KR101211539B1 - 아밀로스 함량이 조절된 형질전환 벼 및 이의 제조방법 - Google Patents

아밀로스 함량이 조절된 형질전환 벼 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아밀로스 함량을 조절된 형질전환 벼 및 이의 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 GBSSI(granule-bounded starch synthase I) 유전자의 3'-UTR 영역을 포함하는 일부 서열을 센스와 안티센스 방향으로 동시에 벼 식물체내에 발현시켜 이들 센스와 안티센스 RNA 단편이 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 형성하게 함으로써, GBSSI 유전자의 발현을 억제되어 아밀로스의 함량이 조절된 형질전환 벼 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

아밀로스 함량이 조절된 형질전환 벼 및 이의 제조방법{Amylose-Regulated Rice Transformants and Producing Method Thereof}
본 발명은 아밀로스 함량이 조절된 형질전환 벼 및 이의 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 GBSSI(granule-bounded starch synthase I) 유전자의 3'-UTR 영역이 포함된 일부 서열을 센스와 안티센스 방향으로 동시에 벼 식물체내에 발현시켜 이들 센스와 안티센스 RNA 단편이 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 형성하게 함으로써, GBSSI 유전자의 발현을 억제하여 아밀로스의 함량이 조절된 형질전환 벼 및 그 제조방법에 관한 것이다.
최근 생활수준의 향상과 더불어 식생활 패턴이 고급화, 다양화되어 쌀 소비가 점차 감소하고 있는 추세이므로, 이를 해결할 수 있는 새로운 소비확대 방안이 요구되고 있으며, 쌀의 이용성을 높이기 위해서는 전분구조, 형태, 이화학적 특성이 다양한 품종을 개발하는 것이 중요하다.
특히, 아밀로스 함량이 찹쌀과 멥쌀의 중간 정도인 중간찰 품종은 현미밥용이나, 떡, 과자, 식혜, 술 등 다양한 식품소재로 활용될 수 있어 그 이용성이 증가하고 있다.
찰벼(wx)는 GBSSI (granule-bounded starch synthase I) 단백질이 전혀 발현되지 않거나 크게 감소되었을 때 나타나는 현상으로, 기존에 보고된 대부분의 찰벼는 GBSSI 유전자의 2번째 엑손 영역에서 21bp의 중복에 의해 유전자의 활성이 없어지는 것으로 알려져 있다.
찰벼 돌연변이체를 활용하여 전통육종 방법으로 우수한 품종을 개발하는데는 육종기간이 길고 소요비용이 많이 든다는 단점이 있으며, 상기 문제를 해결할 수 있는 방안으로 생명공학기법을 이용하여 아밀로스 함량이 적절하게 조절된 벼의 개발에 대한 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 형질전환을 통한 벼의 아밀로스 함량을 조절하고자 GBSSI 유전자의 3'-UTR 영역이 포함된 특정 서열을 센스와 안티센스 방향으로 동시에 벼 식물체내에 발현시키면 이들 센스와 안티센스 RNA 단편이 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 형성하여 아밀로스 함량이 다양하게 조절될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 아밀로스 함량이 다양하게 조절된 형질전환 벼 및 이의 제조방법을 제공하는 것에 그 목적이 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 식물 형질전환용 벡터 pRNAi-GBSSI(KACC 95106P)를 제공하는 것을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 식물 형질전환용 벡터로 형질전환되어 아밀로스 함량이 조절된 형질전환 식물체 또는 식물 종자를 제공하는 것을 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은,
1) GBSSI 유전자에서 서열번호 1의 염기서열을 분리하는 단계;
2) 상기 분리된 서열번호 1의 염기서열이 센스 및 안티센스 방향으로 삽입된 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 제조된 발현벡터를 이용하여 식물 형질전환용 아그로박테리움을 제조하는 단계; 및
4) 상기 형질전환용 아그로박테리움을 이용하여 벼를 형질전환 하는 단계
를 포함하는 형질전환 벼의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
아밀로스 합성 관련 유전자인 GBSSI의 3'-UTR 부위를 타겟팅하여 센스 방향과 안티센스 방향으로 동시에 발현시켜 dsRNA를 생성하는 형질전환 식물체는 GBSSI 유전자의 발현이 억제되어 아밀로스 함량을 조절할 수 있다. 따라서 아밀로스 함량이 다양하게 조절된 벼 개발을 통해 현미밥용 등 다양한 식품소재로 활용되어 쌀 이용성 증대에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 사용된 서열번호 1의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 사용된 서열번호 1의 염기서열이 센스 및 안티센스 방향으로 도입된 식물 형질전환용 운반체의 지도이다.
