KR101013092B1

KR101013092B1 - 벼 줄무늬잎마름병 저항성 형질전환 벼 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101013092B1
Application number: KR1020090025511A
Authority: KR
Inventors: 김율호; 박향미; 곽도연; 이봉춘; 이장용; 최만수; 신동범
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2011-02-14
Also published as: KR20100107295A

Abstract

본 발명은 벼 줄무늬잎마름병 저항성 형질전환 벼 및 그의 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 벼 줄무늬잎마름병(Rice stripe virus, RSV)의 외피 단백질(coat protein, CP) 유전자 염기서열을 센스와 안티센스 방향으로 동시에 벼 식물체내에 발현시켜 이들 센스와 안티센스 RNA 단편이 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 형성하게 함으로써, 줄무늬잎마름병을 유발하는 다양한 바이러스 계통에 대해 안정적인 저항성을 나타내는 형질전환 벼 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 RSV-CP-SW 유전자를 센스 방향과 안티센스 방향으로 동시에 발현시켜 dsRNA를 생성하는 형질전환 식물체는 벼 줄무늬잎마름병의 다양한 계통에 대해 고도의 저항성을 나타내면서도 표현형에서 차이를 보이지 않아 저항성 유전자원을 이용한 기존 육종 방법의 한계를 극복할 수 있는 효과적인 방법이 될 수 있다. 또한, 매개 해충인 애멸구 방제에 투입되는 농약 및 방제노력을 획기적으로 절감할 수 있어 인체와 환경에 안전한 친환경 농산물을 생산할 수 있다.

벼 줄무늬잎마름병, 저항성, 형질전환 벼, RNA 간섭현상

Description

벼 줄무늬잎마름병 저항성 형질전환 벼 및 이의 제조방법{Rice Stripe Virus Resistant Rice Transformants and Method of Producing Thereof}

벼 줄무늬잎마름병은 벼, 보리, 밀, 호밀, 기장, 조, 옥수수, 귀리, 피, 바랭이, 강아지풀 등 42종의 화본과 식물을 숙주로 하며 벼의 주요 해충인 애멸구에 의해 영속적으로 경난전염 되는 사상형의 바이러스 병이다. 벼 줄무늬잎마름병에 감염된 벼는 이삭이 패지 않고 말라 죽어 수확량 감소의 주요 원인이 되며 최근 기후 온난화로 인해 애멸구의 발생 밀도가 높아짐에 따라 피해 면적이 급속히 증가 하고 있다.

벼 줄무늬잎마름병에 저항성인 벼를 생산하는 방법에는 벼 유래의 저항성 유전자를 교배를 통해 감수성 품종 또는 계통에 도입하는 전통적 육종 방법과 바이러스 일부 유전자를 벼에 형질전환하고 식물체내에 과 발현시켜 바이러스 저항성을 부여하는 병원체 유래 저항성(pathogen derived resistance, PDR) 방법 등이 있다.

전통적 육종 방법으로 개발된 우리나라 최초의 벼 줄무늬잎마름병 저항성 품종은 '낙동벼'로(Chung 등, The Research Reports of the Office of Rural Development 17(C): 17-24, 1975), 염색체 11번에 위치하고 있는 Stvb-i 유전자가 저항성원으로 사용되었다(Hayano-Saito 등, Theor Appl Genet 96: 1044-1049, 1998). 지금까지 '낙동벼'를 교배 모본으로 사용하여 다수의 저항성 품종이 개발되었으나 사용된 저항성원이 Stvb-i 유전자로 한정되어 있어 새로운 바이러스 계통의 출현에 취약하다는 문제점이 있다.

병원체 유래 저항성(PDR)을 이용한 방법으로는 하야가와 등(Hayakawa 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 9865-9869, 1992)이 벼 줄무늬잎마름병 바이러스의 외피 단백질(coat protein, CP)을 벼에 도입하여 식물체내에 과 발현시킴으로써 바이러스에 저항성을 보이는 계통을 성공적으로 개발한 사례가 있다. 그러나 이 방법의 경우 벼에 도입된 CP 유전자와 다른 종류의 바이러스 CP 유전자 간에 재조합이 일어나 변형된 바이러스가 출현될 가능성과 바이러스 단백질이 식물체에 과 발현된다는 문제점이 제기되었다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 최근에는 dsRNA의 생성을 통한 '전사 후 유 전자발현억제(PTGS 또는 RNAi) 메커니즘'을 이용하는 방법이 바이러스 저항성 식물체 개발에 효과적으로 적용되고 있다(Zhang 등, Chinese Journal of Agricultural Biotechnology 2(3): 201-205, 2005, Lennefors 등, Transgenic Res 17: 219-228, 2008).

상기의 'dsRNA 매개 바이러스 저항성'은 dsRNA에 의해 유도된다. 식물체내에서 만들어진 dsRNA는 세포내 리보뉴클레아제 III(cellular RNase III, Dicer) 효소에 의해 21개 내지 24개의 뉴클레오티드을 가진 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로 절단된다(Deleris 등, Science 313:68-71, 2006). 이후, 한 가닥의 siRNA는 RNA 유도 발현억제 복합체(RNA Induced Silencing Complex, RISC)와 결합체를 형성하여 siRNA와 상보적인 RNA 염기를 절단함으로써 목표로 하는 유전자의 RNA 발현을 조절하게 된다(Voinnet 등 Nature Rev Genet 6: 206-220, 2005).

