此同时，口服免疫性由于使原本有害的自身免疫反应被一种无害的过程所代替，可以起到对疾病的预防作用，因此它为防止β细胞自发破坏提供了一种有效的途径。

有许多人认为，口服蛋白质抗原是无效的，因为它们在发生作用之前已在胃中被降解。实际上，这个降解过程并不会对口服耐受性产生很大的影响，相反，由于蛋白质抗原被切割成为了肠道相关淋巴组织更容易吸收的小肽，该过程有利于引发口服耐受性(Zhang Z.J.et al.，1991)。尽管食物中大部分蛋白质在被肠道上皮细胞吸收之前已被切割为无抗原性质的氨基酸、二肽或三肽，也存在着一些较长的小肽并未被完全消化而可以被GALT所吸收。这些抗原会首先穿过存在于Peyer’s区肠上皮细胞之间或顶部特化而成的微褶细胞(或M细胞)，这些细胞的顶部微绒毛可以在基底外侧部陷入相邻的淋巴细胞。特定的抗原或与免疫附件相连的可溶性蛋白质可以横穿M细胞并通过其细胞内部的管道进入Peyer’s区并继而激活免疫系统(Muir A.and Ramiya V.，1996)。继而，许多种与耐受性或免疫性相关的效应T细胞被激活，其中就包括了分泌细胞因子TGF-β的T细胞，从而使口服耐受性受到激活。对小鼠的肠环模型电镜观察实验表明，侵入的沙门氏菌可以穿过M细胞进入肠壁，它们抵抗了免疫清除并因此进入基底膜而在肠道上皮组织内散播引发肠炎。那么，稀释以后，沙门氏菌就可以作为一种介导抗原进入GALT并激活免疫反应的途径(McGheeJ.R.et al.，1992)。同时，散布于肠细胞内的树状细胞也可将肠腔以内的抗原摄入，并通过淋巴系统的循环激活免疫反应，但这个过程是诱发产生耐受性还是免疫性仍不清楚。

口服蛋白质抗原除了可以引发如胃肠消化道类的粘膜组织局部的分泌免疫球蛋白A(S-IgA)的反应，还可以引发全身的免疫应答。自1911年以来，研究者逐渐发现口服耐受性是一个免疫系统重要的生理性质，使得宿主可以避免发生类似于滞后型超敏反应(delayed-type hypersensitive response，DTH)的对于摄入蛋白质或抗原所引起的严重的反应，这种反应有可能会造成炎症或组织损伤(Weiner et al.，1994)。肠道相关淋巴组织(GALT)可能是口服耐受性起始的主要位点。口服耐受性的一大特点就是它对给予抗原反应的高度特异性，而且这一点对体液水平(抗体水平)和细胞水平上的免疫反应同样适用。尽管实验动物口服蛋白抗原以后，对于IgG，IgA和IgM同类型抗体的系统免疫反应(B细胞耐受性)产生一定的减弱，口服所诱导的耐受性对于T细胞介导的免疫反应产生了一个大得多而且可以维持的效应。体外培养的实验证明服用蛋白抗原的动物中抗原所激活的T淋巴细胞的增殖明显减弱(Weiner et al.，1994；Shengwu M.and A.M.Jevnikar，1999)。还应该提到的是，口服免疫性最初就是抗原被T细胞所识别的，而且耐受性就是在T细胞水平被维持。

口服耐受性的治疗由于可以引起抗原特异的免疫反应而对疾病有一定的治疗作用，但是它受到了一些实际问题而受到限制，即这种疗法需要不论是人还是实验动物都需要大量的蛋白质抗原。为了解决这个问题，包括微生物发酵和哺乳动物细胞等几种传统的表达系统都被进行实验，然而它们都存在着方法自身的限制。细菌表达系统的主要问题是它们无法进行许多哺乳动物蛋白所必须的翻译后加工的过程，如糖基化。而哺乳动物细胞表达系统尽管克服了这个问题，但其高费用的培养装置和其相对较低的产量使得其费用昂贵而不切实际。植物生物反应器是这种情况下一种很理想的选择，不仅因为它可以大量生产高质量的目的蛋白质并费用低廉，而且转基因植物可以作为运输自身抗原的一种简单而直接的方法。相比之下转基因植物是一个可以大规模、低成本生产各种医用蛋白的合适的候选系统。至今，已有许多重要的医用蛋白，如人表皮生长因子、胰岛素、粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、脑啡肽、干扰素、人血清白蛋白、水蛭素等及多种抗体与疫苗已在植物中成功表达(李育阳等，2001)。

用植物反应器生产疫苗是当今研究的热点之一。许多病毒抗原和细菌抗原基因已成功转入植物中，并表达出有免疫活性的产物。例如，首次进行用植物表达的外源疫苗进行人体临床实验的马铃薯中表达的肠毒性大肠杆菌的热不稳定肠毒素的B亚基(LT-B)，在给小鼠喂饲表达LT-B的马铃薯块茎后，可诱导起血清抗体和粘膜抗体的产生。通过进一步构建适宜于植物的表达载体，使LT-B可累积至可溶蛋白的0.15％(Mason H.S.et al.，1998)。这个表达水平使得临床的口服免疫实验得以进行。临床实验中，每天分别给志愿者服食50g或100g产LT-B的生马铃薯块茎(约含0.5mg或1mg LT-B)，结果表明两组志愿者中都产生了特异的抗LT-B的粘膜和系统免疫应答(Tacket C.O.et a1.，1998)。

在Arakawa T.等人(1998)的实验中，将胰岛素原与霍乱弧菌毒素的无毒B亚单位(CTB)连接融合表达，并对马铃薯进行了转化。CTB可以使植物合成的胰岛素直接运输至肠道相关淋巴组织(GALT)并激活粘膜免疫应答和全身免疫应答。该融合蛋白的表达量在转基因马铃薯的块根中约为可溶蛋白的0.1％。对NOD小鼠的饲服实验表明这种马铃薯可以使胰岛炎症(insulitis)产生一定的减轻，并明显推迟了糖尿病的疾病进程。

由此可见，利用转基因植物作为生物反应器生产口服人胰岛素具有重要的应用价值。本发明提供的就是一种利用转基因生菜、番茄和烟草作为植物生物反应器生产人胰岛素的方法，这种生菜和番茄可以方便地成为一种口服产品，用于防治某些胰岛素依赖的和自体免疫障碍的糖尿病，而且可以从中提纯出人胰岛素做成注射用的剂型。

