CN1044385C

CN1044385C - 性状转变的抗稻属叶条纹病病毒性稻属及其制造方法

Info

Publication number: CN1044385C
Application number: CN92115177A
Authority: CN
Inventors: 朱亚峰; 早川孝彦; 鸟山重光
Original assignee: Agricultural Environmental Technology Research Institute Of Ministry Of Agriculture Forestry And Fisheries
Current assignee: Nat Inst For Agro Enviromental Sciences
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 1999-07-28
Anticipated expiration: 2007-12-02
Also published as: JPH07313173A; TW290426B; KR100255474B1; KR930013120A; CN1075335A

Abstract

用在禾本科植物中起作用的起动子下流引入编码稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因和末端的载体，使稻属性状转变，通过表达这样的基因，培育出具有抗稻属叶条纹病病毒性的稻属。使用这种方法，利用过去已知的稻属叶条纹病病毒外壳蛋白质以外的非结构蛋白质，能够培育出抗该病毒性的稻属。

Description

性状转变的抗稻属叶条纹病病毒性稻属及其制造方法

本发明涉及编码稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因以及引入这种基因的对稻属叶条纹病病毒感染具有抵抗性的稻属及其制造方法。

作为植物病毒，过去已知有以烟草花叶病病毒和黄瓜花叶病病毒为首的许多病毒。这些植物病毒成为使农作物受病害而大量减收的因素。在这些病毒中，稻属叶条纹病病毒分布在日本、中国、苏联、韩国等地，使这些国家的稻属作物大量受害。在日本每年平均约有10％的稻属受到稻属叶条纹病病毒危害。

但是，由于实用的抗病毒剂极少，其防除多半是依赖去除感染源植物和驱除媒介虫。除了这样的物理的或化学的防除手段外，作为生物耕种手段，可以举出弱毒病毒和抵抗性品种的利用。利用弱毒病毒的防除法是利用若预先在植物中接种病症弱的病毒，则往后即使感染具有强病症的强毒株，也能抑制其繁殖而不发病这一事实。此法对于烟草花叶病病毒(TMV)等一部分病毒正逐步实用(Ann.Rev.Phytopathol.14(1976)；Phytopathol.57,1347(1976)；PlantDisease Report64,538(1980))。这样的现象很早就知道，称作交叉保护作用。

另一方面，由杂交育种产生的抗病毒性品种也用稻属、大豆属、黄瓜属、萝卜属、烟草、番茄属等培育出，例如，已知把抗稻属叶条纹病毒性基因引入稻属栽培种的方法(中国农试报A16,39)。

近年来，已报道将编码病毒外壳蛋白质的基因引入植物中，使其在植物体内表达，培育出抗病毒性植物(Ann.Rev.Phytopathol.28,451(1990))。另外，已报道利用将黄瓜花叶病病毒的随体RNA引入植物而得到抗病毒性植物(Nature328,799(1985))，再有，利用反意RNA的病毒防除法(Proc.Natr.Acad.Sci USA86,6949(1989))。在稻属中，本发明人等将编码稻属叶条纹病病毒的基因组RNA3的稻属叶条纹病病毒的外壳蛋白质基因引入稻属，成功地培育出耐稻属叶条纹病病毒性稻属(平成3年日本植物病理学会大会讲演要旨集p193；Proc.Natl.Acad.Sci USA 89,(1992))。

最近，将编码烟草花叶病病毒的非结构蛋白质(54kD蛋白质)的基因引入烟草，培育出具有强抗烟草花叶病病毒性植物。关于其抗毒理有许多不明之处，另外，关于其他病毒，没有报道用这样的非结构蛋白质培育出抗病毒性植物。本发明要解决的问题是，在稻属中表达其效果迄今未知的非结构蛋白质，赋予稻属抗病毒性。

稻属叶条纹病病毒具有分节粒子结构，属于植物的细瘦病毒类。在病毒粒子内包含4种2条链RNA和4种1条链RNA(分别称作2条链或1条链RNA1、RNA2、RNA3和RNA4)。2条链RNA1-4对应于各自的1条链RNA1-4复制物(J.gen.Virol.70,505(1989))。在病毒粒子中已看到单一外壳蛋白质和RNA聚合酶。另一方面，在稻属叶条纹病病毒感染稻属中，除外壳蛋白质和RNA聚合酶外，还检测出由病毒基因组来的感染特异蛋白质(Microbiological Sciences3,347(1986))。感染特异蛋白质的分子量因病毒分离株而异(Proc.Assoc.P1.Pro.Kyushu 56,423(1990))，关于这种蛋白质的生理作用还不清楚。已报道稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质由RNA4编码，外壳蛋白质由RNA3编码(Virology 177,371(1990))。