그러나 상기 'dsRNA 매개 바이러스 저항성 방법'을 이용한 벼 줄무늬잎마름병에 저항성을 가지는 형질전환체의 제조에 대한 연구는 찾아볼 수 없었다.

이에 본 발명자들은 벼 줄무늬잎마름병에 안정적인 저항성을 보이는 형질전환 벼에 대하여 연구, 노력한 결과, 바이러스 유전자의 염기서열 일부를 식물체에 형질전환하고 식물체내에 dsRNA의 생성을 유도함으로써 바이러스의 감염을 효과적 으로 차단할 수 있으며, 새로운 바이러스 계통의 출현에 대해서도 안정적인 저항성을 나타낼 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 벼 줄무늬잎마름병에 안정적인 저항성을 보이는 형질전환 벼 및 이의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명은 서열번호 1의 벼 줄무늬잎마름병(Rice stripe virus)의 외피 단백질 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 식물 형질전환용 벡터 pANDA-RSV-CP-SW를 제공하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 식물 형질전환용 벡터 또는 상기 아그로박테리움 투머파시엔스로 형질전환된 병원균 저항성 형질전환 식물체 또는 식물 종자를 제공하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은,

1) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 벼 줄무늬잎마름병의 외피 단백질 유전자를 분리하는 단계;

2) 상기 분리된 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 삽입된 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;

3) 상기 제조된 발현벡터를 이용하여 식물 형질전환용 아그로박테리움을 제 조하는 단계; 및

4) 상기 형질전환용 아그로박테리움을 이용하여 벼를 형질전환 하는 단계

를 포함하는 형질전환 벼의 제조방법을 또다른 특징으로 한다.

dsRNA 형성에 사용 가능한 바이러스 유전자는 RSV를 구성하는 4종의 외가닥 RNA 단편에 속한 모든 유전자가 포함되며, 이들 유전자의 전부 또는 일부분이 사용될 수 있으나, 본 발명에서는 수원지역에서 분리한 RSV의 CP 유전자, 즉 RSV-CP-SW를 벼 줄무늬잎마름병 저항성 식물체 및 식물 종자를 제조하는데 사용한다.

본 발명의 RSV-CP-SW 유전자는 수원지역에서 벼 줄무늬잎마름병에 감염된 벼에서 RNA를 추출하고 RT-PCR 방법으로 증폭하여 분리된다. 분리된 CP 유전자는 969 bp 길이의 염기서열(서열번호 1)을 가지며 이들 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열(서열번호 2)은 322개로 구성되어 있다. 또한, 벼 유전자와의 상동성 비교를 통해 상기의 바이러스 유전자와 벼 고유유전자간에 유사성이 있는 유전자나 DNA 단편이 없음을 확인하였으며, 상기의 상동성 비교 결과를 바탕으로 '전사 후 유전자발현억제 메커니즘' 유도 과정에서 생성되는 siRNA 의해 벼의 고유유전자가 비의도적으로 조절되는 문제점(off-target effect)을 사전에 차단할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 벼 식물체에 RSV-CP-SW 유전자의 염기서열을 센스와 안티센스 방향으로 동시에 발현시키기 위해 제작한 형질전환용 운반체, 즉 pANDA-RSV-RNAi는 바이너리 벡터(binary vector)인 pANDA 벡터(Daisuke Miki와 Ko Shimamoto, Plant Cell Physiol. 45(4): 490-495, 2004)에 RSV-CP-SW 유전자를 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 방법으로 삽입하여 제작하며, 본 발명의 형질전환용 운반체 제작에 사용된 RSV-CP-SW 유전자는 전부 또는 일부 DNA 염기서열이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 유전자의 발현에 사용하는 프로모터는 식물세포에서 기능하는 모든 종류의 것이 사용될 수 있으며, 과 발현을 위한 프로모터, 상시발현을 위한 프로모터, 스트레스 조건에서 발현되는 유도성 프로모터, 목적 유전자를 식물생육 기간 중 일정 시기에 발현되도록 하는 프로모터, 식물조직의 특이 부분에만 발현하게 하는 프로모터 및 목적유전자의 발현을 높이기 위해 '인핸서 서열(enhancer sequences)'이 결합된 하이브리 드(hybrid) 프로모터 등이 포함된다.

상기 과정을 통해 제조된 식물 형질전환용 벡터 pANDA-RSV-CP-SW는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 유전자 수탁 번호 KACC95098P로 2009년 2월 5일에 기탁되었다.

상기 식물 형질전환용 벡터를 이용하여 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 형질전환시키면 벼 줄무늬잎마름병에 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제조할 때 매개체로 사용될 수 있는 형질전환 미생물을 수득할 수 있다. 바이러스 유전자를 식물세포 내에 하나 또는 그 이상 도입하기 위해 사용되는 아그로박테리움은 병원성이 제거된(disarmed)된 Ti 또는 Ri 플라스미드를 가지고 있는 것으로 옥토핀형(octopine-type) 계통인 LBA4404나 숙신아모핀형(succinamopine-type) 계통인 EHA101 또는 EHA105 등 모든 아그로박테리움 계통이 본 발명에서 사용될 수 있다.

사용 가능한 형질전환용 식물의 보다 구체적인 예로는 벼, 보리, 밀, 호밀, 기장, 조, 옥수수, 귀리 및 수수 등의 식량작물을 비롯하여 피, 바랭이, 강아지풀, 잔디, 이탈리안 라이그라스, 겨풀, 쇄출, 둑새풀, 조개풀, 넓은 잎개수염, 알방동 사니, 방동사니대가리, 강피 및 좀바랭이 등의 화본과 식물을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 벼를 사용한다.