与Arakawa T.等人的实验不同，本发明的主要创新之点在于：(1)选用植物偏爱的密码子，人工合成人胰岛素基因，B链在前，A链在后，两条链之间通过六个氨基酸形成的β转角结构模拟天然胰岛素的三维构象。而Arakawa T.等人则是直接通过胰岛素的C肽连接；(2)在合成人胰岛素的C端加上了KDEL内质网滞留序列，避免了胰岛素在植物细胞中的降解。而Arakawa T.等人则是加了霍乱弧菌毒素的无毒B亚单位；(3)定位重组系统对外源基因的调控和植物激素在种子发育过程中受到调节，使生产胰岛素的生菜不含有可以继续种植的种子，或种子胚胎中的人胰岛素基因已被删除。而Arakawa T.等人并未用到此技术。这一技术不但防止了人胰岛素生菜以某种方式进入普通生菜、番茄和烟草，并且保证了人胰岛素生菜生产者的持久经济利益。这种方法在国内外均未见报道。

本项发明的技术要点之一是胰岛素基因的人工合成。之所以不采用天然人胰岛素的DNA序列，是因为我们采用植物偏爱的密码子可提高该基因在植物中的表达量。我们所用的人胰岛素基因编码了天然胰岛素A链和B链的氨基酸顺序，但DNA顺序与天然人胰岛素基因的DNA顺序并不相同。

本项发明的要点之二是植物表达载体pCAM35S-InsK及pCAM2A12-InsK的构建。将人工合成的人胰岛素基因InsK连接到p11Z载体上并测序，然后从pBI221载体上切下CaMV35S启动子，置于胰岛素基因的上游。将CaMV 35S-InsK切下后置于植物表达载体pCAMBIA1390的nos终止子之前，经酶切和PCR鉴定证明载体构建正确。从pTM载体上切下2A12启动子，置于胰岛素基因的上游。将2A12-InsK切下后置于植物表达载体pCAMBIA1390的nos终止子之前，经酶切和PCR鉴定证明载体构建正确。

本项发明的要点之三是在人胰岛素基因的C端加上了KDEL的内质网滞留序列。研究证明在蛋白质的C端加上KDEL的四个氨基酸序列，能够使该蛋白质滞留于内质网中，从而避免被大量降解。内质网是一种代谢相对稳定的细胞器。研究表明，真核生物中一些蛋白能够大量积累在内质网中，这些蛋白的多肽序列在C端含有一个由Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL)组成的四肽结构，是蛋白滞留在内质网的一个必要条件(Pelham，1988)。Wandelt(1992)通过体外遗传操作将豌豆储藏蛋白(vicilin)基因编码序列3’端加上了KDEL序列，转化后发现植物细胞内重组蛋白定位到了内质网及其衍生的蛋白体内，外源蛋白的表达量和稳定性均有大幅度的提高。

本项发明的要点之四是定位重组系统对外源基因的调控和植物激素在种子发育过程中受到调节，使生产胰岛素的生菜不含有可以继续种植的种子，或种子胚胎中的人胰岛素基因已被删除。来源于噬菌体P1的Cre/lox系统，酵母2u质粒的FLP/FRT系统，酵母PSRl质粒的R/RS系统和噬菌体Mu的Gin/gix系统是目前研究的较清楚的四种定位重组系统。这些定位重组系统都由重组酶和特异识别位点组成(Odell，《Recombination and GeneSilencing in Plants》，J.Paszkowski(ed.)，219-270(1994))。其中Cre，FLP，R和Gin分别编码重组酶，重组酶由单个多肽构成，它们的蛋白序列之间有很大的差异，但C端都有一个40个氨基酸的同源区域。其中有三个保守的氨基酸序列His-Arg-Tyr，可能是它们的活性位点。loxP，FRT，RS和gix是分别被上述四种重组酶所识别的特异序列。重组酶的靶位点都含有约12-13bp的倒置重复序列，中间隔以2-8bp的间隔区，间隔区的方向决定了重组酶介导的重组的方向性。如果两个识别位点的方向相反，中间的DNA序列会发生倒位。两个识别位点的方向相同则会切除中间的DNA片段，如果两个识别位点分别位于两个DNA分子上，则会发生整合反应。除了Gin需要一个大肠杆菌宿主的辅助因子外，其它的几种重组系统都可以独立的行使功能，不需要任何其它的辅助因子。到目前为止，定位重组系统已经被广泛应用于转基因动植物中外源基因的失活或活化，从而控制生物体的发育和表型特征。其中以Cre/loxP和FLP/FRT应用最为广泛，研究也最深入。FLP/FRT在果蝇中应用较多而Cre/loxP则在小鼠中广泛使用，而且这两套系统都已分别应用于高等植物中外源基因的控制以及染色体研究。

植物是一个具有自组织、自复制、自调节、自适应能力的生命系统，它作为口服疫苗的表达系统有很多优点：

(1)植物是高等的真核生物，可以类似于哺乳动物的对蛋白质进行折叠、糖基化和组装，这对于具有体内活性的医用动物蛋白的生产十分重要；

(2)与微生物发酵和哺乳动物细胞培养不同的是，植物的生长不受培养装置和培养基的限制。通过农业的方法，实际治疗和实验所需的蛋白质的量可以很容易并的达到并且费用低廉；

(3)对于一个地区的种植方法可以本地化，由于许多可食植物容易再生，作物可以无限制的种植下去，解决了长途运输传统疫苗配剂、保持途中和目的地冷藏环境所面临的难题；

(4)植物作为反应器可以轻易的避免动物病原体的感染，而用其他方法生产，为了消除感染的可能性，一般需要高温灭菌，而与此同时使得部分蛋白质失活；

(5)并且由于可食疫苗不需要任何注射器，既避免了使用注射器的相对费用，也避免了由注射器污染的可能性而带来的其他疾病的传染。

(6)更重要的是，植物的可食部分可以直接作为口服耐受治疗的载体，从而避免了高费用的提取及下游纯化过程，而且使得对于侯选自身抗原的运输变得简单易行；本发明的设计策略如下：

1.设计并人工合成人胰岛素基因

(1)为了提高人胰岛素基因的表达量，该基因全部使用植物偏爱密码子；

(2)为了利于合成人胰岛素可以正确折叠成天然的构象，在人胰岛素的A链与B链之间设计了一个6个氨基酸的柔性连接短肽以代替胰岛素原的C肽。其设计原因如下：对天然胰岛素的三维结构进行分析发现，B链C端和A链N端的空间线性距离为16.12埃，而线性排列的五肽的最小空间距离为16.0埃，为了不改变融合的多肽链中A链和B链的构象，推测它们之间的连接肽的最小残基数应不少于5个残基。考虑到B链C端和A链N端在空间上的取向相反，连接肽最好能形成β-转角结构。不同氨基酸在形成二级结构时具有不同的倾向和能力，其中Pro和Gly很少形成α-螺旋和β-折叠，而Pro，Gly，Asn，Ser在β-转角的构象中最常见，推测Gly-Pro-Ser的结构最有可能形成β-转角。故本实验中选用的连接肽序列为Gly-Gly-Pro-Ser-Gly-Gly。