本发明人发现，用编入含稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质基因的cRNA的载体DNA，改变稻属性状，通过表达这样的基因，能够培育出具有抗稻属叶条纹病病毒的稻属，从而完成了本发明。

也就是说，本发明的要点是，在禾本科植物中起作用的启动子下游引入编码稻属叶条病病毒感染特异蛋白质的基因及末端为特征的载体、用这一载体转变性状的稻属及其制造方法。

虽然按照下述那样能够完成本发明，但只要不超过其范围，就不限于以下所述。

还有，虽然下面作为本发明的一个例子就稻属作了描述，但是作为本发明的禾本科植物，除稻属外，可列举出黑麦属、大麦属、小麦属、燕麦/燕麦属、狗尾草/狗尾草属、稗属、马唐、结缕草属、狗尾草/芒属、甘蔗属、玉米属和薏苡属等。

病毒和病毒RNA的提取、纯化

例如，将感染稻属叶条纹病病毒分离株T(J.gen.Virol,70,505-511(1989)，的稻属叶在磷酸缓冲液(10mM二乙基氨荒酸盐、0.1M磷酸氢二钠，PH7.2)中粉碎后，加入1/5量的三氟三氯代乙烷进行澄清化，然后在20％蔗糖缓冲器中间层，以123000×g离心分离1.5小时。将得到的沉淀溶入10mmol磷酸缓冲液(PH7.5)中，以4000×g离心分离10分钟。接着加入硫酸铵并搅拌5分钟使上清液成为35％饱和，然后以4000×g离心分离5分钟。将上清液稀释成4倍后，加入聚乙二醇并搅拌1小时以上，以使最终浓度为8％。以30000×g将其离心分离30分钟后，借助加上蔗糖密度梯度离心分离(10-40％、100000×g、2.5小时)沉淀物，能够纯化病毒粒子。用这种方法分离成B、M、nB(从上层至下层)三种成分而得到病毒粒子。本发明中使用的RNA4含有全成分。

由纯化的病毒提取全成分病毒RNA例如用SDS-苯酚法提取。即在纯化的病毒悬浮液中加入SDS(2％)、膨润土(12.5mg/ml)和EDTA(2.5mM)，再等量加入苯酚而除去蛋白质，然后按照常规方法反复进行乙醇沉淀，就能离析纯化RNA。用蔗糖密度梯度分离从所得的nB部分可以提取RNA1-4的混合液。从B和M部分能提取RNA2-4的混合液。

由纯化的RNA合成cDNA

用由B或M部分得到的RNA2-4的混合液合成cDNA。首先，由RNA4的3’末端碱基顺序(J.gen Virol.71,2817(1990))合成在RNA4中具有特异顺序的引物(5’GGGCATATCTTTTGAGATTA3’；顺序表顺序号：3)。使用这样的引物，以全RNA作为模板，按照Gubler-Hoffman的方法(Gene 25,263(1983))合成cDNA。所得到的cDNA是1条链，所以将其作为模板再合成2条链cDNA。

cDNA的克隆及顺序

下面，以下进实施例所示的方法、例如使用一千顺序用的缺失元件(宝酒造制)，将来自选择的RNA4的克隆制成克隆的欠缺变异株。以从100至200碱基程度的比例选拔具有欠缺的变异株，然后以Sanger等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463(1977))决定各变异株的碱基顺序。接着，由所得的碱基顺序，合成引物(5’CAACTTTCAACATACTTGTT3’；顺序表顺序号：4)，作成覆盖RNA4链全长的cDNA。按与上述相同的方法进行克隆来决定碱基顺序。这样就能够决定RNA4的全碱基顺序。