식물 형질전환 운반체가 도입된 아그로박테리움을 이용, 벼 체세포 캘러스와 공동 배양하여 벼 체세포에 목적 유전자를 도입한 후, 식물 호르몬을 조절하여 벼 체세포 캘러스로부터 목적 유전자를 센스와 안티센스 방향으로 동시에 발현시켜 dsRNA를 형성하는 형질전환 벼를 제조할 수 있다. 상기 목적유전자가 도입된 식물체를 효과적으로 선발하기 위한 선발인자로는 NPTⅡ(neomycin phosphotransferase), HPT(hygromycin phosphotransferase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase) 및 젠타마이신(gentamicin) 등의 항생제 내성 유전자; bar 유전자 등의 제초제 저항성 유전자; 및 GUS, GFP(green fluorescent protein) 및 LUX(luciferase) 등의 표지유전자가 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 dsRNA를 생성하는 형질전환 식물체는 벼 줄무늬잎마름병의 감염과 증식을 효과적으로 차단함으로써 바이러스에 대해 저항성을 부여한다.

또한, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 형질전환 식물체는 사용된 RSV-CP-SW 유전자가 기존에 보고된(NCBI에 수록된 데이터베이스 자료) 86개의 RSV-CP 유전자와 염기서열은 95 ~ 100%, 아미노산서열에서는 96 ~ 100%의 높은 상동성을 보여 저항성 기작 과정에서 생성되는 siRNA가 바이러스 계통 간에 존재하는 상기 염기서열 변이를 충분히 포함하여 기존의 모든 바이러스 계통과 새로운 바이러스 계통의 출현에 대해 안정적인 저항성을 나타낼 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 벼 줄무늬잎마름병 RSV-CP-SW 유전자 분리 및 염기, 아미노산 서열 분석

본 발명에 사용된 RSV-CP-SW 유전자의 분리를 위해 벼 줄무늬잎마름병에 감염된 일품벼 잎으로부터 트리졸(Trizol regent, invitrogen, Cat. NO. 15596-018)를 이용하는 방법으로 RNA를 추출하였다. 상기 방법으로 추출한 각각의 RNA로부터 cDNA 합성 키트(stratagen, Cat. NO. 600084)을 이용하여 cDNA를 각각 합성하였다. 합성한 cDNA를 정방향 프라이머 5'-CTA GTC ATC TGC ACC TTC TGC CTC ATC-3'(서열번호 3)와 역방향 프라이머인 5'-AAT GGG TAC CAA CAA GCC AGC CAC TCT-3'(서열번호 4)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 MJ 리서치(MJ research)사의 PTC-200기기로 수행하였다. PCR 반응 조건으로는 94℃ 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 60℃에서 30초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 35회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램 하였다. 증폭된 산물을 EtBr이 첨가된 0.8% 아가로오스 겔에서 분리되고, UV트랜스 일루미네이터에서 확인하였다. 증폭된 PCR산물은 클로닝 벡터인 T 이지 벡터(T-easy vector)에 클로닝을 하여, cDNA의 염기서열을 분석하였다.

그 결과 본 발명의 RSV-CP-SW 유전자의 cDNA는 전체 969 bp의 염기서열(서열번호 1)로 구성되어 있으며, 322개의 아미노산(서열번호 2)으로 연역된다. 또 한 상기 염기서열 및 연역 아미노산 서열을 미국 생물정보센터(NCBI)의 Blast 검색 프로그램을 사용하여 데이터베이스 검색을 실시한 결과, 보고된(NCBI에 수록된 데이터베이스 자료) 86개의 RSV-CP 유전자와는 염기서열에서 95 ~ 100%, 아미노산서열에서는 96 ~ 100%의 높은 상동성을 보였다.

실시예 2 : 형질전환용 운반체 제작 및 아그로박테리움에의 도입

본 발명을 위해 사용된 RSV-CP-SW 유전자는 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pANDA 벡터(Daisuke Miki와 Ko Shimamoto, Plant Cell Physiol. 45(4): 490-495, 2004)에 도입하였으며, 유전자의 도입이 확인된 형질전환용 운반체는 pANDA-RSV-CP-SW로 명명하였다.

RNAi 간섭현상 유도를 위해 옥수수 유래의 상시발현 유비퀴틴 프로모터를 사용하여 RSV-CP-SW 유전자 염기서열을 센스와 안티센스 방향으로 식물체내에서 강하게 발현시켜 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 형성하게 하였다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 bar(Bialaphos resistance) 유전자를 이용하였다. 상기 재조합된 플라스미드 pANDA-RSV-CP-SW의 주요 유전자 배열은 도 3에 나타내었다. 도 2의 A에서 각 부호의 약어는 다음과 같다: NPT II(neomycin phosphotransferase), Ubq pro(Ubiquitin promoter), Nos(Nos terminator), bar(bar coding region), HPT(hygromycin phosphotransferase).

제작된 형질전환용 바이너리 벡터 DNA 즉, pANDA-RSV-CP-SW는 3계 교잡법(tri-parental mating)에 의해 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였으며, 재 조합된 플라스미드가 포함된 아그로박테리움의 선발을 위해서 2종의 항생제인 가나마이신(kanamycin)과 테트라사이클린(tetracycline)을 사용하였다. 아그로박테리움 내로의 형질전환 여부는 콜로니 PCR 방법으로 확인하였다.