2.在生菜中使用植物基因工程中最常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，这种启动子适用于大多数植物且启动能力很强。对于其它植物如蔬菜类和瓜果类的番茄、黄瓜、西瓜、甜瓜、茄子、南瓜、其他水果类植物如香蕉、苹果、梨、菠萝及块根块茎类植物如胡萝卜、萝卜、甘薯、木薯、马铃薯等，来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子均能在这些植物中驱动胰岛素基因的表达。如果需要外源基因在特定的空间和时间中表达，就会用到一些器官和组织专一性表达的或受诱导表达的启动子。为了提高mRNA的翻译水平，需要对其基因的5’及3’调控信号，翻译起始点处序列及密码子的使用加以优化。为了使外源基因适合于在植物中表达，有时甚至需要重新合成外源基因。

3.在番茄中使用果实专一性启动子2A12

(1)番茄果实专一性启动子2A12是通过PCR技术从番茄2A11基因启动子正调控区内扩增出了868bp的片段。2A11基因的mRNA在开花前一天的子房中即可检测到，而完全成熟时果实中2A11 mRNA水平占总mRNA的1％。而在其它组织和发育阶段均未检测到2A11的mRNA，说明该基因具有严格的组织专一表达特性(Van Haaren etal.，1993)。将2A12启动子与GUS基因融合转入番茄，并用组织化学染色法对转基因植物的根、茎、叶、花器官等进行了GUS活性分析，结果表明在该启动子调控下的GUS基因在果实组织中呈均一性表达，而在根、茎、叶中检测不到GUS活性(甄伟，2000)。证实了2A12启动子在番茄果实中具有高度的启动子特异性，和很高的启动子活性，估计它的启动子活性是35S启动子的5-10倍。

(2)使用果实专一性启动子是为了使人胰岛素基因只在番茄的果实中高效表达，避免了因为外源基因在番茄植株的所有组织中组成型表达而导致的植物资源被大量消耗、植物的正常代谢紊乱和由于外源蛋白的大量累积而对植物细胞造成的毒性。从而保证该转基因番茄在正常生长的同时大量生产合成人胰岛素。

4.在合成人胰岛素的C端加上了KDEL(四个氨基酸残基)内质网滞留序列，避免了胰岛素在植物细胞中的降解。

在所设计的蛋白质序列后加上KDEL的末尾，其优点有以下几点：(1)所表达的蛋白质可以滞留于内质网中，从而方便分离与纯化；(2)往往随着植物的生长，累积在植物细胞质中的外源蛋白会逐渐被降解，这种方法可以避免合成人胰岛素的降解；(3)植物与动物细胞间蛋白质的糖基化的不同是一个重要的问题，因为植物中不必要的糖基化有可能使外源蛋白在体内产生不需要的免疫反应。在对植物与动物中糖基化过程的比较中发现，两者在内质网中合成高甘露糖核心的过程类似，而主要区别在于其后高尔基体内复杂多糖的合成途径。这种方法可以使蛋白质滞留于内质网中，而避免复杂多糖的合成。

5.以生菜、番茄作为生物反应器

生菜和番茄是世界上普遍栽培的蔬菜，容易培养且营养价值高，可以周年生产。同时由于它可以生食，可以直接作为口服疫苗的载体将疫苗运输到肠道以激活免疫系统发生反应。以植物细胞直接作为载体的一个优点是其坚硬的细胞壁可以在穿过消化道时对其所携带的抗原产生一定的保护作用，使其直到运输至肠道时才逐渐被释放。

这里应特别指出的是，虽然在本发明的下述实施例中以转基因生菜、番茄和烟草的产生及检测举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明制备的人工合成人胰岛素基因及其所用的植物表达载体只用于转化和产生含人胰岛素的生菜、番茄和烟草，因为本发明的技术要点在于植物偏爱密码子人胰岛素基因的设计、CaMV35S启动子和果实专一性启动子p2A12的应用、KDEL内质网滞留序列的应用和定位重组系统的应用，本领域的技术人员可以利用已知的方法将构建好的含本发明的人胰岛素基因表达载体转化生菜、番茄、及其它植物。因此，使用本发明所构建的人胰岛素基因及植物表达载体所获得的含有人胰岛素的植物，均在本发明的权利要求内，这些植物包括：蔬菜类和瓜果类作物如生菜、黄瓜、西瓜、甜瓜、茄子、南瓜、其他水果类植物如香蕉、苹果、梨、菠萝及块根块茎类植物如胡萝卜、萝卜、甘薯、木薯、马铃薯等。

本发明提供一种利用转基因生菜、番茄和烟草做为生物反应器生产人胰岛素方法。包括：依据植物偏爱密码子的原则来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成一个连续的开放读码框(ORF)，这个开放读码框即为合成的人胰岛素基因，该基因用6个氨基酸(GGPSGG)连接胰岛素的B链和A链，并在胰岛素的C端加上KDEL的内质网滞留序列；以本领域技术人员熟悉的植物常用的CaMV35S启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)为该基因启动子，以Nos polyA为终止子，构建植物表达载体pCAM35S-InsK；以番茄果实专一性启动子2A12为该基因启动子，以Nos polyA为终止子，构建植物表达载体pCAM2A12-InsK；将pCAM35S-InsK和pCAM2A12-InsK分别通过冻融法转化到农杆菌LBA4404菌种中；通过农杆菌介导的叶盘法将人胰岛素基因转入生菜、番茄和烟草的愈伤组织中，再生出转基因植株；对转基因植株进行PCR和ELISA检测，得到阳性转基因生菜、番茄和烟草，其中利用CaMV35S启动子所得的转基因生菜和烟草在整株植株中均表达人胰岛素，利用番茄果实专一性启动子2A12所得的转基因番茄在果实中大量表达人胰岛素。

在本发明的一个实施方案中，关于人胰岛素基因的合成，选用植物偏爱的密码子。为此在人胰岛素A链63个碱基中更换了13个碱基。在B链90个碱基中更换了18个碱基，另外在3’端加上了12个碱基编码内质网滞留序列KDEL。在A链与B链之间我们设计了6个氨基酸的连接片段，这6个氨基酸为GGPSGG。此连接片段的氨基酸种类及顺序的设计原则是保持人胰岛素天然的三维结构特征。我们将人工合成的包含人胰岛素A链与B链及中间小段连接顺序克隆于pGEM-11Z载体中的EcoRI和BamHI位点，并经质粒酶切图谱的分析及序列分析加以确定，该质粒命名为p11Z-InsK。在这一实施方案中，人胰岛素基因片段可以通过PCR扩增得到，扩增时，使用的引物如下：