培育性状转变植物

稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质从RNA4(2157碱基)的第55碱基至第591碱基被编码(顺序表的顺序号2)。以所得的RNA4的cDNA为基，例如用逆反引物(宝酒造制)和合成引物(5’TAATGCTAGCACTCGTGG3’；顺序表顺序号：5)、利用Saiki等人的PCR法(Nature324,126(1986)使也含媒介物pUC 19(Gene33,103(1985))的克隆细胞，而使1-633碱基顺序放大，例如插入pUC19的SmaⅠ部位。例如用限制酶SalⅠ和EcoRⅠ切出这样的基因，编入在禾本科植物中表达的启动子和末端、或者根据需要编入具有内含子的胞质遗传体载体。

所使用的启动子，可以列举例如来自CaMV35s(pBI221:EMBO.J.6,3901-3907,1987)等的菜花花叶病病毒的起动子、rbcs(ribulosel.5-bisphosphate carboxylase)、Cab(chlorophyll a/b binding protein)等(Science,244,174,1989)已确认在植物中表达的启动子。

作为末端，可列举出例如来自菜花花叶病病毒的末端、来自NOS(蓝曙红合成酶)基因的末端等。

另外，在启动子和结构基因之间配置内含子的载体也能作为高表达的载体使用，所述的内含子例如可列举出玉米Adhl(乙醇脱氢酶)的第一内含子(Genes & Development,1,1183-1200,1987)、蓖麻Cat(过氧化氢酶)的第一内含子(Tanaka等人，Nucleic Acids Research,18,6767-6770,1990)等。

在本发明中，还使用从潮霉素磷酸转移酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因和β-葡糖苷酸酶基因等中选择的2种以上外来基因，而且，其中一种最好是使用当选择作为目的的菌落时有效的所谓选择标记基因。作为这样的选择标记基因，潮霉素磷酸转移酶是理想的。

在本发明中，可以使用在同一胞质遗传体中有选择标记基因和其它外来基因的细胞遗传体，也可以组合使用具有选择标记基因的胞质遗传体和具有其它外来基因的胞质遗传体。

载体可用于使禾本科植物性状转变。也就是将由禾本科植物来的原生质体悬浮在液体介质中，外加电脉冲引入该载体后，用含有稻属培养细胞的培养基培养，形成集群，从该集群再生植物的方法(Shimamotoet al,Nature,337,274-276,1989)。原生质体可以按以下所述调制。例如，用R2培养基等通常使用的液体培养基培养取自日本晴、Koshipikali、Sasanishiki等栽培稻属的成熟和末成熟种子、幼叶、根组织的悬浮细胞或愈伤组织，然后按照常规方法，例如在含纤维素酶和胞壁质酶等细胞壁分解酶的酶液中，以25-30℃、0-50每分钟冲程次数的条件进行酶处理3-16小时。酶处理结束后，过滤除去末消化物，在滤液中加入2-5倍量的KMC液(0.118M氯化钾、0.081M氯化镁、0.085M氯化钙，pH6.0)(Theor.Appl.Genet.,53,57-63,1978)，然后离心分离，能够得到纯化的原生质体。

将含有上述调整过的基因的表达载体(例如1-100μg/ml)和来源于上述植物的原生质体(例如(2-10)×10⁶个/ml)悬浮在含30-200mM氯化钾、0-50mM氯化镁和0.2-0.6M甘露醇的缓冲液等液体介质中，对其施加电脉冲将胞质遗传体引入原生质体中。适宜的电脉冲处理是使用100-1000μF的电容器、以所产生的200-1000V/cm的初期电压的直流脉冲、脉冲持续时间1-50ms的条件进行(参照特开平1-181791号公报)。

将上述电脉冲处理过的原生质体悬浮在例如含R2培养基(Plant.Cell.Physiol.,14,1113,1973)的无机成分和MS培养基(Murash igeandskoog,15,473-497,1962)的维生素混合液的液体培养基(R2/MS)或者MS培养基，最好作为氮源含0.2-0.5％硝酸钾的培养基中，将其与含1.0-3.0％左右的琼脂糖的R2/MS或MS培养基等量反复混合，然后迅速在培养皿中扩展而薄薄地凝固。此时最好是使原生质体的浓度为约(5-50)×10⁵个/ml。