PCR 반응은 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25 pM을 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 25μl로 맞춘 PCR 반응액에 각각의 운반체가 형질전환된 콜로니의 일부를 팁으로 찍어 첨가하였다. PCR 반응은 MJ 리서치(MJ Research)사의 PTC-200 기기로 수행하였으며, 조건으로는 94℃에서 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 55℃에서 30 초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 30회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다. 증폭된 산물은 EtBr이 첨가된 0.8% 아가로오스 겔 (agarose gel)에서 분리되고, UV 트랜스일루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.

도 4는 본 발명에 사용된 형질전환용 운반체 pANDA-RSV-CP-SW를 3계 교잡방법으로 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 사용된 형질전환용 운반체 pANDA-RSV-CP-SW가 의도된 방향으로 형질전환 되었는지를 확인하기 위하여 2종의 정방향 프라이머 (GUS-97-5', GUS-732-3')와 1 종의 역방향 프라이머(attB2P)를 이용하였다. 센스 방향 확인을 위하여 정방향 프라이머 5'-CAT GAA GAT GCG GAC TTA CG-3' (GUS-97-5', 서열번호 5)와, 역방향 프라이머로 5'-ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG T-3' (attB2P, 서열번호 6)를 사 용하여 기대크기 1,872 bp를 확인하였고, 안티센스 방향 확인을 위하여 정방향 프라이머는 5'-ATC CAC GCC GTA CAA GAA AGC TGG GT-3' (GUS-732-3'. 서열번호 7)와 역방향 프라이머로 5'-ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG T-3' (attB2P, 서열번호 6)을 사용하여 기대크기 1,701 bp를 확인하였다.

선발된 2개의 콜로니는 사용한 프라이머의 기대 크기에서 밴드를 나타내어 RSV-CP-SW 유전자가 아그로박테리움에 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다. 위의 방법으로 형질전환이 확인된 아그로박테리움 콜로니는 증식시킨 후 형질전환에 이용하였다.

실시예 3 : dsRNAi 기작을 유도하는 형질전환 벼의 제조

3-1. 캘러스 유도 및 선발

공시품종은 일품벼와 대산벼를 사용하였다. 먼저, 종자 껍질을 제거한 현미를 70% 에탄올에 5분간 세척한 다음 50% 락스 용액으로 상온에서 15분씩 2회 정도 소독한 후 멸균수로 10회 이상 세척하여 멸균하였다. 멸균된 종자는 2,4-D 2mg/L가 포함된 2N6배지에 약 15-20개(90ㅧ 20㎝ petri dish)를 배 부분이 위로 향하게 치상한 다음 27℃ 암실에서 3 ~ 4주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 유도된 캘러스 중에서 1 ~ 2㎜의 일정한 둥근 모양의 갈변화가 안된 양호한 상태의 캘러스를 선발하여 2N6 배지에서 3일간 증식시킨 다음 형질전환에 사용하였다.

3-2. 아그로박테리움의 배양 및 현탁액 준비

초저온냉장고(-70℃)에서 글리세롤 스탁으로 저장되어 있는 재조합 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리움을 꺼내 AB-KT배지에 조밀하게 스트리킹하여 28℃ 암조건에서 4 ~ 5일간을 배양하였다. 배양이 끝난 아그로박테리움을 페트리 접시(petri dish) 당 15 ~ 20㎖ AAM 배지를 분주한 후 멸균된 루프를 이용하여 긁어내고 팰콘 튜브(falcon tube)로 옮겨 담았다. 그 다음 아그로박테리움이 잘 현탁될 수 있도록 수초 동안 볼텍싱(vortaxing)하였으며, 최종 접종 농도는 OD650㎚에서 2.0 ~ 2.5가 되도록 하였다.

3-3. 아그로박테리움 접종 및 공동배양

증식된 캘러스를 빈 페트리 접시에 옮긴 후 15 ~ 20ml의 아그로박테리움 현탁액을 부어 약 20 ~ 30분간 접종하였다. 접종 후에 멸균된 여과지가 들어있는 페트리 접시에 캘러스를 옮겨 남아 있는 아그로박테리움 현탁액을 제거한 다음 공동배양배지에서 7일 동안 치상하였다.

3-4. 형질전환된 캘러스의 선발

공동배양 과정이 끝난 캘러스는 아그로박테리움을 제거하기 위해 세포탁심(cefotaxim) 250mg/L이 포함된 용액으로 약 10회 이상 세척하였으며, 세척이 끝난 캘러스는 멸균된 여과지가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 담아 남아 있는 용액을 완전히 제거하였다. 이 과정을 마친 캘러스는 L-포스피노트리신(L-phosphinotricine, PPT) 6mg/L가 포함된 2N6-CP 배지에 옮겨 27℃ 암조건에서 3주 동안 형질전환된 캘러스를 1차로 선발하였으며 선발된 캘러스는 동일 배지에 동일 조건으로 2주 동안 배양하는 과정으로 2차 선발하였다.

3-5. 형질전환된 캘러스로부터 재분화 식물체 유도

선발된 캘러스는 PPT 3mg/L, 세포탁심 250mg/L, NAA(Naphthalene Acetic Acid) 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L 및 말토오스 20g/L이 포함된 MSR-CP 배지에 치상한 다음 25℃ 명조건에서 배양하여 형질전환식물체를 유도하였다.