InsK 5’：5’-GAT CCA TGT TCG TTA ACC AAC ACC-3’

InsK 3’：5’-CTC GTC CTT GTT GCA GTA GTT CTC-3’。

根据本发明的这一个实施方案，植物偏爱密码子的设计不仅包括胰岛素A链中63个碱基中更换了13个碱基，在B链90个碱基中更换了18个碱基，也应包括其它更换了一定数量碱基，符合植物偏爱密码子原则。

根据本发明的这一个实施方案，人工合成的胰岛素基因不仅限于植物密码子的应用，应扩展到其它有利于表达量提高的基因结构改造。

根据本发明的这一个实施方案，加在人工合成胰岛素基因3’端的碱基不仅包括编码内质网滞留序列KDEL四个氨基酸的12个碱基，也应包括其它类似的目的是为了使胰岛素滞留在内质网中的其它多个氨基酸顺序。

根据本发明的这一个实施方案，在A链与B链之间的氨基酸连接不仅包括GGPSGG这6个氨基酸顺序，也应包括其它目的是为了表达的胰岛素能折叠成类似天然胰岛素三维结构的多个氨基酸顺序。

根据本发明的这一个实施方案，胰岛素结构的改造除了胰岛素的B链和A链以GGPSGG这6个氨基酸形成的转角结构或其它可形成转角结构的几个氨基酸连接外，还包括B链和A链之间自主的断裂结构设计，以及将B链和A链的编码顺序分别放在不同的转录单位之中。

在本发明的一个实施方案中，人胰岛素基因置于组成型表达启动子CaMV35S启动子的调控之下，再转入中间载体中。再进一步转入双元表达载体pCAMBIA1390，完成一个植物表达载体的构建(见图1、人工合成的人胰岛素基因的克隆及植物表达载体的构建流程图。其中人胰岛素基因处于组成型启动子CaMV35S的控制下)。

根据本发明的这一个实施方案，驱动人胰岛素基因的启动子除了组成型表达启动子CaMV35S外，还应包括其它目的是为了驱动胰岛素基因在植物中高效表达的启动子如泛素Ubiqutin启动子，actin启动子等。

根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体为CAMBIA公司的pCAMBIA1390表达载体，其植物筛选标记基因为hptII，编码潮霉素(htgromycin)抗性蛋白。HptII编码区的启动子为CaMV35S启动子，终止子为CaMV35S polyA。驱动胰岛素基因的启动子为CaMV35S启动子，终止子为nos polyA。

根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体除了CAMBIA公司的pCAMBIA1390表达载体外，还可以选用CAMBIA公司的其它表达载体或者本领域技术人员所构建的其它常用的植物表达载体如pGPTV系列，pBI系列pCB系列等。这些植物表达载体的标记基因为hptII、NPTII和bar。HptII基因的编码产物提供了潮霉素抗性功能，NPTII基因的编码产物提供了卡那霉素抗性功能，bar基因的编码产物提供了除草剂抗性功能。

在本发明的一个实施方案中，人胰岛素基因置于果实专一性启动子p2A12的调控之下，再转入中间载体中。再进一步转入双元表达载体，完成一个植物表达载体的构建(见图2、人工合成的人胰岛素基因的克隆及植物表达载体的构建流程图。其中人胰岛素基因处于果实专一性启动子p2A12的控制下)。

根据本发明的这一个实施方案，驱动人胰岛素基因的启动子除了果实专一性启动子P2A12外，还应包括目的是为了在植物某个或某些特定组织器官中高效表达胰岛素的其它启动子，这些启动子同时满足了胰岛素基因在不同植物中表达。这些植物包括蔬菜类和瓜果类作物如生菜、黄瓜、番茄、西瓜、甜瓜、茄子、南瓜、其他水果类植物如香蕉、苹果、梨、菠萝及块根块茎类植物如胡萝卜、萝卜、甘薯、木薯、马铃薯等。

根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体为CAMBIA公司的pCAMBIA1390表达载体，其植物筛选标记基因为hptII，编码潮霉素(htgromycin)抗性蛋白。HptII编码区的启动子为CaMV35S启动子，终止子为CaMV35S polyA。驱动胰岛素基因的启动子为CaMV35S启动子，终止子为nos polyA。

根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体除了CAMBIA公司的pCAMBIA1390表达载体外，还可以选用CAMBIA公司的其它表达载体或者本领域技术人员所构建的其它常用的植物表达载体如pGPTV系列，pBI系列pCB系列等。

在本发明的一个实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化生菜、番茄和烟草。

根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株为LBA4404。

根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株除了LBA4404外，还应包括农杆菌的其它菌株。这些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白区，能够帮助转入的植物表达载体中的T-DNA转移到植物的基因组中。

在本发明的一个实施方案中，转化生菜、番茄和烟草的方法为均为农杆菌介导的叶盘法。挑取转化了植物表达载体的农杆菌LBA4404单菌落，接种于Km50mg/L YEB液体培养基中，28℃，165rpm培养过夜。当菌液浓度至OD₆₀₀为0.2～0.6时，将预培养2天的番茄茎段和叶片外植体侵染3～5分钟，取出置于无菌滤纸上略微吸干，接到不含抗生素的培养基上共培养两天左右，然后接种到Hyg(潮霉素)5mg/L，Cb500mg/L的筛选培养基中，随后每继代一次，最终在合适hyg浓度的筛选培养基中筛选抗性芽。未经侵染的、其他培养条件均相同的植株茎段和叶片外植体作对照。待转化再生植株长到2～3cm左右时，将其接入附加Hyg5mg/l、Cb500mg/l的生根培养基中生根。

根据本发明的这一个实施方案，植物筛选所用的抗生素除了潮霉素，还包括卡那霉素和除草剂，具体选用何种筛选要看选用植物表达载体所对应的标记基因。如选用pCAMBIA1390载体则筛选标记为潮霉素(Hyg)，选用pCAMBIA2390载体则筛选标记为卡那霉素(Kmn)，选用pCAMBIA3390载体则筛选标记为除草剂。

本发明用于靶植物的实际转化方法对本发明不是关键，可以使用本领域技术人员所熟知的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但并不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。

用于将转化细胞再生成整个植株的方法对本发明不是关键，可以使用任何对靶植物合适的方法，本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。

给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，但并不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

所有实施例中的细菌培养和DNA操作均参考《分子克隆：实验室操作指南》(金冬雁等译，科学出版社，北京(1993))和《精编分子生物学指南》(颜子颖等译，科学出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自Promega公司，New EnglandBiolabs公司。

表1植物偏爱密码子总结表(根据Murray E.E.)