도 3은 본 발명에서 사용된 서열번호 1의 염기서열의 위치를 도식화한 찰벼 GBSSI의 유전자 지도이다.
도 4는 원품종 및 형질전환된 계통의 현미를 절단하여 전자현미경으로 관찰한 SEM 사진이다. 상기 사진에서 A는 일미벼 원품종, B는 pRNAi-GBSSI 형질전환 일미벼, C는 흑남벼 원품종, D는 pRNAi-GBSSI 형질전환 흑남벼를 나타낸다.
도 5은 형질전환된 벼의 아밀로스 함량을 비교한 그래프이다. 상기 그래프에서, 1은 일미벼 원품종, 2 ~ 4 는 pRNAi-GBSSI 형질전환 일미벼 계통, 5는 흑남벼 원품종, 6 ~ 15는 pRNAi-GBSSI 형질전환 흑남벼 계통, 16은 벡터대조 형질전환체, 17은 찰벼 품종을 나타낸다.
도 6은 형질전환된 벼의 아밀로펙틴 분포 양상을 비교한 그래프이다.
도 7은 형질전환된 벼의 요오드 반응에 따른 결과를 확인한 사진이다. 상기 사진에서 A는 일미벼 원품종, B는 pRNAi-GBSSI 형질전환 일미벼, C는 흑남벼 원품종, D는 pRNAi-GBSSI 형질전환 흑남벼를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 식물 형질전환용 벡터 pRNAi-GBSSI를 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 GBSSI 유전자(GenBank accession number : X62134)의 14번째 엑손 및 3'-UTR 부위, 즉 2175 ~ 2391 번째까지의 염기서열로서 총 216 bp 길이를 가진다.
본 발명의 실시예에서는 상기 서열번호 1의 염기서열을 센스와 안티센스 방향으로 동시에 발현시키기 위해 제작한 형질전환용 운반체, 즉 pRNAi-GBSSI 는 바이너리 벡터(binary vector)인 pANDA 벡터(Daisuke Miki와 Ko Shimamoto, Plant Cell Physiol. 45(4): 490-495, 2004)에 서열번호 1의 염기서열을 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 방법으로 삽입하여 제작하였다. 본 발명에서 상기 염기서열의 발현에 사용하는 프로모터는 식물세포에서 기능하는 모든 종류의 것이 사용될 수 있으며, 과 발현을 위한 프로모터, 상시발현을 위한 프로모터, 스트레스 조건에서 발현되는 유도성 프로모터, 목적 유전자를 식물생육 기간 중 일정 시기에 발현되도록 하는 프로모터, 식물조직의 특이 부분에만 발현하게 하는 프로모터 및 목적유전자의 발현을 높이기 위해 '인핸서 서열(enhancer sequences)'이 결합된 하이브리드(hybrid) 프로모터 등이 포함된다.
상기 과정을 통해 제조된 형질전환용 벡터 pRNAi-GBSSI는 국립농업과학원 농업유전자원센터 유전자 수탁 번호 KACC95106P로 2010년 12월 16일에 기탁되었다.