将固化的琼脂糖切成5-20mm大小，在上述液体培养基上培养。此时，在使用来自禾本科植物的原生质体时，最好使稻属培养细胞在培养基中以大约100-300mgFW/培养皿共存，一边以20-50rpm的旋转慢慢振动，一边在暗条件下于23-27℃进行培养。与稻属培养细胞共存的方法除上述的方法外，还有将含原生质体的液体培养基放入底部设置有膜滤器的容器内、然后将该容器与稻属培养细胞一起浸入装有液体培养基的培养皿中而共存的方法。这里所述的稻属培养细胞最好是由旺盛分裂的细小细胞块组成的。这样的培养细胞按照下述公知方法很容易得到，即将例如由稻属植物的种子、茎、根或药得到的愈伤组织在液体培养基中中间培养，选拔分裂速度快的细胞。

在培养后2-4周，形成0.5-1mm程度的集群。此时，例如在作为外来基因引进也是选择标记基因的潮霉素磷酸转移酶基因(hph)时，如果培养开始后7-20天在10-100μg/ml程度的培养液中添加潮霉素，再继续培养，就能够有效地进行目的为性状转换细胞的选择。接着将这种集群加入增殖培养基上、在照明下(1000-4000米烛光)、于23-27℃培养2-4周，得到φ3-6mm的愈伤组织。上述增殖培养基例如是在R2培养基中添加植物激素，如添加约2mg/升的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.1-1.0％的琼脂糖的琼脂培养基。单独分离各个愈伤组织，并且在作为外来基因引入hph基因时，置床在含潮霉素20-50μg/升的同增殖培养基中培养，确定潮霉素的耐受性。

将这种愈伤组织若用例如含0.5-1.5％琼脂糖的R2/MS培养基(0.1-1％吲哚乙酸、0.5-2％玉米素)、在23-27℃、2000-4000米烛光条件下培养，结果在2-10周看到形成不定胚或不定芽。用不含激素的R2/MS培养基再培养2-3周，得到能移植的植物幼体。这样得到的植物幼体如果移植到在侄石等中使之成长，就能够得到性状转变的稻属植物体。

抗叶条纹病病毒感染性的确认

由再生的稻属的叶提取蛋白质，用Western印遗分析确认表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的性状转变稻属。这样的性状转变稻属和作为对照物使用的未表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的稻属与正常稻属一起放入装有一定数的病毒虫(小褐稻虱)的培育箱中使之感染。经过3-5天后，清除虫，用杀虫剂杀死残留的虫，然后在隔离温室中观察至发病。此后，由性状转变体和对照物的病毒病的感染率测定抵抗性。

实施例

下面虽然列举实施例说明本发明，但只要不超出本发明的范围，本发明不限于下面的实施例。

实施例1 病毒粒子和病毒RNA的精制

将带有稻属叶条纹病毒(J.gen. Virol.70,505(1989))的小褐稻虱接种在小麦上，使病毒繁殖一周后冻结。将这样冻结的感染叶在磷酸缓冲液(10mM二乙基氨荒酸盐、0.1M磷酸氢二钠，PH7.2)中粉碎后，加入1/5量的三氟三氯代乙烷，澄清后在20％蔗糖缓冲器中间层，以123000×g离心分离1.5小时。将沉淀溶解在10mM磷酸缓冲液(PH7.5)中，以4000×g离心分离10分钟。接着加入硫酸铵并搅拌5分钟使上清液成为35％饱和，然后以4000×g离心分离5分钟。将上清液稀释约4倍后，加入聚乙二醇并搅拌1小时使最终浓度为8％。将其以30000×g离心分离30分钟后，对沉淀进行蔗糖密度梯度离心分离(10-40％、100000×g、2.5小时)。病毒粒子被分离成B、M、nB(从上层至下层)三部分。通过离心分离(123000×g、3小时)含病毒的各层，纯化病毒粒子。本发明中使用的RNA4包含全成分。

用SDS一苯酚法从精制的病毒中提取全病毒RNA。也就是在纯化的病毒悬浮液中加入SDS(2％)、膨润土(12.5mg/ml)和EDTA(2.5mM)，再加入等量的苯酚除去蛋白质，然后按照常规方法反复进行乙醇沉淀，离析纯化出RNA。按照这种方法从蔗糖密度离心分离得到的B和M部分能提取RNA2-4的混合液。