表2所合成8条寡核苷酸片段、分子量及稀释情况

表3NOD小鼠的长期饲服转基因生菜、番茄和烟草试验

表4农杆菌YEB培养基

表5生菜、番茄及烟草组织培养用MS培养基

图1：植物表达载体pCAM35S-InsK的构建流程。

图2：植物表达载体pCAM2A12-InsK的构建流程。

图3：采用定位重组系统Cre/lox和FLP/FRT来控制胰岛素基因在F₂代中的删除。

图4：通过定位重组系统与激素调节的共同作用使产生人胰岛素的番茄不能正常结实。

图5：转基因生菜、番茄和烟草的PCR鉴定。

实施例1  人胰岛素的人工合成：

根据Murray E.E.等人提供的植物中使用密码子的情况，推测植物偏爱密码子。总结如表1。

在GENEBANK中找到人胰岛素原的序列，从中得到人胰岛素A链和B链的序列，并根据植物偏爱密码子，设计替换碱基。在设计好的合成人胰岛素的B链和A链之间加入设计好的连接短肽；在B链前加上起始密码子ATG，A链后加上编码KDEL的DNA序列及终止密码子TAA；并在该合成基因的前后分别加上两个限制性内切酶的酶切位点BamHI和EcoRI；就得到了所设计合成的人胰岛素基因。

将合成人胰岛素基因的双链分成8段(见表2)，使得两条链5’端的一端略短，同时可作为PCR反应的引物，另外3’端略长，彼此相互重叠并覆盖基因全长。注意分段时尽量以G、C作为结尾。

(1)将每管(2.5OD)的合成寡核苷酸片段依上表用无菌水进行稀释，使得每一条寡核苷酸链的终浓度为0.11nmol/ul；

(2)5’端加磷反应：

上述8管各取10ul分别加入0.5ml的Eppendorf管中，在冰上放置15min，其后进行加磷反应。加磷反应于37℃反应1hr以上，其体系为：

25ul体系：

寡聚核苷酸片段                10ul

T4寡聚核苷酸激酶(稀释10倍)    2.5ul

10X缓冲溶液                   2.5ul

无菌水                        10ul

(3)退火：

将加磷后的8个片段各取5ul，加入0.2ml Eppendorf管中，再加入10ul 10×T4连接酶缓冲溶液及15ul无菌水，混匀；95℃放置10min，用沸水浴逐渐冷却至室温，后转移至4℃冰箱，慢慢冷却；

用EcoRI和BamHI消化pGEM-11Z载体，酶切过夜后补无菌水400ul，用2倍无水乙醇沉淀，其后溶解至30ul。酶切体系为：

100ul体系：

pGEM-11Z质粒                  59ul

10X缓冲溶液                   10ul

EcoRI                         3ul

BamHI                         3ul

Rnase                         21ul

无菌水

将退火后的体系取出，冰上放置10min，再加入载体pGEM-11Z酶切后沉淀的大片段27ul及8ul T4 DNA连接酶(3U/ul)，16℃连接过夜。总结连接体系为：

100ul体系：

寡核苷酸链                    8×5ul

载体大片段                    27ul

10X连接酶缓冲溶液             10ul

T4 DNA连接酶                  8ul

无菌水                        15ul

用连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，并利用蓝白筛和PCR反应对重组子进行鉴定。具体操作见植物表达载体构建的基本方法。对鉴定阳性的重组子进行测序，与设计序列核对无误后，将其命名为p11Z-InsK。实施例2  植物表达载体pCAM35S-InsK的构建：植物表达载体pCAM35S-InsK的构建流程见图1：

(1)分别将含有35S启动子的pBI221质粒及p11Z-InsK质粒用HindIII和XbaI进行完全酶切，琼脂糖凝胶电泳后分别回收载体和插入片段，按插入片段：载体片段摩尔比3∶1进行连接，使35S插入合成人胰岛素基因的上游，将其命名为p11Z-InsK-35S；

(2)分别将构建好的含有35S启动子驱动下的胰岛素基因的p11Z-InsK-35S和植物表达在载体pCAMBIA1390用HindIII和EcoRI进行完全酶切，连接后得到植物表达载体pCAM35S-InsK。

HinidIII和BamHI双酶切切出0.8kb的小片段，PCR扩增亦能得到0.8kb的小片段，证明载体的构建是正确的。实施例3  植物表达载体pCAM2A12-InsK的构建：植物表达载体pCAM35S-InsK的构建流程见图2：

(1)分别将含有2A12启动子的pTM质粒及p11Z-InsK质粒用HindIII和XbaI进行完全酶切，琼脂糖凝胶电泳后分别回收载体和插入片段，按插入片段：载体片段摩尔比3∶1进行连接，使2A12插入合成人胰岛素基因的上游，将其命名为p11Z-InsK-2A12；

(2)分别将构建好的含有2A12启动子驱动下的胰岛素基因的p11Z-InsK-2A12和植物表达在载体pCAMBIA1390用HindIII和EcoRI进行完全酶切，连接后得到植物表达载体pCAM2A12-InsK。

HinidIII和BamHI双酶切切出0.8kb的小片段，PCR扩增亦能得到0.8kb的小片段，证明载体的构建是正确的。(P2A12和CaMV35S的大小相似)实施例4  土壤农杆菌的转化：土壤农杆菌感受态的制备：

(1)将土壤农杆菌菌株LBA4404接种于含适当抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至对数期；

(2)4℃，8,000rpm离心5分钟，收集菌体于小离心管中；

(3)用600ul冰预冷的500mM CaCl2重悬洗涤细胞；

(4)4℃，8,000rpm离心5分钟，细胞沉淀中加入200ul冰预冷的500mM CaCl2，混匀后备用(24hr至48hr使用最佳)；

土壤农杆菌的转化：

(1)分别加入约1ug构建好的植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，于液氮中速冻5分钟，然后37℃温育5分钟；

(2)加入600ul YEB液体培养基，28℃轻摇2-4小时；

(3)取200ul菌液均匀涂布于含适当抗生素的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。挑几个菌落进行PCR检测，得到阳性菌株。实施例5  生菜的遗传转化及植株再生：生菜的遗传转化及植株再生外植体的制备