3-6. 뿌리 유도 및 순화

재분화식물체는 생장호르몬이 포함되지 않은 MS0 배지에 옮겨 뿌리를 유도하였다. 뿌리가 유도된 식물체는 1000배 하이포닉스 수용액에 약 7 ~ 10일간 침지하여 순화시켰으며 순화된 식물체는 화분에 이식하고 온실에서 관리하였다.

하기 표 1에는 상기 형질전환의 단계별 사용되는 배지 종류 및 조성을 나타내었다.

형질전환 단계	배 지	조 성
캘러스 유도 및 증식	2N6	N6 매크로(macro), 미세 염(micro salt), N6 비타민. 카사미노산(casamino acid) 300mg/L, 프롤린 500mg/L, 수크로오스 30g/L, 글루타민 500mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
아그로박테리움 배양	AB-KT	AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 가나마이신(kanamycin) 50mg/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10mg/L, pH 7.0
아그로박테리움 현탁 및 접종	AAM	AA 매크로, 미세 염, 아미노산 스탁(stock), MS 비타민, 철 스탁(stock), 카사미노산 500mg/L, 수크로오스 68.5g/L, 글루코오스 36g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 100uM/L, pH 5.8
공동배양	1/2-2N6- AS-New	1/2-2N6 배지, 아세토시린곤 100uM/L, 글루코오스 10g/L, 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM, 질산은 5mg/L, 젤라이트 3.0g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.2
형질전환 캘러스 선발	2N6-CP	2N6 배지, 세포탁심(cefotaxime) 250mg/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 6mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
재분화	MSR-CP	MS 매크로, 미세 염, MS 비타민, 세포탁심 250mg/L, NAA 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L, 말토오스 20g/L, L-포스피노트리신 3mg/L, 젤라이트 4g/L, pH 5.8
뿌리 유도	MS0	MS 매크로 및 미세 염, MS 비타민, 수크로오스 30g/L, 젤라이트 2.5g/L, pH 5.8

실시예 4 : dsRNAi 기작 유도용 형질전환 벼의 분자생물학적 분석

형질전환 벼 T1세대 식물체를 대상으로 세대진전에 따른 RSV-CP-SW 유전자의 유전여부를 확인하기위해 서든블랏 분석(Southern blot analysis)을 수행하였다. 서든블랏은 bar 유전자를 탐침(probe)으로 하여 DIG DNA Labeling 키트(Roche, Cat. NO. 11 585 614 910)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다. 먼저, 형질전환 식물체로부터 CTAB 방법(Rogers & Benich, 1994)으로 게놈 DNA를 추출하고 10 ㎍의 DNA를 정량한 다음 제한효소 BamHI으로 절단하였다. 절단된 DNA를 0.8% 아가로스겔에서 전기영동하고, 나이론 막에 블롯팅하였다. 블롯팅된 막을 UV 크로스-링킹(cross-linking)한 후, 예비 혼성화(pre-hybridization)를 42℃에서 30분간 수행하고, 탐침을 포함하는 혼성화 완충용액(hybridization buffer)으로 42℃에서 16시간 동안 혼성화를 실시하고 탐지(detection)하는 방법으로 수행하였다. 도 5는 그 결과를 나타낸 것으로 형질전환 식물체는 모두 두 개 이상의 유전자가 벼 게놈에 삽입되어 성공적으로 다음 세대에 유전되고 있음을 확인하였다.

형질전환 벼 식물체 내에서 dsRNAi 기작이 효율적으로 작용하는가를 알아보기 위해 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 다음과 같이 확인하였다. 형질전환 식물체에서 형성된 dsRNA가 21 ~ 24개의 뉴클레오티드 siRNA로 절단되었는지를 알아보기 위하여 벼 줄무늬잎마름병 보독 애멸구를 인위적으로 접종하고, 3 ~ 4주 후에 작은 RNA(small RNA) 추출용 시료를 채취하였다. 작은 RNA의 분리는 mirVana^TM miRNA Isolation Kit(Ambion, Cat. NO. 1560)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다. 먼저 막자사발과 막자를 미리 얼린 후 50 ~100 mg의 시료를 준비하여 액체질소로 곱게 갈아 라이시스/바인딩 버퍼(Lysis/Binding buffer)를 넣고 재빨리 섞은 후 라이시스 버퍼의 1/10 부피 의 호모제네이트 첨가제(Homogenate Additive)를 넣고 잘 섞은 후 얼음위에서 10분간 반응시켰다. 핵산의 추출을 위하여 라이시스 버퍼와 같은 부피의 페놀과 클로로포름을 각각 넣고 섞은 후 실온에서 5분간 원심 분리하여 상층을 분리하였다. 마지막으로 작은 RNA 추출을 위하여 분리한 상층액 부피의 1/3에 해당되는 에탄올을 첨가하여 필터에 통과시켜 통과된 용액을 받아 모아 부피를 확인하였다. 확인된 부피의 2/3에 해당되는 양의 에탄올을 첨가한 후 2회에 걸쳐 필터에 통과시키고, 통과시킨 필터를 워싱(washing) 용액 1, 2/3 번을 이용하여 수세한 후 95℃에서 미리 가열시킨 용리액(elution)으로 녹여내고 260 nm에서의 흡광도를 측정한 후 사용하였다. 작은 sRNA의 분석을 위하여 15ml의 17% 폴리아크릴아마이드 겔을 준비하고 5 ~ 15 ㎍의 샘플 RNA를 95℃에서 4분간 변성시킨 후 포름아마이드가 첨가된 5ㅧ 로딩 다이(loading dye)와 혼합하여 겔에 전기 영동하였다. 180V에서 약 30 ~ 40분가량 전기 영동한 다음 EtBr 용액에 5분간 담근 후 UV-조사를 통해 확인하였다. 작은 RNA 생성여부를 확인하기위해 노든블랏 분석(northern blot analysis)을 수행하였다. 노든블랏은 RSV-CP-SW 유전자를 탐침(probe)으로 하여 DIG DNA Labeling 키트(Roche, Cat. NO. 11 585 614 910)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다. 먼저, 17% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 RNA를 반건조 이동 유닛(semi-dry transfer unit, TE70X, Hoefer)기를 이용하여 65mA에서 1시간 동안 나이론 막에 블롯팅하였다. 블롯팅된 막을 UV 크로스-링킹(cross-linking)한 후, 예비 혼성화(pre-hybridization)를 37℃에서 30분간 수행하고, 탐침을 포함하는 혼성화 완충용액(hybridization buffer)으로 37℃에서 16시간 동안 혼성화를 실시하고 탐지(detection)하는 방법으로 수행하였다. 도 6은 그 결과를 나타낸 것으로 서든블랏에서 형질전환이 확인된 식물체는 모두 두 개의 siRNA 밴드를 나타내어 dsRNAi 기작이 효율적으로 작동되고 있음을 확인하였다.