实施例2 cDNA的合成和克隆

用RNA2-4的混合液合成cDNA。首先，由直接顺序决定RNA4的3’末端碱基顺序(J.gen.Virol 71,2871(1990))，然后合成引物(5’GGGCATATCTTTTGAGATTA3’；顺序表顺序号：3)。以RNA2-4作为模板使用逆转录酶、按照Gubler-Hoffman的方法(上述)合成cRNA。所得到的cRNA是一条链，因此以它作为模板再合成两条链cRNA。将两条cRNA连接在细胞遗传体pUC19(Gene33,103-119,(1985))的SmaⅠ部位上，用大肠杆菌DH5α进行性状转换，实现克隆。为了调查对应3个RNA中的哪一个，所得的克隆从各个克隆的两末端以200碱基程度作顺序决定碱基顺序。将这些与已记载的某种RNA4的3’末端碱基顺序(J.gen.Virol.71,2817(1990))进行比较，根据与RNA4的3’末端约50碱基的相同性，判断由RNA4来的克隆，然后选择这样的克隆。用Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463(1977)的方法确定这样的克隆的碱基顺序后，合成对于在5’端附近具有适当顺序区域的引物(5’CAACTTTCAACATACTTGTT3’；顺序表顺序号：4)，用引物伸长法合成RNA4整个区域的cRNA。

实施例3 cDNA的顺序和稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质基因的决定

在上面，使用宝酒造制的一千顺序用的缺失元件将来自选择的RNA4的克隆制作成克隆欠缺变异株。以100至200碱基程度的比例选拔保持欠缺的变异株，按照Sanger等人的方法(上述双去氧法)决定各变异株的碱基顺序。可以看出，RNA4由2157个碱基构成，与在病毒RNA的5’端有178个氨基酸(顺序表的顺序号1)，分子量为20541的蛋白质的编码区域，和在病毒RNA中是在互补的RNA的5’端有286个氨基酸、分子量为32474的蛋白质编码区域对应的RNA(J.gen.Virol.,73,1309-1312(1992))。接着，用计算机分析(GENETYX,Software DevelopmentCo.)，求出由RNA4编码的蛋白质的推断氨基酸顺序。另一方面，用PICO·TAG法(Waters)分析由感染稻属纯化的稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的氨基酸组成。将所得结果与由稻属叶条纹病病毒编码的、被认为是稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的编码区域推定的氨基酸组成比较，看到98％的相同性。因此确定了分子量约20000的蛋白质是稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质，而且这样的区域是编码稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因。该碱基顺序示于顺序表的顺序号2中。另外，在本发明中，在能够对稻属赋予抗病毒性的范围内，除去一部分氨基酸或碱基，进行置换或者追加等的改变，也包括在本发明中。

实施例4 性状转变用胞质遗传体的构筑

作为性状转变用载体，将pIG221(Plant Cell Physiol.31,805(1990))的β-葡糖苷酸酶的编码区域与潮霉素磷酸转移酶交换，利用缺失内含子上流的ATG的稻属高表达潮霉素耐性载体(pIZI)。在这样的pIZI载体中，具有菜花花叶病病毒的355启动子和由蓖麻的过氧化氢酶来的内含子、由土壤杆菌的合酶基因来的末端。

用实施例2和实施例3使含有由选择的RNA4来的cDNA而来的稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因，使用逆反引物(宝酒造制)和引物(5’TAATGCTAGCACTCGTGG3’；顺序表的顺序号：5)用PCR法放大，用T4聚合酶(宝酒造制)处理成平滑末端后，插入pUC19(上述)的SmaⅠ的部位。用限制酶ECoRⅠ切断这样的克隆后，用T4聚合酶处理成平滑末端，再用限制酶SalⅠ切断，回收含有编码稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因的片段。用EcoRⅠ和SalⅠ切断pIZI载体，除去潮霉素耐性基因(hph)。此时EcoRⅠ部位用T4聚合酶形成平滑末端。使用DNAティゲ-ションキツト(宝酒造制)，使这样得到的菜花花叶病病毒的355启动子和具有蓖麻过氧化氢酶的内含子、ノパリンシンタ-ゼ的末端的载体及编码稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因环状化。用大肠杆菌DH5α进行性状转换，用氨苄青霉素选拔，得到性状转换用胞质遗传体pLAN160。

实施例5 利用电泳激法进行稻属原生质体性状转换

(1)稻属原生质体的离析

本发明中使用的来源于稻属植物的原生质体是取自栽培稻属日本晴的成熟种子，它是按以下所述方法得到的。将成熟种子的悬浮细胞在R2培养基中培养后，用含4％纤维素酶RS、1％胞壁质酶R10和0.4M甘露醇的酶液(PH5.6)在30℃处理3-4小时。过滤酶处理液后，在滤液中加入4倍量的KMC液(KCl 0.118M、CaCl₂0.085M、MgCl₂0.081M,PH6.0，上述)，用离心分离收集沉降的原生质体，然后再用KMC液洗涤2次。