(1)选取饱满的生菜种子，用70％乙醇处理1分钟；

(2)用20％次氯酸纳溶液处理20分钟进行表面灭菌，并用无菌水清洗3-5遍；

(3)播种于生菜固体培养基[普通MS培养基]上，10-14天后两片子叶完全展开时用于转化。叶盘法转化生菜及植株再生

(1)选取稍大的生菜叶片，剪成0.5平方厘米的小块，浸入带有目的基因的土壤农杆菌稀释液中侵染20分钟，期间轻轻摇动；

(2)用无菌滤纸吸去多余的菌液，转移这些叶片于生菜培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)+Cb(500)，单位为mg/L]中暗培养两天；

(3)后将叶片外殖体转入SM2中，于25℃光照培养；

(4)继代培养多次后愈伤组织长出生菜小苗，待小苗稍大后剪下插入1/2MS培养基中生根。

(5)待根系发达后移栽入盆中，并进行分子生物学鉴定。

PCR鉴定证明胰岛素基因整合到生菜的基因组中，ELISA检测证明胰岛素基因在转基因生菜中高效表达。实施例6  番茄的遗传转化及植株再生：番茄的遗传转化及植株再生外植体的制备

(1)选取饱满的番茄种子，用70％乙醇处理1分钟；

(2)用20％次氯酸纳溶液处理20分钟进行表面灭菌，并用无菌水清洗3-5遍；

(3)播种于番茄固体培养基[普通MS培养基]上，10-14天后两片子叶完全展开时用于转化。叶盘法转化番茄及植株再生

(1)在靠近疫病1/3处剪取番茄子叶作为外殖体，浸入带有目的基因的土壤农杆菌稀释液中侵染20分钟，期间轻轻摇动；

(2)用无菌滤纸吸去多余的菌液，转移这些叶片于番茄培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)+Cb(500)，单位为mg/L]中暗培养两天；

(3)后将叶片外殖体转入[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)，单位为mg/L]中，于25℃光照培养；

(4)继代培养多次后愈伤组织长出番茄小苗，待小苗稍大后剪下插入1/2MS培养基中生根。

(5)待根系发达后移栽入盆中，并进行分子生物学鉴定。

PCR鉴定证明胰岛素基因整合到番茄的基因组中，ELISA检测证明胰岛素基因在转基因番茄中高效表达。实施例7  烟草的遗传转化及植株再生：叶盘法转化烟草及植株再生

(1)接种农杆菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入40ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5，8,000g离心10分钟，菌体用40ml MS液体培养基重新悬浮。

(2)取无菌烟草叶片和不含腋芽的茎段，于MS固体培养基中25℃预培养一天。

(3)重新取出材料，用剪刀切成小块放入无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡15-20分钟，其间轻摇几次。

(4)用无菌滤纸吸去多余菌液，于烟草培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)+Cb(500)，单位为mg/L]中25℃暗培养两天。

(5)把材料转入烟草培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Hyg(1.0)，单位为mg/L]中，25℃光照培养至分化出愈伤组织，直至长出芽；每14-20天继代培养一次；

(6)将长至3-5cm的芽转入烟草生根培养基[1/2MS培养基]上诱导生根；

(7)约2-3周后根系形成，移栽于灭菌的土壤中培养。

PCR鉴定证明胰岛素基因整合到烟草的基因组中，ELISA检测证明胰岛素基因在转基因生菜中高效表达。实施例8  采用定位重组系统Cre/lox和FLP/FRT来控制胰岛素基因在F2代中的删除：

在亲本1中转入果实专一性启动子驱动的胰岛素基因，该启动子和胰岛素的两侧为同向的LoxP元件(Cre重组酶识别元件)，同时将铜诱导性启动子驱动FLP基因的载体转入亲本1中；在亲本2中转入胚胎专一性启动子驱动的Cre重组酶基因，在启动子和Cre重组酶之间为阻断序列，且该阻断序列两侧为同向的FRT元件(FLP重组酶识别元件)。将亲本1和亲本2杂交，在0.5μM铜离子的诱导下，在F1代植株中由于FLP重组酶的作用删除两个FRT元件之间的阻断序列，在F1代发育至种子形成阶段，在胚珠中由于Cre重组酶的作用，可表达人胰岛素的序列由于在两个同向的LoxP元件之间，从而被删除。具体过程见图3。实施例9  通过定位重组系统与激素调节的共同作用使产生人胰岛素的番茄不能正常结实：

将含有果实专一性启动子驱动胰岛素基因及胚胎专一性启动子驱动Cre重组酶基因的植物表达载体通过农杆菌侵染法转入亲本1；在亲本2中转入胚胎专一性启动子驱动的ipt基因(异戊烯基转移酶基因，促进细胞产生生长素)，在启动子和ipt基因之间为阻断序列，且该阻断序列两侧为同向的LoxP元件(Cre重组酶识别元件)。将亲本1和亲本2杂交，在F1代胚胎发育过程中，由于Cre重组酶的作用删除了两个同向LoxP元件之间的阻断序列，使得ipt基因能在F2代中促进植物细胞产生生长素，干扰了种子的形成，使得番茄不能正常产生种子。具体过程见图4。实施例10  转基因植株的鉴定与检测：植物基因组DNA的制备

(1)称取0.1g植物叶片或茎组织，于研钵中快速用液氮研至粉末并转入1.5ml离心管中，立即加入500ul的提取缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris-Cl PH8.0，50mM EDTA，1％(V/V)β-巯基乙醇)，轻轻混匀；

(2)解冻后放置于冰上，加入冰冷20％存贮液PVP(存于-20℃)至终浓度为6％。

(3)加入50ul 20％SDS，轻轻混匀后于65℃水浴10分钟；

(4)加入250ul 5M KAc于冰上反应30分钟，离心(15000rpm，10分钟，4℃)。

(5)取上相转入一新的离心管，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀三次，再置于冰上10分钟。离心(15000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清；

(6)沉淀物抽真空或室温吹干后，溶解于500ul 1×TE(pH8.0)。用1倍体积的饱和酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)抽提一至两次，取上相；

(7)离心(12000rpm，10分钟，20℃)，取上相转入一新的离心管；

(8)加入1倍体积的异丙醇(20℃，5分钟)，并将管至少颠倒5次；

(9)离心(15000rpm，10分钟，4℃)，用70％乙醇冲洗沉淀物，抽真空或吹干，最后溶于适量TE(pH8.0)中。转基因生菜、番茄及烟草的PCR鉴定：

得到完整的pCAM35S-InsK转基因生菜、番茄和烟草后，在生长初期，取转基因生菜、番茄和烟草叶片并用SDS法提取植株的总DNA进行PCR鉴定，以合成人胰岛素基因两端引物扩增合成人胰岛素基因片段，可以得到约180bp的条带，说明合成人胰岛素基因已整合至转基因植株的基因组。(见图5：转基因生菜、番茄及烟草的PCR鉴定)果实专一性启动子驱动转基因番茄的PCR鉴定：