실시예 5 : dsRNAi 기작 유도용 형질전환 벼 식물체의 벼 줄무늬잎마름병 저항성 확인

형질전환 벼 식물체를 대상으로 줄무늬잎마름병에 대한 저항성을 평가하였다. 저항성 평가는 2회에 걸쳐 수행하였으며 1차 평가에는 형질전환 일품벼를, 2차 평가는 1차 평가에서 저항성으로 확인된 형질전환 일품벼 계통과 새로 작성된 대산벼를 대상으로 수행하였다. 저항성 평가 방법은 벼 줄무늬잎마름병 보독 애멸구를 식물체 당 5마리의 밀도로 2일간 인위적으로 접종하고, 3 ~ 4주 후에 대조군 벼인 감수성 품종이 완전히 이병되었을 때에 판독하는 방법으로 수행하였다. 접종된 식물체내 바이러스의 증식밀도는 ELISA(emzyme linked immunosorbent assay) 검정을 통해 확인하였으며 그 방법은 다음과 같다. RSV ELISA 진단 키트는 일본 식물방역에서 제작한 것을 사용하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 RSV 정제된 항체(IgG) 200㎕를 코팅한 후 37℃에서 4시간 정치하고 포스페이트 버퍼(Phosphate buffer)로 4회 세척한 다음, 추출 용액(extraction buffer)으로 식물체 잎을 갈아 준비한 조즙액 200㎕를 플레이트에 분주하고, 37℃에서 4시간(또는 4℃에서 8시간 이상) 반응시켰다. 다시 포스페이트 버퍼로 4회 세척하고 효소결합항체 200㎕를 첨가하여 37℃에서 4시간 반응하게 한 다음, 포스페이트 버퍼로 4회 세척한 후 기질을 첨가하여 10 ~ 30분 후부터 발색을 관찰하였다. 노란색의 발색반응을 확인하고 적절한 시간에 각각의 웰에 3M NaOH를 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, BIO-RAD)를 이용하여 405nm에서 발색정도를 측정하는 방법으로 ELISA 검정을 수행하였다. 도 7과 8은 형질전환 벼 식물체를 대상으로 벼 줄무늬잎마름병 생물검정을 수행하고 저항성 정도를 나타낸 것이다. 먼저 도 7은 1차 생물검정의 결과를 보여 주는 것으로 dsRNAi 기작을 유도하는 대부분의 형질전환 일품벼 계통(RNAi)은 대조군 벼(Wild Type)와 벡터만 형질전환된 벼(EV)에 비해 벼 줄무늬잎마름병에 매우 낮은 이병률을 보였으며 바이러스의 증식밀도를 나타내는 ELISA 측정값에서도 현저히 낮은 수치를 보여 dsRNAi 기작에 의해 침입한 바이러스가 효과적으로 억제되고 있음을 알 수 있었다. 반면 RSV-CP-SW 유전자를 안티센스 방향으로 발현시킨 형질전환 계통(AS)은 대부분의 계통에서 높은 이병률을 보여 저항성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 도 8은 형질전환 벼와 대조군 벼 식물체를 대상으로 벼 줄무늬잎마름병을 접종한 다음 식물체의 생육양상을 비교한 것으로 dsRNAi 기작 유도용 형질전환 벼 식물체는 벼 줄무늬잎마름병 증상이 거의 나타나지 않아 심한 증상을 보이는 대조군 벼 식물체에 비해 양호한 생육을 나타내었다.