(2)电脉冲处理

将上述(1)中调整的原生质体悬浮在EP3缓冲液(含70mMKCl、5mM MgCl₂、0.4M甘露醇、0.1％MES的缓冲液(PH5.8))中，形成4×10⁶个/ml的悬浮液。在这种悬浮液中添加上述实施例4中得到的胞质遗传体pLAN160(60g/ml)及作为选拔标记具有潮霉素磷酸转移酶基因的胞质遗传体pIZI(60ug/ml)，在4℃冷却5分钟后，移入减菌的塑料小室中，用平行电极施加直流电脉冲。此时，用800uF电容器加上300V/cm的初期电压，脉冲持继时间是10ms。施加脉冲后在4℃冷却10分钟，然后与等量的R2/MS原生质体琼脂糖培养基(Mol.Gen.Gent.,206,408(1987))混合，固化形成0.7mm厚。此时的细胞密度是约3×10⁶个/ml。

(3)原生质体的培养

将含有进行过上述(2)的电脉冲处理的原生质体的琼脂糖切成1cm四方形的大小，然后放入加有5ml R2/MS液体原生质体培养基的φ6cm的盘中，再加入约100mg(新鲜重量)作为培养细胞的稻属细胞。

这样的稻属培养细胞按以下所述进行调制。即，将来自成熟胚的愈伤组织在液体培养基中继续培植1周，使用存在于制作悬浮培养液中的分裂旺盛的细小(φ1mm以下)细胞块作为培养细胞。

原生质体的培养是在约25℃进行大约10天，在暗处边振动(50rpm)边培养。在这种培养之后，洗出培养细胞。再培养3-4天后在培养基中加入潮霉素B，使形成30μg/ml，然后培养2-3周。此后，将琼脂糖片放置在N6软琼脂糖(2mg/l 2,4D、0.5mg/l苄基氨基嘌呤、6％蔗糖、0.25％琼脂糖，PH5.6)中，取出变大的集群，转移到R2繁殖培养基(2m8/l2,4D、6％蔗糖、0.5％琼脂糖，PH5.6)中繁殖2-3周。耐性愈伤组织的出现频度相对于生成的集群是约0.5％。

(4)植物体的再生

将(3)中得到的愈伤组织放置在R2/MS再生培养基(1mg/l玉米素、0.5mg/l吲哚乙酸、3％山梨糖醇、2％蔗糖、1％琼脂糖，pH5.8)中，在亮处培养3-10周，出现芽及根。在芽长成2cm程度时，移至含相同培养基的品红箱，使之长成幼小植物。再移移到侄石箱中生长发育，便得到性状转变体稻属。

(5)性状转变植物的解析

首先，按照Richards方法(Current Protocol in MolecularBiology 2.3.1(1987))从上述(3)中得到的愈伤组织提取DNA，用由35S起动子上流侧的碱基顺序合成的引物(5’CTCAGAAGACCAAAGGG3’，顺序表的顺序号：6)和由稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质基因下游侧的碱基顺序合成的引物(5’TAATGCTAGCACTCGTGG3’，顺序表的顺序号：5)进行PCR。将外来基因片段利用PCR放大的愈伤组织作为性状转换体愈伤组织，移到N6再生培养基(1mg/l玉米素、0.5mg/l吲哚乙酸、3％山梨糖醇、2％蔗糖、pH5.8)。在这个阶段引入外来基因的愈伤组织的比例是潮霉素耐性愈伤组织的约90％。

接着，从PCR正愈伤组织再生的性状转变体中采集一部分幼叶，在含1％SDS、1mM碘乙酸的Tris缓冲液中磨碎，在100℃热处理5分钟。利用15000×g离心分离10分钟进行澄清化，用含1％SDS的10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，将蛋白质电移到尼龙膜(Immobilon，微孔)中后，用抗稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质抗体和碱磷酸酶结合二次抗体进行Western印迹分析，证实了表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的性状转变体。在再生的7个克隆中，有4个克隆中证实了稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的表达。

