KR102101757B1 - 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 애기장대 유래의 sphk1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 애기장대 유래의 SPHK1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 SPHK1 유전자는 원형질연락사의 채널 개폐 조절이 가능하여 식물 생장과 굴성을 조절할 수 있으므로, 농업분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 애기장대 유래의 SPHK1 유전자 및 이의 용도{SPHK1 gene from Arabidopsis thaliana for controlling callose deposition at plasmodesmata and plant growth and uses thereof}

본 발명은 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 애기장대 유래의 SPHK1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물체에서 원형질연락사(plasmodesmata)는 이웃한 세포를 연결하는 심플라즈믹(symplasmic) 나노채널로 이루어져 있고, 짧은 거리의 분자 이동을 위한 경로를 제공한다. 상기 나노채널들은 식물세포의 세포벽에서 대사물질, 호르몬, 단백질 및 RNA 분자를 포함하는 신호 전달 물질의 세포 내 이동 또는 전달을 허용함으로써, 세포간 커뮤니케이션에서 중요한 역할을 한다.

원형질연락사는 그들의 구조 및 구성요소를 다이나믹하게 조절하여 식물체의 요구에 부응한다. 칼로스(callose, β-1,3-글루칸)는 원형질연락사의 투과성(permeability) 조절에 중요한 인자 중 하나로, 원형질연락사의 목(neck) 부위에 축적되어 원형질연락사 채널을 수축시킨다. 인접한 세포간의 생체분자의 이동은 정상 식물체의 발달 동안에 원형질연락사에서 칼로스 축적의 조절에 의해, 또는 병원균의 감염, 상처 및 산화 또는 저온 스트레스와 같은 다른 종류의 환경 스트레스에 의해 조절된다. 애기장대에서 칼로스의 합성 또는 분해와 연관된 많은 유전자들 뿐만 아니라, 원형질연락사에 위치하는 칼로스 결합 단백질이 원형질연락사의 투과성의 중요한 조절자로서 확인되었다. 이전의 연구를 통해 GSL8(Glucan Synthase-like 8) 및 CalS8(GSL4) 단백질이 원형질연락사의 칼로스 합성 및 원형질연락사의 투과성 조절에 핵심 효소로 작용함이 보고되었다. GSL8이 결손된 애기장대 식물체는 원형질연락사에 칼로스 축적이 감소되어 과도한 투과성이 야기되고, 굴성 반응 동안에 옥신 구배(gradient) 형성이 파괴되어 배축(hypocotyl)의 굴성 반응이 불가능하였다(Han, X. et al., 2014, Developmental cell 28:132-146).

한편, 한국등록특허 제1568911호에는 '칼로스 합성 조절을 통한 식물 생장 및 굴성의 조절방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0025909호에는 '스핑고신 1-인산 또는 Sphk2의 발현을 상승시키는 물질을 포함하는 대사 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 애기장대 유래의 SPHK1 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 식물체 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 유전자의 과발현 식물체 및 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체를 분석한 결과, SPHK1 유전자가 원형질연락사에서 칼로스 축적을 증가시킴으로써 원형질연락사의 투과성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었고, SPHK1 유전자의 과발현 식물체가 야생형에 비해 생장이 증진된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 원형질연락사의 칼로스 축적 및 식물 생장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 원형질연락사의 칼로스 축적 및 식물 생장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 SPHK1 단백질의 발현 조절을 통해 원형질연락사의 칼로스 수준을 조절하여 원형질연락사의 채널 개폐 조절이 가능함으로써 식물의 생장속도 조절을 통해 수확시기를 조절할 수 있고 굴성을 조절하여 표현형 조절이 가능하므로, SPHK1 단백질의 발현 수준을 조절하여 관상식물의 광이용 형태 디자인 또는 작물의 생산성 조절 등에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