得到完整的pCAM2A12-InsK转基因番茄后，在生长初期，取转基因番茄叶片并用SDS法提取番茄的总DNA进行PCR鉴定，以合成人胰岛素基因两端引物扩增合成人胰岛素基因片段，可以得到约180bp的条带，说明合成人胰岛素基因已整合至番茄的基因组。(见图5：转基因生菜、番茄及烟草的PCR鉴定)实施例11  转基因植株的ELISA检测：溶液的准备：

1)包被液：50 mM Na2CO3-NaHCO3，pH9.6

2)洗涤液：0.05％Tween-20，0.01 M磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)，pH7.4

3)封闭液：1-2％牛血清白蛋白，洗涤液

4)一抗溶液：取一瓶兔的抗血清干粉制剂，加入1ml洗涤液溶解，临用前用洗涤液稀释10倍

5)二抗溶液：山羊抗兔IgG-AP，临用前用洗涤液稀释2000倍

6)显色缓冲液：0.1M NaCl，0.05M MgCl2，0.1M Tris-HCl，pH9.5

7)显色液：30ml显色缓冲液，50μl NBT/BCIP[含33μl NBT贮存液(100mg NBT，2ml 70％DMF)和17μl BCIP贮存液(100mg BCIP，2ml 100％DMF)]

8)终止液：0.15M NaCl，0.1M马来酸，用NaOH调至pH7.5ELISA检测的具体步骤为：

1)包被：将转人胰岛素基因的生菜、番茄和烟草的材料与未转基因的对照(约0.1-0.2g湿重)放于Effendorf管中，加液氮冷冻数秒后将其充分研碎，加入500μl包被液，混匀后12000rpm离心5min，取上清，用包被液适当稀释后各加100μl于反应孔中，同时加入100μl洗涤液为空白对照，加盖后置4℃过夜或37℃恒温箱温浴2h。

2)封闭：弃去孔内液体，每孔中加200μl洗涤液，静置3min后弃去，重复3次，扣在滤纸上吸干水分。每孔加入200μl封闭液，加盖后置37℃恒温箱1h，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次。

3)加入一抗：取100μl一抗溶液加于孔中，加盖后置37℃恒温箱1-2h，用洗涤液洗涤3次。

4)加入二抗：取100μl二抗溶液加于孔中，加盖后置37℃恒温箱1-2h，用洗涤液洗涤3次，用显色缓冲液洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。

5)显色：每孔加入100μl显色液，反应板置于室温暗处进行显色反应，每孔加入50μl终止液终止反应。

以未转基因的生菜、番茄和烟草为对照，对多个转基因的生菜、番茄和烟草株系进行了酶联免疫吸附检测，结果表明，转基因株均有较强的免疫活性，在对照中仅有很弱的非特异吸附，说明人胰岛素基因在转基因植株中高水平表达，人胰岛素在生菜中平均含量为占可溶蛋白的0.3％，人胰岛素在番茄果实中的平均含量为占可溶蛋白的0.8％，人胰岛素在烟草中平均含量为占可溶蛋白的0.3％。为提高实验的可重复性，反应各步均应充分洗涤，以除去残留物、减少非特异性吸附，还应固定洗涤次数及放置时间，避免震荡或相互污染。另外，为使显色反应便于比较，显色时置室温暗处的时间应一致。实施例12  从转基因生菜、番茄和烟草中提取人胰岛素：

整个操作过程在GMP标准的车间中进行。采摘新鲜的生菜叶片、成熟的转基因番茄或新鲜的烟草叶片，表面消毒后用无菌蒸馏水洗净，切成碎片后加82％乙醇，于10～12℃加入12mol/L硫酸，调pH2.8～3.0，搅拌提取0.5h。加入6mol/L盐酸调pH至2.0，继续搅拌提取2.5h，分离残渣，残渣加入65％乙醇，用6mol/L盐酸调pH2.0，10～12℃搅拌提取2h，分离残渣。合并2次提取液。

碱化提取液冷至0～5℃，用浓氨水调pH7.8～8.0，加入硅藻土，板框压滤，随即用混合酸(盐酸4000ml、硫酸1000ml、水4000ml)酸化至pH2.5，待沉淀完全后虹吸清液，吊滤，除去沉淀，温度控制在0～3℃。

第一次锌沉淀清液加入氯化锌溶液(先配成30～50％溶液，用6mol/L盐酸调pH2.5后加入)，温度2～4℃，待沉淀完全后，虹吸清液，吊滤，除去沉淀，清液用浓氨水调pH至6.8～7.0，于5℃过夜。

脱脂、盐析次日虹吸除去清液，沉淀过滤、收集，溶于5倍量蒸馏水，用6mol/L盐酸调pH2.7～2.8，12～15℃放置。次日放出下层清液(回收下层清液，供下批锌沉淀溶解用)，清液用6mol/L盐酸调pH至2.5，再加入16％氯化钠盐析，过滤，收集第二次盐析物。

30％丙酮分级沉淀第2次锌沉淀盐析物溶于7倍量水中，加入3倍量丙酮，用4mol/L氨水调pH4.5，冷至0～5℃过夜，除去沉淀(沉淀另行回收)，清液用4mol/L氨水调pH6.0，加入20％醋酸锌，析出白色沉淀。

结晶过滤收集沉淀，按下列配方结晶：2％柠檬酸500ml，20％醋酸锌6.5ml，丙酮160ml，蒸馏水稀释至1000ml，结晶液冷却至0～5℃，用4mol/L氨水碱化至pH8.0，过滤除去沉淀。用10％柠檬酸调节pH6.0，搅拌结晶两天，虹吸除去清液，离心，收集，结晶，用蒸馏水洗2次，丙酮洗2次，五氧化二磷真空干燥。实施例13  NOD小鼠的饲服实验：

NOD小鼠是I型糖尿病的小鼠模型，雌性NOD小鼠在约30周后有75-85％会自发的发生I型糖尿病。通过对NOD小鼠的短期饲服实验，用5周龄小鼠每星期5mg用量饲服5周，后取胰腺切片进行电镜观察，比较饲服合成人胰岛素转基因的生菜叶片、烟草蛋白提取液或番茄果实的NOD小鼠与对照组胰腺β细胞的损伤状况，并依此判断其是否有效。试验表明，饲服转基因植物的NOD小鼠β细胞的损伤状况要明显好于饲服未转基因的对照组。

通过对NOD小鼠的长期饲服实验，每周5mg持续饲服，或饲服几周后停止，每周对NOD小鼠的实验组和对照组进行糖尿病发病率的检测及记录，比较并判断该饲服实验是否推迟或预防了NOD小鼠I型糖尿病的发生。试验表明，长期饲服转基因生菜叶片、烟草蛋白提取液、番茄果实的NOD小鼠糖尿病发病率均明显低于对照组。(见表3)

            表1植物偏爱密码子总结表(根据Murray E.E.)