하기 표 2는 1차 평가에서 저항성으로 확인된 일품벼 계통과 추가로 작성된 형질전환 대산벼를 대상으로 줄무늬잎마름병에 대한 2차 평가를 수행하고 그 결과를 나타낸 것이다. 하기 표 2에서 RSV/pANDA는 dsRNA을 생성하는 형질전환 운반체가 도입된 벼 식물체를, 도 5의 RSV-AS/GB 는 RSV-CP-SW 유전자를 안티센스 방향으로만 발현되게 만들어진 운반체가 도입된 벼 식물체를 나타낸다. 1차 평가에서 저항성을 보였던 일품벼 계통과 이병성 반응을 나타낸 안티센스 형질전환 계통(AS)은 2차에서도 동일한 결과로 평가되어 본 발명에서의 줄무늬잎마름병 생물검정이 매우 정확하고 재현성이 높음을 확인하였다. 추가로 작성된 대산벼의 경우 9계통 중에서 5계통이 저항성을 보여 dsRNAi 방법이 품종에 상관없이 저항성 식물체 개발에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

벡터명	품종명	계통번호 (T1)	2차검정 결과
RSV-CP-SW/pANDA	일품벼	1-2	R
RSV-CP-SW/pANDA	일품벼	2-2	R
RSV-CP-SW/pANDA	일품벼	2-3	R
RSV-CP-SW/pANDA	일품벼	2-4	R
RSV-CP-SW/pANDA	일품벼	4-1	R
RSV-CP-SW/pANDA	일품벼	9-1	R
RSV-CP-SW/pANDA	일품벼	9-2	R
RSV-CP-SW/AS/GB	일품벼	3-1	S
RSV-CP-SW/AS/GB	일품벼	7-2	S
RSV-CP-SW/AS/GB	일품벼	7-3	S
RSV-CP-SW/AS/GB	일품벼	11-1	S
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	1-2	S
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	3-1	S
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	4-1	R
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	5-2	R
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	9-2	S
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	10-2	S
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	12-2	R
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	13-1	R
RSV-CP-SW/pANDA	대산벼	14-2	R
Wild type	일품벼		S
E-V	일품벼		S

도 9는 dsRNAi 기작 유도용 형질전환 벼 식물체와 형질전환에 사용된 원품종 식물체가 포장재배 조건에서 생육 및 농업적 여러 가지 형질에서 동등함을 보여주고 있는 사진이다. 이러한 동질성은 '전사 후 유전자발현억제 메커니즘' 유도 과정에서 생성된 siRNA 의해 벼의 고유유전자가 비의도적으로 조절되는 문제점(off-target effect)이 나타나지 아니하였음을 의미한다.

도 1은 본 발명에 사용된 수원지역에서 분리한 벼 줄무늬잎마름병 외피 단백질을 코딩하는 유전자 RSV-CP-SW의 cDNA 염기서열을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 사용된 RSV-CP-SW 유전자의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 사용된 RSV-CP-SW가 센스 및 안티센스 방향으로 도입된 식물 형질전환용 운반체의 지도이다.

도 4는 형질전환 운반체를 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행하여 그 결과를 보여주는 사진이다. 이때, RSV-s-1과 RSV-s-2는 콜로니 1과 2의 센스 방향으로 삽입된 RSV-CP-SW를, RSV-anti-1과 RSV-anti-2는 콜로니 1과 2의 안티센스 방향으로 삽입된 RSV-CP-SW를 확인한 결과를 나타낸다.

도 5는 서든블랏(Southern blot)을 통해 형질전환 된 일품벼(T1세대)의 선발마커로 사용된 bar 유전자 도입 수를 확인한 사진이다.

도 6은 bar 유전자 도입이 확인된 형질전환 일품벼 식물체로부터 RNAi 기작의 최종산물인 siRNA의 생성을 확인한 사진이다.

도 7은 형질전환 된 일품벼(T1 세대)를 대상으로 벼 줄무늬잎마름병에 대한 저항성을 평가하고 그 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 그래프에서, Wild type는 형질전환 운반체가 도입되지 않은 벼 식물체를, EV는 RSV-CP-SW 유전자가 포함 되지 않은 형질전환 운반체만 도입된 벼 식물체를, AS는 RSV-CP-SW 유전자를 안티센스 방향으로만 발현되게 만들어진 운반체가 도입된 벼 식물체를, RNAi는 RSV-CP-SW 유전자를 센스 방향 및 안티센스 방향으로 발현되게 하여 dsRNA를 형성하게 하는 운반체가 도입된 벼 식물체를 각각 나타낸다.

도 8은 형질전환 벼 식물체와 대조군 벼에 벼 줄무늬잎마름병을 접종하고 한 달 후에 생육정도를 비교한 사진이다.