도 1은 RT-PCR을 통해 야생형(WT) 및 T-DNA 돌연변이 식물체(sphk1-1 및 sphk1-2)에서 SPHK1 전사체의 발현 정도(A)를 확인한 결과와, HPTS 로딩 어세이를 통해 야생형과 돌연변이 식물체에서 원형질연락사의 투과성(B 및 C)을 분석한 결과이다. 스케일 바; 100 ㎛.
도 2는 야생형, 돌연변이 식물체(sphk1-2), 과발현 식물체(SPHK1-OE) 및 sphk1-2/SPHK1 상보성 계통(complementation line)에서 원형질연락사의 칼로스 축적을 확인한 결과이다. 스케일 바; 100 ㎛.
도 3은 단일 조건에서 7주간 성장시킨 야생형(Col-0)과 SPHK1 유전자의 과발현 식물체(Col-0/pSPHK1::SPHK1, Col-0/p35S::SPHK1:HA, Col-0/p35S::SPHK1:GFP)의 생장 모습이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "원형질연락사(plasmodesmata)"는 식물의 세포벽을 관통하여 인접 세포를 서로 연결하는 통로이다. 식물 세포는 세포벽으로 둘러싸여 있기 때문에 인접 세포가 서로 단절되어 있는 것처럼 보이지만 인접 세포는 이 원형질연락사를 이용하여 세포 사이의 물질의 이동 및 정보 교류를 한다. 칼로스(callose, β-1,3-글루칸)는 원형질연락사의 투과성(permeability) 조절에 중요한 인자 중 하나로, 원형질연락사의 목(neck) 부위에 축적되어 원형질연락사 채널을 수축시키는 역할을 한다.

본 발명의 용어 "칼로스(callose)"는 식물 꽃가루 생성 및 발달, 체관 및 물관세포 형성 동안 다양한 기능을 수행하는 다당류로, 식물발달뿐 아니라 신호전달(원형질연락사), 세포질분열(cytokinesis) 시 세포판 형성, 각종 스트레스 대응(고온, 병해충, 상처 등)에서 중요한 기능을 수행하는 베타-1,3-글루칸(beta-1,3-glucan)이다.

본 발명에 따른 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 방법에 있어서, 상기 SPHK1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 원형질연락사의 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 방법은, 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 증가시키는 것일 수 있거나, 또는 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

원형질연락사의 칼로스 축적이 증가되면 원형질연락사의 투과성(permeability)이 감소되고, 칼로스 축적이 감소되면 원형질연락사의 투과성이 증가된다. 원형질연락사의 투과성은 옥신 농도구배 형성과 밀접한 관련이 있고, 옥신의 농도구배는 식물체의 굴성(tropism) 반응과 밀접한 관련이 있으므로, 본 발명의 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하면 식물체의 굴성 반응 또한 조절할 수 있다. 상기 식물체의 굴성 반응 조절은 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 원형질연락사에서 칼로스의 축적을 증가시켜 원형질연락사의 투과성 감소 및 옥신의 심플라스믹(symplasmic) 확산 억제가 일어나 옥신의 농도구배가 형성되어 식물체의 굴성을 향상시키는 것일 수 있고, 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시켜 원형질연락사에서 칼로스의 축적을 감소시켜 원형질연락사의 투과성을 증가시키고 이로인해 옥신의 농도구배가 형성되지 않아 식물체의 굴성을 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "굴성(tropism)"이란, 식물의 기관이 환경 특히, 중력 또는 광 자극에 반응해서 자극 방향으로, 혹은 반대 방향으로 굽는 운동을 의미한다. 본 발명에 따른 상기 굴성은 구체적으로 굴중성(gravitropism) 또는 굴광성(phototropism)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(nopaline synthase), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418(Geneticin), 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA(aminoglycoside-3'-adenyl transferase) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법(bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

애기장대 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 원형질연락사의 칼로스 축적 및 식물 생장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 애기장대 유래 SPHK1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하며, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.

또한, 본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 것과 같다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 원형질연락사의 칼로스 축적 및 식물 생장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환 식물체는 SPHK1 단백질 코딩 유전자의 발현을 증가시킨 경우에는 원형질연락사의 칼로스 축적 증진 및 식물 생장이 향상된 것을 특징으로 하며, SPHK1 단백질 코딩 유전자의 발현을 감소시킨 경우에는 원형질연락사의 칼로스 축적 억제 및 식물 생장의 감소를 특징으로 한다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환함으로써 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 애기장대 유리 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 SPHK1 유전자를 과발현하도록 엔코딩된 벡터라면 SPHK1 단백질의 과발현에 의해 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장이 증가될 수 있고, 상기 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 SPHK1 유전자의 발현을 저해하는 벡터라면 SPHK1 단백질의 발현 감소에 의해 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장이 감소될 수 있다.