再有，用Chomczynski和Sacchi的方法(Annal.Biochem 162,156(1987))从性状转变体的叶中提取RNA。按照阿马夏目公司的报告书，用含2.2M的甲醛的1％琼脂糖对10μg的RNA进行电泳。用真空抽吸装置转移到尼龙膜(ハィポンドN、アマシャム)，以稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质基因的编码区域作为探针进行Northern印迹分析，证实表达了mRNA。此时，探针使用多级标定仪器(阿马夏目)，以³²P-dCTP标记。

实施例6 性状转变体的抗叶条纹病病毒性的证实

使用带有稻属叶条纹病病毒的害虫(小褐稻虱)，对经过实施例5中所述Northern和Western印迹分析证实表达了稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的性状转变稻属、4个克隆(22个体)进行感染试验。作为对照物使用了未表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的性状转变稻属和非性状转变稻属。

将这样的供试验个体放入光蝉饲育箱中，在该箱中，以10个带病毒的小褐稻虱对1个稻属个体的比例感染稻属叶条纹病病毒，经过3-5天后，清除附在稻属上的虫，再用杀虫剂杀死残存的害虫，然后转移到隔离温室中观察至发病。比较性状转变体与作为对照物用的2种稻属的稻属叶条纹病病毒病发病率。表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的稻属的性状转变体的稻属叶条纹病病毒病发率是9％，作为对照物用的2种稻属的稻属叶条纹病病毒病发病率总共是83％。由此证实了，表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的性状转变稻属对稻属叶条纹病病毒是具有抵抗性的。

实施例7 向稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的下代遗传的证实

采集表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的性状转变体的种子并使之发芽，该蛋白质是在实施例6中所示的对稻属叶条纹病病毒显示抵抗性。用与实施例5中所述相同的方法进行Western印迹分析，调查在性状转变中使用的基因是否遗传给下一代并表达。观察2个系统的性状转变体，表达稻属叶条纹病病毒特异蛋白质的比例分别是22/25(88％)、23/27(85％)，可以证实该基因遗传给了下一代。

按照本发明，将病毒外壳蛋白质以外的非结构蛋白质的稻属叶条纹病病毒的感染特异蛋白质基因引入稻属中，在稻属中表达稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质或者这种基因的mRNA，能够培育出抗稻属叶条纹病病毒感染性稻属。

顺序表

顺序号：1

顺序长度：178

顺序类型：氨基酸

布局：直链状

顺序种类：蛋白质

来源：稻属叶条纹病病毒

顺序Met Gln Asp Val Gln Arg Thr Ile Glu Val Ser Val Gly Pro Ile Val Gly Leu1 5 10 15Asp Tyr Thr Leu Leu Tyr Asp Thr Leu Pro Glu Thr Val Ser Asp Asn Ile Thr

20 25 30 35Leu Pro Asp Leu Lys Asp Pro Glu Arg Val Thr Glu Asp Thr Lys Lys Leu Ile

40 45 50Leu Lys Gly Cys Val Tyr Ile Ala Tyr His His Pro Leu Glu Thr Asp Thr Leu55 60 65 70Phe Ile Lys Val His Lys His Ile Pro Glu Phe Cys His Ser Phe Leu Ser His

75 80 85 90Leu Leu Gly Gly Glu Asp Asp Asp Asn Ala Leu Ile Asp Ile Gly Leu Phe Phe

95 100 105Asn Met Leu Gln Pro Ser Leu Gly Gly Trp Ile Thr Lys Ash Phe Leu Arg His

110 115 120 125Pro Asn Arg Met Ser Lys Asp Gln Ile Lys Met Leu Leu Asp Gln Ile Ile Lys

130 135 140Met Ala Lys Ala Glu Ser Ser Asp Thr Glu Glu Tyr Glu Lys Val Trp Lys Lys145 150 155 160Met Pro Thr Tyr Phe Glu Ser Ile Ile Gln Pro Leu Leu His Lys Thr Sto