또한, 본 발명은 상기 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 식물 형질전환용 벡터를 이용하여 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 형질전환시키면 아밀로스 함량이 조절된 형질전환 식물체를 제조할 때 매개체로 사용될 수 있는 형질전환 미생물을 수득할 수 있다. 상기 아그로박테리움은 병원성이 제거된(disarmed)된 Ti 또는 Ri 플라스미드를 가지고 있는 것으로 옥토핀형(octopine-type) 계통인 LBA4404나 숙신아모핀형 (succinamopine-type) 계통인 EHA101 또는 EHA105 등 모든 아그로박테리움 계통이 본 발명에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 식물 형질전환용 벡터 또는 상기 아그로박테리움 투머파시엔스로 형질전환된 형질전환 식물체 또는 식물 종자를 제공하는 것을 특징으로 한다.
사용 가능한 형질전환용 식물의 보다 구체적인 예로는 벼, 보리, 밀, 호밀, 기장, 조, 옥수수, 귀리 및 수수 등의 식량작물을 비롯하여 피, 바랭이, 강아지풀, 잔디, 이탈리안 라이그라스, 겨풀, 쇄출, 둑새풀, 조개풀, 넓은 잎개수염, 알방동사니, 방동사니대가리, 강피 및 좀바랭이 등의 화본과 식물을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 벼를 사용한다.
식물 형질전환 운반체가 도입된 아그로박테리움을 이용, 벼 체세포 캘러스와 공동 배양하여 벼 체세포에 목적 유전자를 도입한 후, 식물 호르몬을 조절하여 벼 체세포 캘러스로부터 목적 유전자를 센스와 안티센스 방향으로 동시에 발현시켜 dsRNA를 형성하는 형질전환 벼를 제조할 수 있다. 상기 목적유전자가 도입된 식물체를 효과적으로 선발하기 위한 선발인자로는 NPTⅡ(neomycin phosphotransferase), HPT(hygromycin phosphotransferase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase) 및 젠타마이신(gentamicin) 등의 항생제 내성 유전자; bar 유전자 등의 제초제 저항성 유전자; 및 GUS, GFP(green fluorescent protein) 및 LUX(luciferase) 등의 표지유전자가 사용될 수 있다.
본 발명에 의한 dsRNA를 생성하는 형질전환 식물체는 GBSSI 유전자의 발현을 억제하여 아밀로스의 함량을 낮게 조절할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 형질전환용 운반체 제작 및 아그로박테리움에의 도입
본 발명을 위해 사용된 서열번호 1의 염기서열은 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pANDA 벡터(Daisuke Miki와 Ko Shimamoto, Plant Cell Physiol. 45(4): 490-495, 2004)에 도입하였으며, 염기서열의 도입이 확인된 형질전환용 운반체는 pRNAi-GBSSI로 명명하였다.
RNAi 간섭현상 유도를 위해 옥수수 유래의 상시발현 유비퀴틴 프로모터를 사용하여 서열번호 1의 염기서열을 센스와 안티센스 방향으로 식물체내에서 강하게 발현시켜 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 형성하게 하였다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 bar(Bialaphos resistance) 유전자를 이용하였다.
제작된 형질전환용 벡터는 3계 교잡법(tri-parental mating)에 의해 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였다.
실시예 2 : dsRNAi 기작을 유도하는 형질전환 벼의 제조
1) 캘러스 유도 및 선발
공시품종은 일미벼와 흑남벼를 사용하였다. 먼저, 종자 껍질을 제거한 현미를 70% 에탄올에 5분간 세척한 다음 50% 락스 용액으로 상온에서 15분씩 2회 정도 소독한 후 멸균수로 10회 이상 세척하여 멸균하였다. 멸균된 종자는 2,4-D 2mg/L가 포함된 2N6배지에 약 15 ~ 20개(90ㅧ 20㎝ petri dish)를 배 부분이 위로 향하게 치상한 다음 27℃ 암실에서 3 ~ 4주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 유도된 캘러스 중에서 1 ~ 2㎜의 일정한 둥근 모양의 갈변화가 안된 양호한 상태의 캘러스를 선발하여 2N6 배지에서 3일간 증식시킨 다음 형질전환에 사용하였다.