용어 '유전자의 과발현' 및 '유전자 발현 저해/감소'는 각각 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상 및 이하로 SPHK1 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 생장 조건

야생형 애기장대(Col-0), SPHK1 유전자의 과발현 및 기능상실 돌연변이 식물체를 포함하는 모든 식물체는 16시간 명(22℃)/8시간 암(20℃) 주기 조건의 생장챔버에서 생장시켰다. 두 개의 독립적인 T-DNA 삽입 sphk1 돌연변이체(Salk_042034; sphk1 -1 및 Sail_794_B01; sphk1 -2)는 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center, https://abrc.osu.edu)로부터 구입하였다. T-DNA 삽입의 확인은 T-DNA LB(left border) 프라이머(LBb1.3) 및 SPHK1 특이적 프라이머 세트(각각 SPHK1.1LP/SPHK1.1RP 및 SPHK1.2LP/SPHK1.2RP)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 확인하였다.

사용된 프라이머 정보

프라이머명	염기서열 (5'→3')
LBb1.3	ATTTTGCCGATTTCGGAAC (서열번호 3)
SPHK1.1LP	TCCCAAAAGCAATTCCTCTTAC (서열번호 4)
SPHK1.1RP	CGTCATAGCTAAGAGGAGGGG (서열번호 5)
SPHK1.2LP	TGATATGGAAACAGAGCTGCC (서열번호 6)
SPHK1.2RP	TTCCCCACATTTAGCATCATC (서열번호 7)

2. 벡터 컨스트럭트 및 형질전환

SPHK1 과발현 형질전환 식물체의 제조 또는 일시적 로컬라이제이션 분석을 위해서, 총 cDNA로부터 증폭한 PCR 산물을 pDONR207 플라스미드(Invitrogen, 미국)에 클로닝하였다. 상기 결과로 생성된 엔트리 클론을 게이트웨이 바이너리 벡터인 pMDC43 또는 pEG203로 클로닝하였다. 상기 벡터 컨스트럭트를 Col-0 또는 sphk1-2 계통의 애기장대에 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 도입하였다. 모든 PCR 유래 컨스트럭트는 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다.

3. RNA 추출 및 RT-PCR

총 RNA의 추출은 한 등(2014, Developmental cell 28:132-146)의 방법으로 추출하였다. RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 위해서, 제1가닥 cDNA는 2㎍의 총 RNA와 oligo(dT) 프라이머를 이용하여, QuantiTect Reverse Transcription 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 합성하였다. RT-PCR 분석은 유전자 특이적 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다.

4. 칼로스 염색

애기장대 배축을 칼로스 염색 버퍼(CSB)에 1시간 동안 두었다. CSB는 0.1%(w/v) 아닐린 블루(aniline blue)와 1M 글리신(pH 9.5)을 2:3의 부피비로 혼합하여 제조하였다. CSB에 담궈두었던 시료를 꺼내어 세척하고, 형광을 공초점현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다.

5. 배축 로딩 어세이

3일령의 연화된 애기장대 유묘를 배축 로딩 어세이를 위해 사용하였다. 염색약 로딩을 위해, 5㎎/㎖의 HPTS(8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)를 포함하는 각각의 한천 블럭을 잘린 배축 위에 올려 5분간 두었다. 그 후 유묘를 15분간 세척하고, 상기 형광염료의 이동을 공초점현미경으로 관찰하였다.

실시예 1. SPHK1 단백질의 원형질연락사 투과성 및 칼로스 축적에 미치는 영향 분석

SPHK1 단백질의 칼로스-의존적 원형질연락사의 투과성 조절에서의 기능을 확인하기 위해서, T-DNA 돌연변이체(이하 sphk1-1, sphk1-2) 및 과발현 식물체(이하 SPHK1-OE)를 사용하였으며, RT-PCR을 통해 SPHK1 유전자가 결핍된 T-DNA 삽입 돌연변이체를 확인하였다(도 1A).

원형질연락사의 투과성을 측정하기 위해 HPTS를 연화된 3일령 애기장대의 배축(hypocotyl)의 잘린 상단에 로딩하고 관찰하였다. 그 결과, sphk1-1 및 sphk1-2 식물체에서는 HPTS의 이동이 야생형보다 광범위하게 이루어진 것으로 관찰되었고, 이를 통해 sphk1-1 및 sphk1-2 돌연변이체에서 원형질연락사의 투과성이 증진되었음을 유추할 수 있었다(도 1B 및 1C).