	氨基酸	密码子		氨基酸	密码子
						1	Gly(G)	GGA	11	Ile(I)	ATC
2	Glu(E)	GAG	12	Thr(T)	ACC
						3	Asp(D)	GAT	13	Trp(W)	TGG
4	Val(V)	GTT	14	Cys(C)	TGC
						5	Ala(A)	GCT	15	Tyr(Y)	TAC
6	Arg(R)	AGG	16	Leu(L)	CTT
						7	Ser(S)	TCT	17	Phe(F)	TTC
8	Lys(K)	AAG	18	Gln(Q)	CAA
						9	Asn(N)	AAC	19	His(H)	CAC
10	Met(M)	ATG	20	Pro(P)	CCA

              表2所合成8条寡核苷酸片段、分子量及稀释情况No.1 5′-GATCCATGTT CGTTAACCAA CACC-3′No.2 5′-TTTGCGGATC TCACCTTGTT GAGGCTCTTT ACCTTGTTTG CGGAGAGAGG GGATTC-3′No.3 5′-TTCTACACCC CAAAGACCGG AGGACCATCT GGAGGAGGAA TCGTTGAGCA ATG-3′No.4 5′-CTGCACCTCT ATCTGCTCTC TTTACCAACT TGAGAACTAC TGCAACTAAG-3′No.5 5’-AATTCTTAGT TGCAGTAGTT CTC-3’No.6 5’-AAGTTGGTAA AGAGAGCAGA TAGAGGTGCA GCATTGCTCA ACGATTCC-3’No.7 5’-TCCTCCAGAT GGTCCTCCGG TCTTTGGGGT GTAGAAGAAT CCCCTCTCTC CGCAAAC-3’No.8 5’-AAGGTAAAGA GCCTCAACAA GGTGAGATCC GCAAAGGTGT TGGTTAACGA ACATG-3’

No.	1	2	3	4	5	6	7	8
									序号	K14166	K14167	K14168	K14169	K14170	K14171	K14172	K14173
总碱基数	24	56	53	50	23	48	57	55
									A	7	8	16	13	5	16	10	20
G	3	17	15	6	4	14	13	16
									C	8	11	13	16	4	8	19	9
T	6	20	9	15	10	10	15	10
									分子量	7229	17299	16382	15176	6993	14857	17340	17049
每管质量(ug)	82.5	82.5	82.5	82.5	82.5	82.5	82.5	82.5
									摩尔数(nmol)	11.4	4.77	5.04	5.44	11.8	5.55	4.76	4.84
稀释至(ul)	106.4	44.4	46.8	50.8	110.0	51.6	44.4	45.2

            表3 NOD小鼠的长期饲服转基因生菜、番茄和烟草试验

	数量(个)	时间(月)	存活数	糖尿病发病率
					转基因生菜	20	6	12	40％
转基因番茄	20	6	14	30％
					转基因烟草	20	6	11	45％
对照组	20	6	3	85％

            表4农杆菌YEB培养基配方

成分                             每升含量(克)牛肉膏提取物                            5.0酵母提取物                              1.0蛋白胨                                  5.0蔗糖                                    5.0MgSO₄.7H₂O                            0.5琼脂(固体培养基用)                      10

表5  生菜、番茄及烟草组织培养用MS培养基成分                                    每升含量

           (分化培养基)10x      MS大量元素母液                   100ml100x     MS微量元素母液                   10ml100x     铁盐母液                         10ml100x     维生素母液                       10ml1mg/ml   6-苄基腺嘌呤                     1.0ml1mg/ml   萘乙酸                           0.1ml琼脂                                      9克PH5.8

           (生根培养基)10x      MS大量元素母液                   100ml100x     MS微量元素母液                   10ml100x     铁盐母液                         10ml100x     维生素母液                       10ml琼脂                                      9克PH5.8

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(E coli.)，保藏代号为p11Z-InsK，保藏编号为CGMCC NO.0723，保藏日期为2002年3月8日。

总之，本发明提供了一种利用转基因生菜、番茄和烟草做为生物反应器生产人胰岛素方法，并且提供了按植物偏爱密码子合成的人胰岛素基因的DNA序列，构建了组成型表达的CaMV35S启动子驱动人胰岛素基因以及果实专一性启动子驱动人胰岛素基因的高效植物表达载体，通过农杆菌介导法转化生菜、番茄和烟草，证明该合成的基因能在植物中高效表达，动物试验亦证明有效，能够用于大规模生产。

Claims (8)

1、一种利用转基因生菜、番茄和烟草生产胰岛素的方法，其特征在于：人工合成人胰岛素基因后，再将通用启动子CaMV35S或番茄果实专一性启动子与所述胰岛素基因片段连接，转化后使启动子能够驱动所述胰岛素基因在植株中表达，使表达的胰岛素具有类似天然胰岛素的三维结构。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述A链和B链是由植物偏爱的密码子指导合成的，其中A链中有13个碱基与天然的A链不同，B链中有18个碱基与天然的B链不同，也应包括其它更换了一定数量碱基，符合植物偏爱密码子的特征。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：人工合成的胰岛素基因不仅限于植物密码子的应用，应扩展到其它有利于表达量提高的基因结构改造。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的A链和B链之间用6个氨基酸进行连接，这6个氨基酸为GGPSGG或其它目的是为了表达的胰岛素能折叠成类似天然胰岛素三维结构的多个氨基酸顺序。还包括A链和B链之间自主的断裂结构设计，以及将A链和B链的编码顺序分别放在不同的转录单位之中。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的人胰岛素基因3’端的碱基不仅包括编码内质网滞留序列KDEL四个氨基酸的12个碱基，也应包括其它类似的目的是为了使胰岛素滞留在内质网中的其它多个氨基酸顺序。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用定位重组系统Cre/lox和FLP/FRT来控制胰岛素基因在F2代中的删除。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过定位重组系统Cre/lox与激素ipt基因调节的共同作用使产生人胰岛素的番茄不能正常结实。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的转化采用农杆菌介导法或微粒轰击法。

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