2) 아그로박테리움의 배양 및 현탁액 준비
초저온냉장고(-70℃)에서 글리세롤 스탁으로 저장되어 있는 재조합 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리움을 꺼내 AB-KT배지에 조밀하게 스트리킹하여 28℃ 암조건에서 4 ~ 5일간을 배양하였다. 배양이 끝난 아그로박테리움을 페트리 접시(petri dish) 당 15 ~ 20㎖ AAM 배지를 분주한 후 멸균된 루프를 이용하여 긁어내고 팰콘 튜브(falcon tube)로 옮겨 담았다. 그 다음 아그로박테리움이 잘 현탁될 수 있도록 수초 동안 볼텍싱(vortaxing)하였으며, 최종 접종 농도는 OD650㎚에서 2.0 ~ 2.5가 되도록 하였다.
3) 아그로박테리움 접종 및 공동배양
증식된 캘러스를 빈 페트리 접시에 옮긴 후 15 ~ 20ml의 아그로박테리움 현탁액을 부어 약 20 ~ 30분간 접종하였다. 접종 후에 멸균된 여과지가 들어있는 페트리 접시에 캘러스를 옮겨 남아 있는 아그로박테리움 현탁액을 제거한 다음 공동배양배지에서 7일 동안 치상하였다.
4) 형질전환된 캘러스의 선발
공동배양 과정이 끝난 캘러스는 아그로박테리움을 제거하기 위해 세포탁심(cefotaxim) 250mg/L이 포함된 용액으로 약 10회 이상 세척하였으며, 세척이 끝난 캘러스는 멸균된 여과지가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 담아 남아 있는 용액을 완전히 제거하였다. 이 과정을 마친 캘러스는 L-포스피노트리신(L-phosphinotricine, PPT) 6mg/L가 포함된 2N6-CP 배지에 옮겨 27℃ 암조건에서 3주 동안 형질전환된 캘러스를 1차로 선발하였으며 선발된 캘러스는 동일 배지에 동일 조건으로 2주 동안 배양하는 과정으로 2차 선발하였다.
5) 형질전환된 캘러스로부터 재분화 식물체 유도
선발된 캘러스는 PPT 3mg/L, 세포탁심 250mg/L, NAA(Naphthalene Acetic Acid) 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L 및 말토오스 20g/L이 포함된 MSR-CP 배지에 치상한 다음 25℃ 명조건에서 배양하여 형질전환식물체를 유도하였다.
6) 뿌리 유도 및 순화
재분화식물체는 생장호르몬이 포함되지 않은 MS0 배지에 옮겨 뿌리를 유도하였다. 뿌리가 유도된 식물체는 1000배 하이포닉스 수용액에 약 7 ~ 10일간 침지하여 순화시켰으며 순화된 식물체는 화분에 이식하고 온실에서 관리하였다.
하기 표 1에는 상기 형질전환의 단계별 사용되는 배지 종류 및 조성을 나타내었다.
형질전환 단계 배 지 조 성
캘러스 유도
및 증식		 2N6 N6 매크로(macro), 미세 염(micro salt), N6 비타민. 카사미노산(casamino acid) 300mg/L, 프롤린 500mg/L, 수크로오스 30g/L, 글루타민 500mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
아그로박테리움
배양		 AB-KT AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 가나마이신(kanamycin) 50mg/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10mg/L, pH 7.0
아그로박테리움
현탁 및 접종		 AAM AA 매크로, 미세 염, 아미노산 스탁(stock), MS 비타민, 철 스탁(stock), 카사미노산 500mg/L, 수크로오스 68.5g/L, 글루코오스 36g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 100uM/L, pH 5.8
공동배양 1/2-2N6- AS-New 1/2-2N6 배지, 아세토시린곤 100uM/L, 글루코오스 10g/L, 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM, 질산은 5mg/L, 젤라이트 3.0g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.2
형질전환
캘러스 선발		 2N6-CP 2N6 배지, 세포탁심(cefotaxime) 250mg/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 6mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