상기 원형질연락사의 투과성 조절이 칼로스 수준의 변화에 의한 것인지 확인하기 위해 애기장대 배축에 대해서 칼로스 염색을 수행하였다. 그 결과, 야생형에 비해 돌연변이체(sphk1-1 및 sphk1-2)에서는 원형질연락사의 칼로스 수준이 감소하였지만, SPHK1-OE에서는 야생형에 비해 칼로스 수준이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다(도 2A 및 2B). 상기 결과는 돌연변이체에서 원형질연락사의 투과성 증진이 칼로스 축적의 감소로 인한 것임을 확인할 수 있었다. 또한, 돌연변이체의 칼로스 축적 감소가 SPHK1 유전자의 기능상실에 의한 것인지 확인하기 위해 sphk1-2/SPHK1 상보성 계통(complementation line)의 칼로스 수준을 분석한 결과, 돌연변이체에 비해 sphk1-2/SPHK1 상보성 계통에서 칼로스 축적이 다시 증가되었음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 돌연변이체의 칼로스 축적 감소는 SPHK1 유전자의 기능 상실에 의한 것임을 확인할 수 있었다(도 2A 및 2B). 따라서, SPHK1 단백질이 원형질연락사의 칼로스 축적에 양성 조절자로 기능하고, 원형질역락사의 투과성에 음성 조절자인 것을 알 수 있었다.