165 170 175 178

顺序号：2

顺序长度：537

顺序类型：核酸

链数：一条链

布局：直链状

顺序种类：其他核酸

来源：稻属叶条纹病病毒

顺序ATG CAA GAC GTA CAA AGG ACA ATA GAA GTT TCT GTT GGT CCT ATT GTA 48GGC CTA GAT TAC ACT CTA TTG TAT GAC ACT CTG CCT GAG ACT GTT AGC 96GAT AAC ATT ACT CTA CCT GAT TTG AAA GAT CCA GAG AGA GTC ACG GAA 144GAT ACT AAA AAG CTA ATA CTC AAA GGC TGT GTT TAC ATA GCA TAT CAT 192CAC CCC TTG GAG ACT GAC ACC CTT TTC ATC AAA GTT CAC AAA CAT ATA 240CCA GAG TTT TGT CAC TCA TTC CTA TCA CAC CTT CTA GGA GGT GAA GAT 288GAT GAC AAT GCT CTT ATA GAC ATT GGT CTG TTT TTC AAC ATG TTG CAA 336CCT TCT TTG GGC GGT TGG ATA ACC AAG AAT TTT CTT AGA CAC CCT AAT 384AGG ATG TCT AAG GAC CAA ATT AAA ATG CTC CTG GAT CAG ATC ATC AAG 432ATG GCT AAG GCT GAG AGC TCA GAC ACA GAA GAG TAT GAA AAA GTG TGG 480AAG AAG ATG CCA ACT TAT TTT GAA TCA ATT ATC CAA CCT CTT CTT CAT 528AAA ACA TAG 537

顺序号：3

顺序长度：20

顺序类型：核酸

链数：一条链

布局：直链状

顺序种类：其他核酸

顺序

GGGCATATCT TTTGAGATTA 20

顺序号：4

顺序长度：20

顺序类型：核酸

链数：一条链

布局：直链状

顺序种类：其他核酸

顺序

CAACTTTCAA CATACTTGTT 20

顺序号：5

顺序长度：18

顺序类型：核酸

链数：一条链

布局：直链状

顺序种类：其他核酸

顺序

TAATGCTAGC ACTCGTGG 18

顺序号：6

顺序长度：537

顺序类型：核酸

链数：一条链

布局：直链状

顺序种类：其他核酸

顺序

CTCAGAAGAC GAAAGGG 17

附图的简单说明

图1是在实施例中得到的性状转变用胞质遗传体pLAN160的模式图。

Claims

1．一种用于在禾本科植物细胞中表达下述蛋白质的表达载体的制造方法，它包括将编码顺序号1所示的氨基酸顺序表示的稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因导入启动子的下游，

所述顺序号1表示的氨基酸顺序如下Met Gln Asp Val Gln Arg Thr Ile Glu Val Ser Val Gly Pro Ile Val Gly Leu1 5 10 15Asp Tyr Thr Leu Leu Tyr Asp Thr Leu Pro Glu Thr Val Ser Asp Asn Ile Thr

110 115 120 125Pro Asn Arg Met Ser Lys Asp Gln lle Lys Met Leu Leu Asp Gln Ile Ile Lys

165 170 175 178

2．根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述编码稻属叶条纹病病毒感染特异蛋白质的基因具有顺序号2的DNA顺序，

所述顺序号的DNA顺序如下ATG CAA GAC GTA CAA AGG ACA ATA GAA GTT TCT GTT GGT CCT ATT GTA 48GGC CTA GAT TAC ACT CTA TTG TAT GAC ACT CTG CCT GAG ACT GTT AGC 96GAT AAC ATT ACT CTA CCT GAT TTG AAA GAT CCA GAG AGA GTC ACG GAA 144GAT ACT AAA AAG CTA ATA CTC AAA GGC TGT GTT TAC ATA GCA TAT CAT 192CAC CCC TTG GAG ACT GAC ACC CTT TTC ATC AAA GTT CAC AAA CAT ATA 240CCA GAG TTT TGT CAC TCA TTC CTA TCA CAC CTT CTA GGA GGT GAA GAT 288GAT GAC AAT GCT CTT ATA GAC ATT GGT CTG TTT TTC AAC ATG TTG CAA 336CCT TCT TTG GGC GGT TGG ATA ACC AAG AAT TTT CTT AGA CAC CCT AAT 384AGG ATG TCT AAG GAC CAA ATT AAA ATG CTC CTG GAT CAG ATC ATC AAG 432ATG GCT AAG GCT GAG AGC TCA GAC ACA GAA GAG TAT GAA AAA GTG TGG 480AAG AAG ATG CCA ACT TAT TTT GAA TCA ATT ATC CAA CCT CTT CTT CAT 528AAA ACA TAG 537