재분화 MSR-CP MS 매크로, 미세 염, MS 비타민, 세포탁심 250mg/L, NAA 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L, 말토오스 20g/L, L-포스피노트리신 3mg/L, 젤라이트 4g/L, pH 5.8
뿌리 유도 MS0 MS 매크로 및 미세 염, MS 비타민, 수크로오스 30g/L, 젤라이트 2.5g/L, pH 5.8
실시예 3 : 형질전환 벼의 배유단면 구조
원품종인 일미벼, 흑남벼와 pRNAi-GBSSI 형질전환 계통의 현미를 횡단면으로 절단한 후, 전자현미경을 이용하여 단면 구조를 관찰하였으며, 그 단면 사진을 도 4 에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 일미벼와 흑남벼의 경우 절단면에 나타난 전분립의 쪼개짐이 뚜렷하고 다양한 모양의 크기가 다른 전분립 구조를 보였으나, pRNAi-GBSSI 형질전환 계통은 전분립의 크기가 작고 날카로운 각과 모서리가 없는 완만한 굴곡의 단면 형태를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4 : 형질전환 벼의 아밀로스 함량
상기 형질전환된 벼의 아밀로스 함량을 측정하여 도 5 에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 일미벼의 경우 원품종과 벡터대조 형질전환체의 아밀로스가 17.7 ~ 18.0%의 함량을 나타냈으나, pRNAi-GBSSI 형질전환 계통은 6.7 ~ 8.5%의 함량분포를 보였다. 또한, 흑남벼의 경우 원품종의 아밀로스 함량이 17.2% 로 나타났으나, 형질전환 계통은 5.9 ~ 9.0%로 나타나 그 함량이 더욱 다양하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 대조로 사용한 신선찰벼의 아밀로스 함량은 4.4%로 나타났다.
실시예 5 : 형질전환 벼의 아밀로펙틴 분포 특성
아밀로스 함량이 조절된 형질전환 계통을 대상으로 아밀로펙틴 미세구조의 변화정도를 알아보기 위하여 원품종과 pRNAi-GBSSI 형질전환 계통을 분석하고 그 차이를 비교하여 도 6에 나타내었다.
그 결과, pRNAi-GBSSI 형질전환 계통의 아밀로펙틴 A1(6≤ DP ≤12)과 B1(13≤ DP≤24) 사슬비율은 일미벼와 흑남벼 모두에서 원품종보다 낮았으나, B2(25≤DP≤36) 사슬비율은 약간 높은 경향을 나타내었다. 또한, B3 사슬(37≤DP≤56) 비율은 일미벼 형질전환 계통에서는 약간 높았으나, 흑남벼 형질전환 계통은 원품종과 큰 차이가 없었다.
실시예 6 : 형질전환 벼의 요오드 반응 특성
형질전환이 확인된 T1 종자를 사용하여 횡단면으로 절단한 후 0.1N I2-KI 용액에 염색하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 원품종인 일미벼와 흑남벼는 청남색 반응을 보였으나, pRNAi-GBSSI 형질전환 계통은 적갈색을 나타내어 원품종과는 다른 뚜렷한 차이를 나타내었다. 이는 GBSSI 유전자의 발현이 낮아짐에 따라 나타나는 것으로 판단된다.
농업생명공학연구원 KACC95106 20101216
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 KACC 95106P로 기탁된 벼 식물 형질전환용 벡터 pRNAi-GBSSI.
  2. 제 1 항의 벼 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens).
  3. 제 1 항의 벼 식물 형질전환용 벡터 또는 제 2 항의 아그로박테리움 투머파시엔스로 형질전환되어 아밀로스 함량이 조절된 벼 형질전환 식물체.
  4. 삭제
  5. 1) GBSSI 유전자에서 서열번호 1의 염기서열을 분리하는 단계;
    2) 상기 분리된 서열번호 1의 염기서열이 센스 및 안티센스 방향으로 삽입된 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;
    3) 상기 제조된 발현벡터를 이용하여 식물 형질전환용 아그로박테리움을 제조하는 단계; 및
    4) 상기 형질전환용 아그로박테리움을 이용하여 벼를 형질전환 하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 벼의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 형질전환 벼는 아밀로스 함량이 조절된 것을 특징으로 하는 제조방법.
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