실시예 2. SPHK1의 식물 발달 조절

SPHK1 유전자의 과발현이 식물체 발달에 미치는 영향을 분석하였다. 야생형 및 과발현 식물체를 단일조건(8시간 명/16시간 암), 22℃에서 7주간 성장시킨 후 각 식물체의 생장을 분석하였다. 그 결과, 과발현 식물체(Col-0/pSPHK1::SPHK1, Col-0/p35S::SPHK1:HA, Col-0/p35S::SPHK1:GFP)는 야생형(Col-0)에 비해 식물체의 길이(초장)가 현저하게 증가된 것으로 관찰되었다(도 3). 상기 결과를 통해, SHPK1 단백질이 식물체의 성장을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> SPHK1 gene from Arabidopsis thaliana for controlling callose deposition at plasmodesmata and plant growth and uses thereof <130> PN18217 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1458 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggatcgtc agccggagag ggagaatgat gaactaccat ctccggcgat aatttccgac 60 cgagttctgg taaatggtgt tgtcacgccg ttaacgttga ccgccgaggg agagctacga 120 tcgacggaat ctggacggcg gaaatcgacg ttggcaaaag aaatcctgag tttcgtcgtg 180 gaaggtaaca aggttagagt aaagaccttg gttgagaaag gaggaggaat ttgctgtaga 240 ggaagtgctg gagattatgc gaggaacgat ttcgttttcg agcctctctc tgatgaatct 300 agaaagcttt ggtccgataa gttccatcaa cacctcgtct ctctcggtcg gccaaagaaa 360 ttgcttgtgt ttgtgaatcc gtttggcggg aagaaaacag cgagaaagat atttcaagag 420 gaagtaaagc cattgtttga agatgcaaat attcaacttg agattcaaga aaccaagtat 480 cagttgcatg caaaggaaat tgttaggtcc atggatgtat caaaatacga tggtattgtt 540 tgtgttagcg gtgacggtat ccttgttgag gttgtaaatg gactgcttga aagagaagac 600 tggaagactg ccataaaatt gccgatcgga atggtccctg caggaagtgg taatggcatg 660 attaaatcat tgttggaacc ggtagggctt ccttgtagtg caacaagtgc tactatttcg 720 ataatccgag gtcgtacacg ttctctagat gtagcaacta tctcacaagg gactaccaaa 780 ttcttcagtg tcttgatgct tgcttggggt ttagtggctg atatagacat cgagtcagag 840 aaattcagat ggatgggtag tgctcgcttt gatatctatg gtcttcagag gataatatgc 900 ttaagacaat accatggacg aattctattt gtgccagctc ctgggttcga aagctatggg 960 caacgagcca gttgcagtat agataaagag ccatctggta gtgataagac actcgtatac 1020 caaggacctg atagtaaact tgaaaatctg gattggagag aaatgaaagg cccatttgtt 1080 tcagtatggc ttcataatgt tccctggggt gctgagaaca ctttggctgc tcctgacgct 1140 aagttttctg atggcttcct ggatttgatt gtcatgaaag actgtcctaa actagccttg 1200 ctatcactta tgacaaagtt gagtgatgga acccatgtcc aatcaccata tgcatcatat 1260 ctgaaggtga aggcattcgt actggagcca ggtgcacgca tagacgaacc agacaaggaa 1320 ggaatcatag attcagatgg agaagttttg gcaagaggaa gaaaatcgta caaatgtgat 1380 caaaaggctt tgatgtctta cgacaagctt caaataagtg ttgatcaagg tttagccact 1440 ctcttctctc ctgaataa 1458 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Asp Arg Gln Pro Glu Arg Glu Asn Asp Glu Leu Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ile Ile Ser Asp Arg Val Leu Val Asn Gly Val Val Thr Pro Leu Thr 20 25 30 Leu Thr Ala Glu Gly Glu Leu Arg Ser Thr Glu Ser Gly Arg Arg Lys 35 40 45 Ser Thr Leu Ala Lys Glu Ile Leu Ser Phe Val Val Glu Gly Asn Lys 50 55 60 Val Arg Val Lys Thr Leu Val Glu Lys Gly Gly Gly Ile Cys Cys Arg 65 70 75 80 Gly Ser Ala Gly Asp Tyr Ala Arg Asn Asp Phe Val Phe Glu Pro Leu 85 90 95 Ser Asp Glu Ser Arg Lys Leu Trp Ser Asp Lys Phe His Gln His Leu 100 105 110 Val Ser Leu Gly Arg Pro Lys Lys Leu Leu Val Phe Val Asn Pro Phe 115 120 125 Gly Gly Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ile Phe Gln Glu Glu Val Lys Pro 130 135 140 Leu Phe Glu Asp Ala Asn Ile Gln Leu Glu Ile Gln Glu Thr Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu His Ala Lys Glu Ile Val Arg Ser Met Asp Val Ser Lys Tyr 165 170 175 Asp Gly Ile Val Cys Val Ser Gly Asp Gly Ile Leu Val Glu Val Val 180 185 190 Asn Gly Leu Leu Glu Arg Glu Asp Trp Lys Thr Ala Ile Lys Leu Pro 195 200 205 Ile Gly Met Val Pro Ala Gly Ser Gly Asn Gly Met Ile Lys Ser Leu 210 215 220 Leu Glu Pro Val Gly Leu Pro Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Ile Ser 225 230 235 240 Ile Ile Arg Gly Arg Thr Arg Ser Leu Asp Val Ala Thr Ile Ser Gln 245 250 255 Gly Thr Thr Lys Phe Phe Ser Val Leu Met Leu Ala Trp Gly Leu Val 260 265 270 Ala Asp Ile Asp Ile Glu Ser Glu Lys Phe Arg Trp Met Gly Ser Ala 275 280 285 Arg Phe Asp Ile Tyr Gly Leu Gln Arg Ile Ile Cys Leu Arg Gln Tyr 290 295 300 His Gly Arg Ile Leu Phe Val Pro Ala Pro Gly Phe Glu Ser Tyr Gly 305 310 315 320 Gln Arg Ala Ser Cys Ser Ile Asp Lys Glu Pro Ser Gly Ser Asp Lys 325 330 335 Thr Leu Val Tyr Gln Gly Pro Asp Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asp Trp 340 345 350 Arg Glu Met Lys Gly Pro Phe Val Ser Val Trp Leu His Asn Val Pro 355 360 365 Trp Gly Ala Glu Asn Thr Leu Ala Ala Pro Asp Ala Lys Phe Ser Asp 370 375 380 Gly Phe Leu Asp Leu Ile Val Met Lys Asp Cys Pro Lys Leu Ala Leu 385 390 395 400 Leu Ser Leu Met Thr Lys Leu Ser Asp Gly Thr His Val Gln Ser Pro 405 410 415 Tyr Ala Ser Tyr Leu Lys Val Lys Ala Phe Val Leu Glu Pro Gly Ala 420 425 430 Arg Ile Asp Glu Pro Asp Lys Glu Gly Ile Ile Asp Ser Asp Gly Glu 435 440 445 Val Leu Ala Arg Gly Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Asp Gln Lys Ala Leu 450 455 460 Met Ser Tyr Asp Lys Leu Gln Ile Ser Val Asp Gln Gly Leu Ala Thr 465 470 475 480 Leu Phe Ser Pro Glu 485 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 attttgccga tttcggaac 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcccaaaagc aattcctctt ac 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgtcatagct aagaggaggg g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgatatggaa acagagctgc c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttccccacat ttagcatcat c 21

Claims (9)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 조절하는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 원형질연락사의 칼로스 축적 및 식물 생장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 삭제
7. 제5항의 방법에 의해 제조된 원형질연락사의 칼로스 축적 및 식물 생장이 조절된 형질전환 식물체.
8. 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SPHK1(Sphingosine kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 원형질연락사 칼로스 축적 및 식물 생장 조절용 조성물.

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