도 9은 형질전환 벼와 형질전환에 사용된 원품종이 농업적 형질에서 동등함을 보여주는 사진이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Rice stripe virus resistant rice tranformats and method for producing thereof <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 969 <212> DNA <213> Rice stripe virus <400> 1 atgggtacca acaagccagc cactctagct gatttgcaga aggcaatcaa tgacatctcc 60 aaagatgcgt tgtcttacct gactgctcat aaagctgatg ttgtgacctt tgctggtcag 120 atagagtatg caggctatga tgctgcaact ctgattggca tattgaagga caaaggtggt 180 gacacactgg ccaaggatat gactatgtgc atcaccatga gatatgtgag aggcactggc 240 tttgtgagag atgtcactaa gaaagtgaaa gtggcggctg gaagcacaga ggcatcgacc 300 ttggtgtcga ggtatgggat agtgtcctcg gtggggacaa atgccaatgc tatcacactt 360 ggaaggctgg ctcagctatt cccaaatgtc tcacatgaag ttgtgagaca aatttctggt 420 gttaagatgg ctgtggactc ctctgacctg ggactaacag gatgtgacaa cttactgtgg 480 gactatgttc cacaatatat taaactggag agtgaaacag ctccttattg cacaactcac 540 tccctaagtc acattttgtt tgttgtgcac atcattcact ccttccaaat aaccaaaaag 600 accatgccag agggtaagaa gaaggagcgt ggtctgacaa aagacataga catgatgaag 660 tacacaactg gtctcctggt catcacatgc aagtcaaaga acctggctga caagaagaag 720 gaagatggca gaaagaaggt cttagatgaa ttcatcacca atgggaaagt gaagaccaca 780 atcttcgatg cgctggctgg tatgtctgtc aatacgatca gcacttatgg gaatcagaca 840 aggctgtact tggctcaaca gagcaaactg atgaagatcc ttgctgagaa cacttcaaag 900 acagcatctg aagtcagcgg gttggtgaag gagttcttcg aggatgaggc agaaggtgca 960 gatgactag 969 <210> 2 <211> 322 <212> PRT <213> Rice stripe virus <400> 2 Met Gly Thr Asn Lys Pro Ala Thr Leu Ala Asp Leu Gln Lys Ala Ile 1 5 10 15 Asn Asp Ile Ser Lys Asp Ala Leu Ser Tyr Leu Thr Ala His Lys Ala 20 25 30 Asp Val Val Thr Phe Ala Gly Gln Ile Glu Tyr Ala Gly Tyr Asp Ala 35 40 45 Ala Thr Leu Ile Gly Ile Leu Lys Asp Lys Gly Gly Asp Thr Leu Ala 50 55 60 Lys Asp Met Thr Met Cys Ile Thr Met Arg Tyr Val Arg Gly Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Arg Asp Val Thr Lys Lys Val Lys Val Ala Ala Gly Ser Thr 85 90 95 Glu Ala Ser Thr Leu Val Ser Arg Tyr Gly Ile Val Ser Ser Val Gly 100 105 110 Thr Asn Ala Asn Ala Ile Thr Leu Gly Arg Leu Ala Gln Leu Phe Pro 115 120 125 Asn Val Ser His Glu Val Val Arg Gln Ile Ser Gly Val Lys Met Ala 130 135 140 Val Asp Ser Ser Asp Leu Gly Leu Thr Gly Cys Asp Asn Leu Leu Trp 145 150 155 160 Asp Tyr Val Pro Gln Tyr Ile Lys Leu Glu Ser Glu Thr Ala Pro Tyr 165 170 175 Cys Thr Thr His Ser Leu Ser His Ile Leu Phe Val Val His Ile Ile 180 185 190 His Ser Phe Gln Ile Thr Lys Lys Thr Met Pro Glu Gly Lys Lys Lys 195 200 205 Glu Arg Gly Leu Thr Lys Asp Ile Asp Met Met Lys Tyr Thr Thr Gly 210 215 220 Leu Leu Val Ile Thr Cys Lys Ser Lys Asn Leu Ala Asp Lys Lys Lys 225 230 235 240 Glu Asp Gly Arg Lys Lys Val Leu Asp Glu Phe Ile Thr Asn Gly Lys 245 250 255 Val Lys Thr Thr Ile Phe Asp Ala Leu Ala Gly Met Ser Val Asn Thr 260 265 270 Ile Ser Thr Tyr Gly Asn Gln Thr Arg Leu Tyr Leu Ala Gln Gln Ser 275 280 285 Lys Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu Asn Thr Ser Lys Thr Ala Ser Glu 290 295 300 Val Ser Gly Leu Val Lys Glu Phe Phe Glu Asp Glu Ala Glu Gly Ala 305 310 315 320 Asp Asp <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ctagtcatct gcaccttctg cctcatc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 aatgggtacc aacaagccag ccactct 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS-97-5(forward primer) <400> 5 catgaagatg cggacttacg 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2P(reverse primer) <400> 6 accactttgt acaagaaagc tgggt 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS-732-3(forward primer) <400> 7 atccacgccg tacaagaaag ctgggt 26

Claims

서열번호 1의 벼 줄무늬잎마름병(Rice stripe virus)의 외피 단백질 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 식물 형질전환용 벡터 pANDA-RSV-CP-SW.
제 1 항의 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens).
제 1 항의 식물 형질전환용 벡터 또는 제 2 항의 아그로박테리움 투머파시엔스로 형질전환된 병원균 저항성 형질전환 식물체.
제 3 항에 있어서, 상기의 식물체가 벼임을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제 3 항에 있어서, 벼 줄무늬잎마름병에 대해 저항성을 나타내는 형질전환 식물체.
제 1 항의 식물 형질전환용 벡터 또는 제 2 항의 아그로박테리움 투머파시엔스로 형질전환된 병원균 저항성 형질전환 식물 종자.
제 6 항에 있어서, 벼 줄무늬잎마름병에 대해 저항성을 나타내는 형질전환 식물 종자.
1) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 벼 줄무늬잎마름병의 외피 단백질 유전자를 분리하는 단계;

2) 상기 분리된 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 삽입된 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;

3) 상기 제조된 발현벡터를 이용하여 식물 형질전환용 아그로박테리움을 제조하는 단계; 및

4) 상기 형질전환용 아그로박테리움을 이용하여 벼를 형질전환 하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 벼의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 형질전환 벼는 벼 줄무늬잎마름병에 대해 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는 제조방법.